hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrlsu nrssu rpb1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------ BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC G

TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

Tổng quan chi nấm Cordyceps

1.1.1 Sơ lược về nấm Cordyceps

Cordyceps là chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ

Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi (Ascomycota) [28][45] Tên

Cordyceps bắt nguồn từ tiếng Latinh bao gồm hai thành phần là “cord” và “ceps” nghĩa là “chùy, dùi” và “đầu”, chúng kết hợp với nhau nhằm mô tả một tập hợp nấm có chất nền và quả thể phát triển từ xác côn trùng (Hình 1.1)[19]

Cordyceps có thành phần loài rất đa dạng Uớc tính khoảng 400 loài khác nhau như Cordyceps sinensis, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana,…phân bố ở nhiều quốc gia Châu Á, bao gồm Việt Nam [12] Chúng chủ yếu ký sinh trên côn trùng ở các giai đoạn phát triển khác nhau Ngoài ra, chi nấm này còn bao gồm một số loài ký sinh trên nấm Elaphomyces Trong đó, loài được biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis Cordyceps sinensis ký sinh trên các ấu trùng của các loài bướm đêm thuộc chi Thitadores được gọi là “Đông trùng hạ thảo” Đây là một loại dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á, chẳng hạn như Trung Hoa [19] Cordyceps sinensis có dạng nấm, quả thể mọc trên xác sâu bướm Hình dạng quả thể: không có nắp, trông như một lưỡi dao hoặc cành lá, màu nâu sẫm ở chân và màu đen ở đầu Chúng được tìm thấy ở độ cao từ 4.200m đến 6.400m trên các đồng cỏ của dãy núi cao Himalaya và các dãy núi cao khác của Trung Quốc, Tây Tạng và Nepal [19][23]

Hình 1.1: Ophiocordyceps sinensis (ở Tây Tạng, Trung Quốc) [19]

Cordyceps có cấu trúc cơ thể khá đơn giản nhưng lại có thành phần loài rất phong phú, đặc biệt hình dạng và hình thức sinh sản của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường Vào mùa đông, khi điều kiện khí hậu khắc nghiệt (nhiệt độ và độ ẩm thấp) nấm ký sinh dạng hệ sợi, hình thức sinh sản vô tính (anamorph); vào mùa hè, khi nhiệt độ và độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi để nấm hình thành quả thể, hình thức sinh sản hữu tính (teleomorph) [21] Tiêu biểu như

Cordyceps takaomontana có đặc điểm hình thái sinh sản hữu tính (teleomorph), có thể bình và quả thể nhưng khóa phân loại của Sung et al., (2007) đã đề cập tới thể vô tính (anamorph) của nấm này lại là Isaria tenuipes [45]

Với khả năng ký sinh trên côn trùng, chi nấm Cordyceps đã và đang được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học với hiệu quả cao Đặc biệt hơn, các hợp chất của một số loài thuộc chi nấm này đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong y dược [19]

Trong lĩnh vực kiểm soát sinh học, các loài nấm thuộc chi Cordyceps được sử dụng rộng rãi nhờ khả năng ký sinh trên côn trùng gây hại Trong số các loài điển hình ứng dụng trong nông nghiệp, nổi bật là Beauveria bassiana (nấm bạch cương) Loài nấm này ký sinh chủ yếu trên sâu bướm và côn trùng cánh cứng, có thể gây độc nhanh cho vật chủ trong khi an toàn với con người.

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng phòng chống các loại sâu hại hay dịch bệnh Tiêu biểu như chế phẩm nấm

Beauveria bassiana phòng trừ sâu róm hại thông và nấm Metarhizium anisopliae tiêu diệt châu chấu hại ngô, bọ cánh cứng hại dừa,… mang lại hiệu quả kinh tế cao [9]

Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh các loài nấm ký sinh côn trùng có rất nhiều tác dụng như: kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu, ung thư

SVTH: Nguyễn Hải Châu 3 phổi và ung thư vú [25][38] Một trong những loài nấm được biết đến nhiều nhất chính là Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo) Loài nấm này ký sinh trên các ấu trùng của các loài bướm đêm thuộc chi Thitadores và là một loại dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á Chúng được tìm thấy ở độ cao từ 4.200m đến 6.400m trên các đồng cỏ của dãy núi cao Himalaya và các dãy núi cao khác của Trung Quốc, Tây Tạng và Nepal [19][23] Ngoài ra, các loài nấm khác của chi nấm này cũng đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong y dược Điển hình như khả năng gây độc tế bào để chống tế bào ung thư của

Isaria tenuipes [19] Hơn nữa, các hợp chất chứa trong Cordyceps có tác dụng điều hòa miễn dịch cơ thể và ngăn ngừa bệnh Polysaccharide là một trong những hợp chất chính có trong Cordyceps Một số polysaccharide và các dẫn xuất đường khác chẳng hạn như axit cordycepic [D-mannitol] được xác định là có hoạt tính dược lý Các polysaccharide có khả năng diều tiết đường máu, chống ưng thư, chống di căn và tăng cường hệ miễn dịch [19] Ngoài ra, Cordyceps còn có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nhờ việc sản xuất các tế bào lympho, tế bào NK (natural killer cell) và cải thiện các kháng thể [36]

