Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài Nghiên cứu ứng dụng nano graphene oxide phá[.]
BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng nano graphene oxide phát triển phương pháp xác định ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase Mã số đề tài: 20/1.5CNH02 Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Đình Vũ Đơn vị thực hiện: Khoa Cơng nghệ Hóa học LỜI CẢM ƠN Đề tài thực Phịng thí nghiệm Phân tích Hóa lý đại, Khoa cơng nghệ Hóa học, Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Nhóm tác giả trân trọng cảm ơn lãnh đạo, nhân viên phịng thí nghiệm-Khoa Cơng nghệ Hóa học tạo điều kiện, hỗ trợ sơ vật chất, thiết bị thí nghiệm để chúng tơi hồn thành mục tiêu mà đề tài đặt Đặc biệt, nhóm tác giả trân trọng cảm ơn hỗ trợ mặt tài Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh để chúng tơi hồn thành tốt nhiệm vụ nghiên cứu MỤC LỤC PHẦN I THÔNG TIN CHUNG I Thông tin tổng quát II Kết nghiên cứu 1 Đặt vấn đề Mục tiêu 3 Phương pháp nghiên cứu Tổng kết kết nghiên cứu Đánh giá kết đạt kết luận Tóm tắt kết III Sản phẩm đề tài, công bố kết đào tạo 3.1 Kết nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3) 3.2 Kết đào tạo IV Tình hình sử dụng kinh phí V Kiến nghị VI Phụ lục PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Giới thiệu Thực nghiệm 10 2.1 Hóa chất 10 2.2 Tổng hợp kiểm tra tính chất GO 11 Độ đặc hiệu phương pháp 12 3.1 Phân tích điên di gel chứng minh hoạt tính ezymes 13 3.2 Tính đặc hiệu phương pháp phân tích huỳnh quang 15 Tối ưu hóa điều kiện phương pháp phân tích hoạt chất MGMT 16 4.1 Nồng độ tối ưu GO 16 4.2 Thời gian tối ưu phản ứng enzyme 18 Thông số đặc trưng phương pháp 19 Kết luận 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 DANH MỤC HÌNH Hình Ứng dụng hiệu ứng tắt quang GO để phân tích enzym ExoIII Hình Cơ chế phản ứng loại bỏ nhóm methyl vị trí O6-guanine Hình Mơ nguyên lý phương pháp 10 Hình Ảnh TEM nanosheet GO 12 Hình Ảnh AFM GO mica 13 Hình Phổ FT-IR GO 13 Hình Hình ảnh phân tích Gel electrophoresis 14 Hình Phổ huỳnh quang dãi bước sóng 505 nm tới 600 nm 15 Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang đáp ứng 519nm vào nồng độ GO 17 Hình 10 Đường tắt huỳnh quang Stern−Volmer 18 Hình 11 Tối ưu hóa thời gian phản ứng MGMT phương pháp 18 Hình 12 Phổ huỳnh quang đáp ứng mức nồng độ khác MGMT 20 Hình 13 Cường độ huỳnh quang 519 nm phản ứng thực huyết 20 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MGMT: O6-methylguanine-DNA methyltransferase O6MeG: O6-methylguanine GO: Graphene oxide MSP: Methylation-specific polymerase chain reaction MS-HRM: Methylation-sensitive high-resolution melting ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay MS: Mass spectroscopy TEM: Transmission electron microscopy AFM: Atomic force microscopy IR: Infrared spectroscopy LOD: Limit of detection LOQ: Limit of quantitation PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng nano graphene oxide phát triển phương pháp xác định ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase 1.2 Mã số: 20/1.5CNH02 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài Họ tên Đơn vị cơng tác TT Vai trị thực đề tài (học hàm, học vị) TS Lê Đình Vũ Khoa Cơng nghệ Hóa học Chủ nhiệm đề tài CH Nguyễn Văn Hiệp Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành viên TP.HCM ThS Trương Văn Nhân Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành viên TP.HCM 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2020 đến tháng năm 2021 1.5.2 Gia hạn (nếu có): Khơng 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2020 đến tháng năm 2020 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): khơng có (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 50 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề: Hiện nay, vật liệu nano nói chung vật liệu nano graphene oxit (GO) nói riêng Hóa phân tích ứng dụng phát triển mạnh mẽ với mục tiêu tạo phương pháp định tính định lượng đơn giản, nhanh chóng có độ xác cao Vật liệu nano dựa graphene thể ứng dụng rộng rãi công nghệ nano, khoa học vật liệu, khoa học phân tích kỹ thuật y sinh tính chất học, nhiệt, điện, quang đặc tínhxúc tác tuyệt vời chúng Khả tương thích sinh học cao graphene tiềm việc xây dựng cảm biến sinh học dựa graphene Tập trung vào đặc điểm này, hầu hết cơng trình dựa vào việc sử dụng graphene oxit, bao gồm nhóm chức phản ứng ưa nước phong phú, với khả hòa tan cao linh hoạt để liên hợp hóa trị phân tử sinh học Ngoài ra, graphene oxit tan nước có cấu trúc mặt phẳng vịng thơm cho phép tương tác xếp chồng mạnh mẽ làm tắt huỳnh quang nhóm phát quang, tạo thành tảng hữu ích cho phát triển cảm biến sinh học dựa hiệu ứng Những cải tiến đáng kể thực nhiều ứng dụng sinh học, đáng ý ứng dụng để phát triển phương pháp phân tích DNA , phân tích hoạt tính enzym, dược phẩm , nhiên, việc sử dụng GO để xác định hoạt tính ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) sở tắt huỳnh quang GO chưa có cơng trình công bố O6-methylguanine-DNA methyltransferase enzym sửa lỗi ADN quan trọng nhất, có liên quan đến việc sửa chữa tổn thương alkyl cách trực tiếp loại bỏ nhóm alkyl khỏi O6-guanine DNA Việc xác định hoạt tính MGMT bước thiết yếu việc nghiên cứu chế chết tế bào O6MeG gây ra, biến sai nhiễm sắc thể, đột biến ung thư Để xác định lượng MGMT, phương pháp phóng xạ đóng vai trị quan trọng cách sử dụng alkyl có chứa đồng vị 3H DNA làm chất Ngồi cịn có phương pháp định lượng khác như: MSP, MS-HRM, ELISA, khối phổ (MS) huỳnh quang phát triển ứng dụng cho nghiên cứu hoạt tính MGMT Trong đề tài này, xây dựng kế hoạch nghiên cứu, phát triển phương pháp dựa đặc tính tắt quang nano graphene oxit để phân tích hàm lượng enzym O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) với tính đặc hiệu cao Kết hợp tính chất chuyển lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) từ nhóm phát quang 6-carboxyfluorescein-FAM (donor) tới nhóm nhận quang GO (acceptor), đặc tính hấp thụ mạnh chuỗi đơn oligonucleotide bề mặt GO sheet kỹ thuật kích hoạt hoạt tính enzym phân cắt đặc hiệu ADN, thiết kế chất AND cho hoạt tính MGMT Từ phát triển phương pháp đơn giản hiệu cho phân tích hoạt tính MGMT Kỹ thuật phân tích triển khai hệ đồng thể, ưa nước cần thiết bị đo quang phổ huỳnh quang đơn giản, nhanh chóng dễ thực có độ nhạy