Bên cạnh đó, lượng polysaccharide trong Cordyceps (chiếm khoảng 3 – 8% tổng khối lượng) có khả năng điều trị bệnh tim và hỗ trợ giải độc gan[24] Bên cạnh đó,

Cordyceps có vai trò rất quan trọng trong y dược và ẩm thực của người Trung Quốc vì sinh khối của Cordyceps chứa nhiều thành phần dinh dưỡng: các acid amin, các vitamin (B 1 , B 2 , B 12 , E, K…) [19] Chúng còn chứa 28 acid béo (bão hòa và không bão hòa), các dẫn xuất đường, rất nhiều phức hợp polysaccharide, protein, sterol, nucleoside và các nguyên tố vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al,

Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V và Zr) [19]

Hình 1.2: Một số nucleoside tiêu biểu trong Cordyceps sinensis [19]

Với độ đa dạng cao về các loài nấm Cordyceps, Việt Nam có tiềm năng lớn trong việc khai thác các loài nấm ký sinh côn trùng bản địa và ứng dụng trong y dược Tuy nhiên, điều kiện tiên quyết khi sử dụng các sinh vật trong y dược chính là việc xác định chính xác phân loại học của sinh vật đến mức loài [45] Hiện nay, việc phân loại các loài nấm thuộc chi Cordyceps vẫn đang được nghiên cứu và làm rõ thông qua việc kết hợp thông tin về hình thái cũng như phân tử

1.1.3.1 Theo quan điểm hình thái Định danh hình thái được xem là tiêu chuẩn vàng để định danh các vi khuẩn, vi nấm,… nói chung và chi nấm ký sinh côn trùng nói riêng Hiện nay, việc định danh và xây dựng hệ thống học các loài nấm ký sinh côn trùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái giải phẫu: màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử,… [28] Hình thái đặc trưng của Cordyceps gồm: quả thể thuôn dài (chất nền gồm nhiều sợi nấm và sinh sản vô tính), có thể túi dạng trụ, đỉnh túi dày, các bào tử túi dạng sợi, quả thể dạng màu nâu hoặc đen, dài từ 4-11 cm, trọng lượng khoảng 0,06 g [1][45] Sâu khi còn tươi có dạng con tằm, có màu vàng đến vàng nâu, đầu màu đỏ nhạt, dài khoảng 3-5 cm [1] Năm 1982, Kobayashi dựa trên cơ sở xử lý các thông tin từ việc phân tích 282 loài trong chi Cordyceps, 59 loài trong chi Torrubiella và 75 loài thuộc các chi lân

SVTH: Nguyễn Hải Châu 5 cận khác, đã xây đựng nên khóa định danh cho nhóm Cordyceps và Torrubiella

[28] Khóa phân loại này cho đến nay vẫn dược áp dụng rộng rãi trong việc hỗ trợ định danh các loài nấm dựa vào phân tích hình thái về chi nấm Cordyceps Tiêu biểu như Sung et al., (2007) đã sắp xếp lại hệ thống chi nấm Cordyceps và họ Clavicipitaceae Theo thống kê của nhóm tác giả thông qua những đặc điểm hình thái và vật chủ ký sinh, họ Clavicipitaceae gồm các nhóm: Cordyceps, Hypocrella và Torrubiella ký sinh chủ yếu trên động vật chân đốt và các loài nấm khác; Claviceps, Balansia và Epichloe thường gặp ở các loài cỏ cộng sinh; Elaphocordyceps bao gồm tất cả các loài sống ký sinh ở Elaphomyces hay ký sinh trên nhộng ve sầu; Cordyceps s.s thường ký sinh trên lá cây, rêu hoặc các lớp đất trên cùng [45][46] Chúng có màu vàng nhạt, quả thể mềm, chất nền dày, sợi nấm được tổ chức lỏng lẻo, bào tử hình trụ Đặc biệt, Cordyceps s.s sinh sản chủ yếu bằng ba loại bào tử sau: bào tử tách rời (Cordyceps militaris), bào tử nguyên (Cordyceps cardinalis và Cordyceps pseudomilitaris) và bào tử dạng “Bola”

Các phương pháp sinh học phân tử

Năm 1985, phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh bởi Kary Mullis [10] Ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, sử dụng những thành phần cơ bản của hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên để khuếch đại vùng DNA đặc hiệu [10] Quá trình sao chép DNA với sự tham gia các thành phần: DNA polymerase, DNA mạch khuôn, mồi, dNTP, dung dịch đệm và MgCl 2 Phản ứng này được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR) với từng nhiệt độ thích hợp cho mỗi phản ứng [22]

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm ba bước chính: Biến tính (tách DNA mạch đôi thành mạch đơn ở nhiệt độ cao), bắt cặp mồi (mồi liên kết với mạch khuôn tại nhiệt độ Ta, thường thấp hơn nhiệt độ biến tính) và kéo dài (tổng hợp các đoạn mới bổ sung vào mạch khuôn nhờ enzim DNA polymerase).

Nhiệt độ nóng chảy của mồi (T m) khoảng 5 °C, phụ thuộc vào trình tự mồi, chiều dài mồi, % GC, và quá trình bắt cặp kéo dài Khi đạt nhiệt độ 72 °C, DNA polymerase hoạt động, nối dài mạch mới Quá trình khuếch đại DNA diễn ra theo cấp số nhân: sau n chu kỳ sẽ tạo ra 2 n bản sao từ DNA khuôn.

1.2.2 Điện di Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz [30] Điện di (electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kỹ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point) Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide,…) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di [30]

Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel) Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới

SVTH: Nguyễn Hải Châu 10 có kích thước lỗ lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của: (1) lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau), (2) kích thước phân tử so với kích thước lỗ gel và (3) hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được lưu giữ trong phân tử có tên là DNA Đây là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine), C (Cystosine) Các nucleotide này sắp xếp nối tiếp nhau theo một trình tự xác định và trình tự này không những đặc trưng ở từng loài mà còn khác nhau ở từng các thể trong cùng một loài [22] Giải trình tự gen là phương pháp nhằm phát hiện thứ tự sắp xếp bốn loại nucleotide: A, T, G, C trên phân tử DNA được phát minh bởi Maxam, Gilbert (1997) và Sanger et al., (1997) Phương pháp giải trình tự gen dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học Phương pháp này được thực hiện theo trình tự sau: (1) đoạn DNA cần xác định trình tự cần phải đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32 P ở đầu 5’, (2) các nucleotide trong phân tử DNA được đánh dấu sẽ được xử lý hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại những vị trí nucleotide khác nhau, bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, và C, kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1 base, (3) các đoạn này được điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy phóng xạ tự ghi Từ kết quả phóng xạ tự ghi của bốn nhóm trên có thể xác định được vị trí của bốn loại nucleotide trong chuỗi DNA [4][22].

Nghiên cứu phát sinh chủng loài

1.3.1 Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loài

Phả hệ phân tử nghiên cứu về mối quan hệ tiến hóa của tập hợp các trình tự gen dựa vào sự phân tích sự khác biệt di truyền phân tử (DNA, RNA và protein) Các

Cây phát sinh loài là biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các loài, được xây dựng thông qua quá trình phức tạp và đòi hỏi độ chính xác cao Do dữ liệu phát sinh loài có thể chứa nhiều loài khác nhau, quá trình xây dựng cây phát sinh loài là một công cụ cần thiết dựa trên công nghệ tin sinh học Cây phát sinh loài được sử dụng rộng rãi để giải quyết các vấn đề khó khăn trong quá trình xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.

1.3.2 Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài

Bước 1: Sắp gióng cột (xây dựng bộ dữ liệu cục bộ và xử lý bộ dữ liệu của phả hệ phân tử)

Bước 2: Lựa chọn mô hình tiến hóa tối thích

Bước 3: Xây dựng cây phát sinh loài

Bước 4: Đánh giá cây phát sinh loài

1.3.2.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu

Thu nhận dữ liệu từ phương pháp giải trình tự

Thu nhận dữ liệu từ ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI

1.3.2.2 Sắp gióng cột (xây dựng bộ dữ liệu cục bộ và xử lý bộ dữ liệu của phả hệ phân tử)

Bước sắp gióng cột đóng vai trò then chốt trong phân tích phát sinh chủng loài, cung cấp dữ liệu cho bước tiếp theo là lựa chọn mô hình tiến hóa tối ưu Bộ dữ liệu dựng cây phát sinh loài bao gồm DNA, RNA và protein Bước đầu trong sắp gióng cột là chọn phương pháp và khai thác dữ liệu liên quan, phân tích vùng trình tự không rõ ràng, xử lý chèn/xóa gap (indels) để dựng cây phát sinh loài Phầm mềm hỗ trợ sắp gióng cột hiệu quả là ClustalX2, sau khi được sắp gióng cột, trình tự dữ liệu sẽ được đưa vào chương trình dựng cây để xây dựng cây phát sinh loài hoàn chỉnh.

Trong quá trình sắp thẳng hàng trình tự sinh học, chiều dài của trình tự sẽ không đồng nhất và bộ dữ liệu phát sinh loài thường không giống nhau Sự không đồng nhất về chiều dài này là do sự xuất hiện các vùng indels Để giải quyết vấn đề này, các phương pháp sắp thẳng hàng cần xử lý các vùng indels bằng các thuật toán chuyên biệt, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của quá trình sắp thẳng hàng.