độ chọn lọc cao Mục tiêu Nghiên cứu ứng dụng thành công nano graphene oxide để phát triển phương pháp xác định ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase Đăng tải kết nghiên cứu tạp chí khoa học uy tín (ISI) Phương pháp nghiên cứu 3.1 Tổng hợp thành công graphene oxit nano graphene oxit Các đặc tính GO xác định qua hình ành TEM, AFM Các liên kết nhóm carbonyl bề mặt graphene xác định phép đo phổ IR 3.2 Chứng minh tính đặc hiệu phương pháp xác định tín hiệu quang phổ huỳnh quang điện di gel Phản ứng enzym chứng minh phép phân tích điện di Tín hiệu phân tích cảm biến sinh học chứng minh qua phép đo phổ huỳnh quang 3.3 Xác định điều kiện tối ưu phương pháp: Nồng độ tối ưu GO xác định thông qua khà tắt quang lượng DNA chất, thời gian phản ứng enzym khảo sát 3.4 Xác định thông số đặc trưng phương pháp Các thông số như: khoảng đáp ứng nồng độ, đường hiệu chuẩn, LOD, LOQ phương pháp định lượng MGMT, độ lặp, độ chọn lọc phương pháp thơng qua thí nghiệm khảo sát chất với môi trường chuẩn môi trường giả định (huyết tương) Tổng kết kết nghiên cứu - Kết nghiên cứu đăng tải tạp chí Microchimica Acta xếp ISI (IF = 6.2, Q1 lĩnh vực Hóa phân tích) Đánh giá kết đạt kết luận - Kết đáp ứng mục tiêu đặt Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Trong nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích huỳnh quang để định lượng enzym O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) đặc hiệu sửa lỗi methyl hóa DNA vị trí O6 guanine Ngun lý phương pháp dựa kích hoạt enzym thủy phân đặc hiệu PvuII vị trí 5’-CAG⁞CTG-3’ DNA tính chất hấp thu mạnh chất DNA đính nhóm phát quang bề mặt graphene oxide nanosheet Hoạt tính ezyme MGMT loại bỏ nhóm methyl O6-methylguanine chất DNA giải phóng vị trí phản ứng thủy phân chọn lọc DNA ezyme endonuclease PvuII Phản ứng thủy phân phân cắt giải phóng nhóm huỳnh quang, GO khơng hấp thụ nhóm huỳnh quang nên tin hiệu huỳnh quang khuếch đại tỉ lệ trực tiếp với hoạt tính enzym MGMT Vơi điều kiện tối ưu phương pháp, bước sóng kích thích 494 nm phép đo ánh sáng phát xạ 519 nm, hoạt tính MGMT xác định khoảng từ 0.5-35 ng/mL, giới hạn phát 0.15 ng/mL Các giá trị chứng minh phương pháp có độ nhạy cao Thời gian phân tích vịng tiến vượt trội so với nhiều phương pháp khác Bằng việc thay đổi cấu tạo chất cho phù hợp với ezyme khác, nguyên lý phương pháp ứng dụng để phát triển phương pháp khác kỹ thuật tắt huỳnh quang GO DNA gắn huỳnh quang Tổng hợp lại, đề tài cung cấp công cụ hữu ích cho nghiên cứu chuẩn đốn phát triển thuốc We have developed a fluorescence method for the determination of the activity of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) It is based on the activation of restriction endonuclease PvuII and the adsorbing a fluorophorelabelled DNA onto the surface of graphene oxide (GO) MGMT activity removes the methyl group from O6-methylguanine (O6MeG) in the fluorophore-labelled DNA to unblock the specific recognition site for further hydrolysis reaction of restriction endonuclease PvuII The endonuclease catalytic reaction releases fluorophores (5-carboxyfluorescein) from fluorophore-labelled DNA, which can avoid