SVTH: Nguyễn Hải Châu 12 là tiến hành đồng bộ hóa chiều dài trình tự bằng cách loại bỏ phân tích tất cả các vùng chứa “gap” (Swofford et al., 1996) Phương pháp này giúp lựa chon mô hình tiến hóa phù hợp nhất nhưng lại làm cho vùng biến động bị mất đi ảnh hưởng đến sự phân nhóm trong cây phát sinh loài [14]

Vậy nên, khi sắp gióng cột cho một phân tích phát sinh loài cần quan tâm đến một số điểm sau: (1) Bước sắp gióng cột trong phân tích phát sinh loài là một trong những bước quan trọng nhất bởi vì nó sẽ xậy dựng được bộ dữ liệu để đưa vào mô hình tiến hóa một cách phù hợp nhất, (2) sắp gióng cột rất dễ dàng để chỉnh sửa, xóa một vùng không phù hợp và chèn hoặc xóa khoảng trống để phản ánh chính xác hơn có thể xảy của quá trình tiến hóa dẫn đến sự khác nhau giữa các chuỗi trình tự, (3) việc tiến hành sắp gióng cột rất hữu ích để thực hiện các phân tích dựa trên một loạt sự sai khác của các nucleotide, giúp xác định các vùng bảo tồn ảnh hưởng đến kết quả và những khía cạnh khác của kết quả [14]

1.3.2.3 Lựa chọn mô hình tiến hóa tối thích

Việc lựa chọn mô hình tiến hóa cũng quan trong không kém quá trình sắp gióng cột và xây dựng cây phát sinh loài Mô hình tiến hóa được lựa chọn phụ thuộc vào kết quả của sắp gióng cột Theo sự phát triển của công nghệ và khoa học thì có hai mô hình tiến hóa được tính toán và đánh giá dựa trên các thuật toán khác nhau để xây dựng cây phát sinh loài cho dữ liệu trình tự Một mô hình dựa vào sự thay thế giữa các trình tự trong các chuổi trình tự, còn lại là dựa vào tỷ lệ xác xuất, tần suất của sự thay thế giữa các nucleotide trong các vùng trình tự khác nhau trong bộ dữ liệu [14]

Một vài mô hình tiến hóa ngẫu nhiên phổ biến gồm phương pháp: Jukes-Cantor, Kimura, Hasegawwa-Kishino-Yano (HKY), Tamura-Nei, General Time Reversible (GTR),… Trong đó, mô hình tiến hóa phức tạp nhất là mô hình có khả năng hồi biến tổng quát theo thời gian (General Time Reversible model) Mô hình này thường tạo thành dang ghép GTR+G+I kết hợp với các thong số như tỉ lệ thông số ma trận, tần suất base và phân bố Gamma [14]

1.3.2.4 Xây dựng cây phát sinh loài

Phương pháp xây dựng cây được tiến hành bằng phần mềm có sẵn được trình bày chi tiết trong tài liệu của Saitou, 1996; Swofford et al., 1996; Li, 1997 và được mô tả trên Internet Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài được thực hiện dựa trên phương pháp khoảng cách và phương pháp đặc tính Phần lớn các cuộc thảo luận về cây phát sinh loài phân tử đều đề cập đến tính hữu ích của phương pháp khoảng cách (distance-based method) và phương pháp đặc tính (character-based methods) của các trình tự (Saitou, 1996; Li, 1997) Phương pháp khoảng cách là quá trình tính toán khoảng cách liên kết giữa giữa từng cặp base (ví dụ: liên kết giữa nu T và nu A, G-C hoặc ngược lại) theo một tiêu chuẩn tối thích và sử dụng kết quả khoảng cách trên để xây dựng cây phát sinh loài Phương pháp đặc tính sẽ xây dựng một cây cơ bản sau đó cây này được đưa vào các mô hình có các thông số tiến hóa để dò tìm ra cây tối ưu dựa vào số liệu thực tế của các trình tự Khoảng cách giữa từng cặp base, các tiêu chuẩn tối thích để xây dựng cây được xác định bởi địa hình học của cây (topology) Phương pháp khoảng cách áp dụng với phương pháp Neighbor-Joining và phương pháp đặc tính áp dụng cho phương pháp Maximum pasinomy và maximum likelihood [14]

Neighbor-Joining (NJ) là thuật toán thuật toán được áp dụng phổ biến cho việc xây dựng cây khoảng cách tiến hóa, không phụ thuộc vào bất kể các tiêu chí tối ưu hóa nào Khi xây dựng cây tiến hóa trước tiên các trình tự được xây dựng theo mô hình phân rã hình ngôi sao Hai trình tự có mức độ tương đồng cao nhất được phân nhóm với nhau và được xem là một nhánh Một trình tự khác được so sánh với nhánh vừa thiết lập trên để tìm ra khoảng cách tiến hóa, bước này được thực hiện lặp lại cho đến khi còn duy nhất một trình tự cuối được phân chia nhánh Phương pháp

NJ là tương đối nhanh chóng [14]

Maximum Parsimony (MP) là phương pháp hà tiện tối đa với tiêu chuẩn tối ưu hóa tuân theo các nguyên tắc tốt nhất của dữ liệu để xây dựng cây một cách đơn giản nhất Nguyên lý của phương pháp này là tìm kiếm một cây sao cho số lượng thay đổi tiến hóa là thấp nhất nhằm giải thích những sự khác nhau được nhìn thấy qua các

SVTH: Nguyễn Hải Châu 14 đơn vi phân loại hiện hữu (OTUs) Cây MP là cây ngắn nhất với những thay thế ít nhất hay ít đột biến nhất [14]

Maximum Likelihood (ML) là phương pháp khả năng tối đa, sẽ phân tích tất cả các vấn đề phát sinh loài trong bộ dữ liệu ML sẽ tìm kiếm các mô hình tiến hóa để tìm ra khả năng tối đa nào cao nhất phù hợp với bộ dữ liệu quan sát Cây phát sinh loài sử dụng phương pháp ML cần sử dụng một lượng lớn thời gian để tính toán và không thể đồng thời vừa tìm kiếm mô hình tiến hóa phù hợp vừa tối ưu hóa các mô hình thay thể để phù hợp với bộ dữ liệu cho trước Mô hình ML có thể thực hiện bằng phần mềm PAUP để tiết kiệm thời gian tính toán và có thể lặp đi lặp lại để tìm kiếm một cây ML tối ưu nhất Vì vậy, đây là phương pháp tiêu tốn nhiều thời gian nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất [14]

1.3.2.5 Đánh giá cây phát sinh loài

Sau khi xây dựng thành công của cây phát sinh loài, bước tiếp theo là việc đánh giá các địa hình học (topology) của cây Để đánh giá mức ý nghĩa cho quá trình phân nhánh của cây có thể thực hiện phương pháp đánh giá giá trị bootstrap Efron là người đã đề cập đến giá trị bootstrap trong quá trình xây dựng cây phát sinh loài vào năm 1979 Felsenstein (1985) đã khẳng định giá trị bootstrap là một phương pháp để đánh giá cây phát sinh loài cần phân tích Phương pháp này thường dùng để kiểm tra độ tin cậy của cây cụ thể là đánh giá độ tin cậy của sự phân nhóm loài trên một cây dựa vào số lượng, chiều dài của trình tự nucleotide/acid amin Với giá trị bootstrap lớn hơn 70% tương ứng với giá trị xác xuất lớn hơn 95% thì giá trị phân nhóm được ủng hộ mạnh mẽ Tương tự, giá trị bootstrap lớn hơn 50% thì sự phân nhánh của trình tự trong bộ dữ liệu được ủng hộ đánh giá cao cho việc phân nhóm đó (Hillis và Bull, 1993) [14].

Các gen sử dụng trong nghiên cứu phát sinh chủng loài của chi nấm

1.4.1 Gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

Gen mã hóa RNA của ribosome (nrSSU, nrLSU) là nguồn cung cấp dồi dào thông tin di truyền bảo tồn cao Nhờ đó, các nhà khoa học có thể thiết kế các cặp mồi phổ quát có khả năng khuếch đại và giải trình tự trình tự ở nhiều loài nấm, tạo điều kiện cho nghiên cứu về sự đa dạng và phân loại nấm trở nên dễ dàng hơn.

[44] Trong đó, vùng 18S-28S là vùng phiên mã chính (Vilgalys et al., 2004); vùng 18S hình thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU); vùng 28S, 5,8S và 5S hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của rRNA [44] Vùng 5,8S rRNA có cấu trúc, chức năng liên quan chặt chẽ với tiểu đơn vị lớn của rRNA và có nguồn gốc từ một phần của vùng 23S ở sinh vật nhân sơ Vùng 5S rDNA thường không có vị trí cố định, chỉ có ở nhân của một số loài nấm (Guarro et al., 1999) nrLSU-rRNA là gen mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu phần lớn của ribosom) Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao do đó phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn Cấu trúc của nrLSU-rRNA ngoài những vùng bảo tồn còn có những vùng biến động gọi là domain D1/D2/D3 (D-divergence region, các số được đánh thứ tự 1, 2, 3 bắt đầu từ đầu 5’-3’) [44] Các domain khác nhau của 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU) chứa nhiều thông tin cho phép so sánh các cấp phân loại từ cao xuống đến cấp độ loài (Gueho et al., 1993) Đặc biệt, vùng

DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome gần đây được xem là rất hữu ích cho việc phân loại phần lớn các loài nấm có giá trị y dược (Kurtzman & Robnett, 1997; Fell et al., 2000) Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được biết đến nhiều nhất và cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây (Vilgalys & Hester, 1990) Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp (Sonnenberg et al., 2007) Ngoài ra, một số công trình đã ứng dụng thành công trong nghiên cứu định danh ở loài nấm ký sinh côn trùng hay các loài nấm khác điển hình: sử dụng vùng D1/D2 của tiểu đơn vị lớn nrLSU (28S) ở vùng rDNA trong phân loại cấp độ loài của Orpinomyces spp.,…

Hình 1.3: Vị trí cặp mồi khuếch đại vùng gen nrLSU [44]

1.4.2 Gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit) nrSSU-rRNA là vùng gen mã hóa 18S rRNA (đơn vị hình thành tiểu phần nhỏ của ribosome), nrSSU tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền (Guarro et al., 1999) Gen nrSSU có tính bảo tồn cao do đó nó phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ và xa hơn, được dùng trong việc khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài [20] Vùng nrSSU có thể được đọc trình tự bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer) Các cặp mồi này được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide bảo tồn của gen 18S rRNA (White et al.,1990) Cặp mồi NS1/NS4 được sử dụng trong nghiên cứu này bởi tính phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự được nhiều mẫu nấm ký sinh côn trùng Đây là cặp mồi đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử trong những năm gần đây (White et al., 1990) Điển hình như Bruns et al., (1991) đã phân tích gen nrSSU để chia giới nấm thành 4 lớp Acrasiomycota, Myxomycota,