fluorescence quenching by GO, creating an abundance of the fluorescence signal The fluorescence increases in the assay is thus directly dependent on the MGMT activity Under the optimal conditions with the emission wavelength of 519 nm (exitation at 494 nm), the activity of the MGMT can be determined in the range 0,5 to 35 ng/mL with a detection limit of 0’15 ng/mL This is extremely sensitive for the determination of MGMT The short time of analysis (2 h) is superior to many reported strategies The method can also be extended for the rapid and sensitive activity assay of another DNA repair enzyms by designing a proper substrate DNA Conceivably, the technique represents a powerful tool for diagnosis and drug exploitation phần mềm bioinformatics software (http://bioin-fo.rpi.edu/application/) Cấu tạo DNA trình bày bảng Bảng Cấu trúc chuỗi DNA sử dụng nghiên cứu Sequence 5’-GGAATTGTAATGTAGTATAATAATCAGCAXCTGAAAG3’ (X = O6-me-dG, O6-methylguanine) Probe 5’-CTTTCAGCTGCT- (FAM)-3’ Sequence 5’-GGAATTGTAATGTAGTATAATAATCAGCAGCTGAAAG-3’ Sequence có cấu tạo gồm 37 nucleotides với nhóm methyl O6MeG vị trí phản ứng enzym PvuII Chuỗi Probe gồm 12 nucleotides có đính nhóm huỳnh quang fluorophore 5-carboxyfluorescein (FAM) đầu 3’ Sequence có cấu tạo giống Sequence khơng bị methyl hóa Phần chữ nghiêng Sequence Sequence bổ trợ ghép đôi với Probe Phần ghạch chân tô đỏ vị trí phản ứng cũa enzym thủy phân chọn lọc DNA PvuII Cơ chất cho phản ứng MGMT kết hợp Sequence với Probe chất cho thí nghiệm kiểm sốt khơng bị methyl hóa DNA kết hợp từ Sequence với Probe 2.2 Tổng hợp kiểm tra tính chất GO GO tổng hợp theo phương pháp công bố trước [29, 30] Dung dịch huyền phù GO nước có nồng độ ⁓1 mg⋅mL-1 pha cách đánh siêu âm GO dạng film nước siêu với đầu đánh siêu âm cường độ cao công suất 40W 1h (làm lạnh nước đá) Huyền phù sau siêu âm li tâm tốc độ 10,000 phút 10 phút, phần dung dịch gạn phía pha lỗng tới nồng độ khoảng 0.2 mg⋅mL-1, dung dịch ổn định có màu nâu tối Bảo quản dung dịch 40C sử dụng vịng tháng Để kiểm tra tính chất GO dung dịch huyền phù, cấu trúc hạt huyền phù GO chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cách nhỏ giọt dung dịch huyền phù khay lưới đo mẫu (400 mesh), để bay khô mẫu không khí nhiệt độ phịng Ảnh TEM nanosheet GO thực máy phân giải cao 2100 F TEM (JeoL, Nhật Bản) với điện áp 200 kV Phép đo AFM thực làm khô huyền phù GO mica điều kiện khơng khí nhiệt độ phòng Tấm mica tráng nước siêu tinh khiết làm khơ lại nitơ Hình ảnh AFM GO chụp kính hiển vi Veeco 11 Dimension V (Veeco Cụ Inc., Hoa Kỳ) Phổ FT-IR thu máy quang phổ Nexus 870 FT-IR (Thermo Electron, USA) Mẫu tẩm nén viên KBr quét phạm vi 1000-4000 cm-1 Hình Ảnh TEM nanosheet GO 12 Hình Ảnh AFM GO mica Hình Phổ FT-IR GO Ảnh TEM cho thấy cấu trúc GO nhăn dạng giấy siêu mỏng (Hình 1) Sự hình thành GO lớp có độ dày 1,4-2,2 nm xác nhận hình ảnh AFM chiều dày GO (Hình 2) Phổ FT-IR cho thấy số đỉnh đặc trưng bao gồm đỉnh 1710 3420 cm-1 tương ứng với tần số kéo dài C = O O-H nhóm -COOH chứng minh bề mặt graphene có đính nhóm chức COOH (Hình 6) Nói chung, liệu cho thấy việc điều chế thành cơng graphene oxide để sử dụng cho