Oomycota, và fungi Ngoài ra, nghiên cứu của Spatafora et al., 2007 và Sung et al,

2007 đã sử dụng các dữ liệu, gen House keeping gene trong trong đó có nrSSU để xây dựng cây phát sinh loài nhằm định danh các chi, loài nấm ký sinh côn trùng [17]

Hình 1.4: Vị trí cặp mồi khuếch đại vùng gen nrSSU [15]

1.4.3 Gen Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II)

Gen Rpb1 mã hóa cho tiểu phần lớn tứ nhất cho enzym RNA polymerase II

Enzym này có vai trò xúc tác quá trình phiên mã RNA từ DNA ở Eukaryote Trong đó, gen Rbp1 có chứa vùng lập lại heptapeptide hay chính xác hơn là chuỗi amino

SVTH: Nguyễn Hải Châu 17 acid Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro- (Tyrosine-Serine-Proline-Threonine-Serine-Proline-) có tên là CTD, trong đó Ser ở vị trí thứ 5 phosphoryl hóa bởi hoạt động kinase của TFII, kích hoạt enzyme RNA polymerase II chuyển dịch qua promotor và phiên mã

Do cấu trúc lặp lại đặc biệt này đã làm cho gen Rpb1 có độ bảo tồn cao giúp phân biệt giữa các nhóm loài [20] Gen Rpb1 có trọng lượng phân tử khoảng 200kDa và chỉ có một bản sao duy nhất trong tế bào (ngoài trừ một số loài thực vật và các loài thuộc chi Trypanosoma là có gen tương đồng (paralogous)) [40]

Hình 1.5: Cấu trúc vùng gen Rpb1 [40]

(Các vùng màu đen đại diện cho vùng bảo tồn cao) Năm 1997, Croan et al., đã sử dụng gen Rpb1 để nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài nấm Leihmania Tác giả đã so sánh trình tự gen giữa DNA và

RNA polymerase Gen Rpb1 còn được sử dụng để phân tích phát sinh loài ở mức sâu hơn Hirt et al., (1999) đã dùng trình tự gen Rpb1 để chứng minh Microsporidia (sinh vật hoại sinh hoặc ký sinh) có quan hệ với giới nấm Đặc biệt, Sung et al.,

(2007) đã tiến hành sắp xếp lại hệ thống chi nấm Cordyceps và Clavicipitaceae dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ phát sinh loài (162 taxa) nhờ các gen (nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Rpb2, Tub và Atp6) kết hợp phân tích hình thái

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 04/03/2016 – 16/05/2016 Địa điểm: Phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Tp Thủ Dầu Một, Bình Dương.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bộ mẫu sử dụng trong thực nghiệm

Các mẫu hệ sợi nấm được sử dụng trong nghiên cứu này được phân lập và làm thuần từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng Những mẫu nấm này đã được thu thập từ các chuyến đi thực địa tại vùng núi Langbian, tỉnh Lâm Đồng Các mẫu hệ sợi nấm bao gồm: DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069 và DL0075.

Các mẫu nấm sau khi được thu nhận sau những chuyến đi thực địa tại núi Langbiang, Đà Lạt, các mẫu nấm ký sinh côn trùng và xác côn trùng được thu nhận tại vùng nhanh chóng được tiến hành quan sát, mô tả, chụp hình và phân tích tại phòng thí nghiệm sử dụng kính hiển vi quang học Rax Vision (Mỹ) Để phân lập mẫu, một mảnh mô nhỏ ở phần sinh sản của quả thể được tách ra và dán lên nắp của đĩa petri chứa môi trường PGA (Potato Glucose Agar) để thu nhận bào tử túi sau 24 giờ ở nhiệt độ 25 ± 2 o C Hình dạng và sự nảy mầm của bào tử túi được quan sát dưới kính hiển vi soi ngược Rax vision (Mỹ) Sau đó tiến hành cấy truyền qua các đĩa petri chứa môi trường PGA để phân tích các dẫn liệu hình thái ở giai đoạn vô tính Mẫu được định danh theo phương pháp Kobayashi Y (1982), Sung et al., (2007) Kết quả đình danh hình thái mẫu được mô tả cụ thể như sau:

Hình thái giải phẫu của mẫu nấm Cordyceps takaomontana (DL0038A) bao gồm thể bó nấm (A) trong tự nhiên, ký chủ bị bao bọc bởi lớp sợi dày tạo giả hạch trắng (B), thể chén nhô cao (C), hệ sợi trên môi trường Agar phát triển màu vàng khi già (D), hệ sợi phân nhánh mạnh (E), thể bình (F), bào tử đốt (G) và bào tử đốt (H).