thí nghiệm phát triển phương pháp Độ đặc hiệu phương pháp 13 3.1 Phân tích điên di gel chứng minh hoạt tính ezymes Phân tích điện di gel chứng minh phản ứng xúc tác MGMT xảy vị trí O6-guanine chất methylated DNA kích hoạt phản ứng endonuclease Mẫu chuẩn bị cách thêm 1µL DNA 10µM vào 19µL dung dịch đệm (BSA 0,01% (w/v), 1x NEbuffer3) bao gồm PvuII (200 unit⋅mL-1) MGMT (1µg⋅mL-1) Ba thí nghiệm đối chứng chuẩn bị với chất Methylated DNA, Methylated DNA MGMT DNA khơng bị methyl hóa với có mặt PvuII Mỗi mẫu ủ 370C 90 phút Các dung dịch hỗn hợp thu phân tích cách chạy điện di gel (4% (w/w) agarose, 1% ethidium bromide) điện áp 140 v 50 phút Gel hiển thị hệ thống chụp ảnh huỳnh quang ChemiDoc ™ XRS + (Bio-Rad, USA) Kết thể hình bp 300 200 150 100 75 50 35 25 15 20 10 Hình Hình ảnh phân tích Gel electrophoresis: Hàng 6, DNA size marker; hàng 2, methylated DNA; Hàng 3, methylated DNA, + PvuII; Hàng 4, methylated DNA, + MGMT, + PvuII; hàng 5, non-methylated DNA, + PvuII Mỗi hỗn hợp ủ 370C 90 phút Nồng độ methylated DNA, non-methylated DNA, PvuII, MGMT tương ứng 500 nM, 500 nM, 190 U⋅mL-1, 0,95 µg⋅mL1 Phân tích điện di gel thực để xác nhận nguyên lý phương pháp Enzym PvuII kích hoạt cho phản ứng thủy phân Methylated DNA thành mảnh nhỏ sau MGMT loại bỏ nhóm methyl vị trí nhận 14 biết PvuII Như hiển thị Hình 4, trường hợp Methylated DNA phản ứng với với PvuII, khơng có thay đổi (hàng 3) từ dải sáng so sánh với DNA nguyên vẹn (hàng 2) Điều xác nhận nhóm methyl DNA ngăn chặn phản ứng thủy phân enzym PvuII Ngược lại, chất methylated DNA ủ với PvuII với có mặt MGMT, độ sáng bị suy giảm mạnh (hàng 4), kết khác biệt với hàng (methylated DNA) hàng (methylated DNA diện PvuII) Trong thí nghiệm đối chứng, chất DNA khơng bị methyl hóa cho phản ứng với PvuII, độ sáng thu tương tự với hàng (hàng 5) Những kết phản ứng xúc tác PvuII kích hoạt sử dụng MGMT để loại bỏ nhóm methyl khỏi chất DNA bị methyl hóa Do đó, phương pháp hiển thị tảng đặc biệt cao cho phân tích hoạt tính MGMT 3.2 Tính đặc hiệu phương pháp phân tích huỳnh quang Fluorescence (a.u.) 6000 5000 a b c d e f 4000 3000 2000 1000 520 540 560 580 600 Wavelength (nm) Hình Phổ huỳnh quang dãi bước sóng 505 nm tới 600 nm cho trường hợp: (a) Cơ chất methylated DNA; (b) Cơ chất methylated DNA + GO; (c) Cơ chất methylated DNA, + MGMT, + GO; (d) Cơ chất methylated DNA, + PvuII, + GO; (e) Cơ chất methylated DNA, + MGMT, + PvuII, + GO; (f) non-methylated DNA, + PvuII, + GO Nồng độ methylated DNA, non-methylated DNA, PvuII, MGMT, GO 25 nM, 25 nM, 40 U⋅mL-1, 50 ng⋅mL-1 25 µg⋅mL-1 15 ... Độ đặc hiệu phương pháp 12 3.1 Phân tích điên di gel chứng minh hoạt tính ezymes 13 3.2 Tính đặc hiệu phương pháp phân tích huỳnh quang 15 Tối ưu hóa điều kiện phương pháp phân. .. điều kiện tối ưu phương pháp: Nồng độ tối ưu GO xác định thông qua khà tắt quang lượng DNA chất, thời gian phản ứng enzym khảo sát 3.4 Xác định thông số đặc trưng phương pháp Các thông số như:... thành công graphene oxide để sử dụng cho thí nghiệm phát triển phương pháp Độ đặc hiệu phương pháp 13 3.1 Phân tích điên di gel chứng minh hoạt tính ezymes Phân tích điện di gel chứng minh phản ứng