Hình 2.2: Hình thái giải phẫu mẫu DL0038B Chú thích: A Quả thể Cordyceps takaomontana (DL0038B) còn non, được bao phủ bởi lớp bụi bào tử màu trắng, thể chén chưa nhô lên khỏi bề mặt quả thể; B Hệ sợi phát triển trên môi trường PGA; C, D Một số dạng bào tử vô tính; E Hệ sợi với nhiều cấu trúc thể bình

Hình 2.3: Hình thái giải phẫu mẫu DL0067 Chú thích: A Mẫu nấm DL0067, B Hệ sợi khuẩn lạc trên môi trường PGA, C Bào tử đính; D, E Cấu trúc cuống bào tử đính và thể bình; F Vật chủ

Hình 2.4: Hình thái giải phẫu mẫu DL0069 Chú thích: A Mẫu nấm DL0069; B Thể chén, C,D Bào tử đính, E, F Thể bình Mẫu nấm DL0069 được tìm thấy trong lá khô dưới tán rừng lá rộng ở độ cao

1650 m tại núi Langbian tỉnh Lâm Đồng Thể bó có hình dạng mảnh, gốc nấm màu nâu, thân nấm màu trắng đục có hình thành thể chén màu nâu đen đã trưởng thành gần đỉnh nấm

Hình 2.5: Hình thái giải phẫu mẫu DL0075 Chú thích: A Bào tử đính, B Vách ngăn trên hệ sợi; C Hệ sợi

Với những cố gắng,dựa vào atlats phân loại định danh nấm ký sinh côn trùng mới nhất được xuất bản (Luangsa-ard et al 2007, 2009, 2010) các mẫu nấm được định danh như sau: DL0038A: Cordyceps takaomontana, DL0038B: Cordyceps takaomontana, DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium sp., DL0075: Cordyceps sp

2.2.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dụng cụ chính bao gồm: que cấy, đèn cồn, đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf, pipetteman, đầu típ, ống đong, erlen, becher, đũa thủy tinh, nhiệt kế, giá đựng ống nghiệm,…

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

Máy lý tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)

Bộ điện di DNA (Biorad)

Cân kỹ thuật (Satorious, Đức)

Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, Biorad)

Máy luân nhiệt (My-Cycle Thermal, Biorad)

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, Biorad)

Hóa chất cần thiết cho quy trình tách chiết gồm:

TE 1X buffer (Tris 1M pH 8,0 và EDTA 0,5M)

Hóa chất cần thiết cho quá trình PCR và điện di gồm:

Primer reverse 10àM dd H 2 O (đã hấp)

2.2.2 Danh mục các phần mềm và cộng cụ trực tuyến

Annhyb: phiên bản 4.946 (Olivier Friad, 2012) là phần mềm giúp làm việc và quản lý các trình tự nucleotide dưới nhiều định dạng

ClustalX2: là một phần mềm (giao diện windows) dùng cho việc so sánh sự tương đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học

Sea View: phiên bản 4.2.12 (Manolo Gouy) là phần mềm có các tính năng hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp gióng cột các trình tự

Chromas Lite: phiên bản 2.1.1 là phần mềm có tính năng mở, chỉnh sửa và lưu các tập tin trình tự thuộc nhiều dạng khác nhau (Fasta, text, EMBL, SwissProt,…) đặc biệt là các trình tự được giải bằng hệ thống ABI dưới dạng biểu đồ huỳnh quang

MEGA: phiên bản 6.06 (Kumar, 2013) là phần mềm dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maxsimum Parsimony, Maxsimum Likelihood, Neighbor Joining

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): phần mềm trực tuyến dùng cho việc khai thác thông tin

BLAST (http://BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi), phần mềm đánh giá độ đặc hiệu mồi, trình tự gửi giải, và độ tương đồng trình tự có sẵn trên NCBI.

IDT analyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer): giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer)

Mẫu nấm ký sinh côn trùng

Tách chiết DNA từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp Phenol/Chloroform

Khuếch đại vùng gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 với cặp mồi tương ứng và điện di

Giải trình tự sản phẩm PCR đã khuếch đại và hiệu chỉnh trình tự

Kiểm tra độ tương đồng bằng BLAST

Xây dựng bộ dữ liệu DNA gồm các mẫu đã giải trình tự và các trình tự theo bài báo của Sung et al., 2007

Dò tìm mô hình tiến hóa và xây dụng cây phát sinh loài (MP, ML, NJ) bằng phần mềm MEGA 6.06

Phân tích định danh hình thái

Phân tích cây phát sinh loài và so sánh kết quả với công trình nghiên cứu của Sung et al., 2007

2.2.4.1 Thu nhận thông tin gen và cặp mồi tương ứng

Dựa trên nghiên cứu của Sung et al (2007) và các tài liệu liên quan, nghiên cứu này đã tìm hiểu vai trò, chức năng, vị trí trên exon và mức độ bảo tồn của các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 Ngoài ra, nghiên cứu còn tập trung vào việc làm rõ lý do sử dụng các gen này trong hỗ trợ định danh nấm túi Ascomycota Tiếp theo, nghiên cứu đã thu thập thông tin về tiêu chí đánh giá cặp mồi được sử dụng, khảo sát kích thước sản phẩm khuếch đại khi áp dụng cặp mồi này trong các công trình nghiên cứu trước đó.

2.2.4.2 Đánh giá các thông số vật lý của mồi

Sau khi thu nhận thông tin và trình tự cặp mồi khuếch đại gene nrLSU, nrSSU, Rpb1 tiến hành kiểm tra và đánh giá các thông số vật lý của cặp mồi bằng công cụ trực tuyến IDT analyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer) giúp xác định các thông số quan trọng của mồi Các thông số của mồi phải đạt những tiêu chí sau: chiều dại nằm trong khoảng 17-28 bp, %GC nằm trong khoảng 40-60%, không có lặp lại các nucleotide G hay C liên tiếp dài hơn 3 nucleotide tại đầu 3’ của mồi, T m nằm trong khoảng 50-65 o C, ΔG (kcal/mole) phải lớn hơn hoặc bằng -9 kcal/mole

2.2.4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi

Sau khi đánh giá các thông số của mồi, tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm trực tuyến như BLAST để kiểm tra đoạn mồi có tính phổ quát hay không và mức độ tương đồng với các loài nào trên ngân hàng dữ liệu NCBI Đồng thời thu nhận các trình tự fasta của gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 có trên Genbank của NCBI về và sắp gióng cột với cặp mồi tương ứng để kiểm tra kích thước sản phẩm dự kiến có sai khác gì nhiều so với các bài báo công bố về gen nrLSU, nrSSU, Rpb1

2.2.4.4 Kiểm tra sản phẩm PCR và giải trình tự

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Khảo sát in silico các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR

3.1.1 Đánh giá mồi trên IDT

Bảng 3.1 : Thông tin về trình tự và các thông số vật lý đánh giá cặp mồi khuếch đại gen nrLSU, nrSSU, Rpb1

STT Gen Ký hiệu Trình tự (5’-3’) L %GC Tm Hairpn dimer

Chú thích: F là mồi xuôi, R là mồi ngược, L là chiều dài của đoạn mồi, T m là nhiệt độ nóng chảy của mồi, Hairpin-dimer là cấu trúc kẹp tóc, Self-dimer tự bắt cặp của mồi, Hetero-dimer là mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp với nhau Ký hiệu các base thoái hóa trong các đoạn trình tự mồi: Y tương ứng C/T, D tương ứng A/G/T,

W tương ứng A/T, R tương ứng A/G, N tương ứng A/T/G/C

Dựa vào phân tích IDT, các thông số quan trọng của cặp mồi tham khảo được đánh giá về chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer) với những tiêu chí sau:

Chiều dài mồi dao động từ 17-28 bp [13] Các cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4, CRpb1/Rpb1Cr với chiều dài mồi xuôi, mồi ngược lần lượt là 19/17 bp, 19/20 bp, 20/23 bp được cho là phù hợp khi nằm trong khoảng từ 17-28 bp

Thiết kế các mồi với %GC khoảng 40-60% Các vùng với thành phẩn %GC cao hơn mức cho phép có thể không biến tính tốt trong tiến trình PCR dẫn đến phản ứng kém hiệu quả Tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn ba base Tại đầu 3’ của mồi, cần có base G hay C để tăng độ dặc hiệu cho bắt cặp [13] Theo đó, %GC của các cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4, CRpb1/Rpb1Cr tương ứng với mồi xuôi và mồi ngược là 52,6%/47,1%, 42,1%/40,0%, 42,5%/42,8% cũng được cho là phù hợp

Nhiệt độ nóng chảy của mồi (T m ) cũng là thông số rất quan trọng, dựa vào đó để quyết định nhiệt độ bắt cặp trong chu trình PCR cho phù hợp Nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 5 o C (lý tưởng là 2-3 o C) Duy trì nhiệt độ nóng chảy T m trong khoản 55-80 o C; Mồi được thiết kế có nhiệt độ bắt cặp trong khoảng 55-60 o C để tránh sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu [13] Theo kết quả đánh giá trên IDT thì nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4, CRpb1/Rpb1Cr tương ứng với mồi xuôi và mồi ngược là 53,3 o C/48,0 o C, 47,2 o C/48,7 o C, 51,3 o C/54,2 o C, các giá trị này đều nằm trong khoảng 55-80 o C, là giá trị Tm thường cho kết quả tốt nhất Bên cạnh đó, nhiệt đọ nóng chảy giữa hai mồi chênh lệch nhau không quá 5 o C, đảm bảo nhiệt độ ủ thích hợp cho cả hai mồi Cấu trúc thứ cấp càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp phần cản trở khả năng bắt cặp của mồi vào trình tự đích Dựa vào năng

SVTH: Nguyễn Hải Châu 34 lượng tự do ΔG (kcal/mol) để xác định độ bền vững của các liên kết của các cấu trúc thứ cấp Theo hãng IDT, giá trị tuyệt đối của năng lượng tự do ΔG càng nhỏ hơn 9 kcal/mol thì liên kết sẽ kém bền vững và không ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR Vì vậy, cần điều chỉnh vị trí mồi tránh cấu trức thứ cấp, nhất là tại đầu 3’ [13] Theo đánh giá của IDT, các giá trị ∆G của cặp mồi LR0R/LR5 và NS1/NS4 đều lớn hơn -9 kcal/mol nên các cấu trúc bậc hai sẽ không gây ảnh hưởng khi sử dụng cặp mồi này trong thực nghiệm Đối với cặp mồi CRpb1/Rpb1Cr, cấu trúc Hairpin dimer có ∆G bằng 2,37 kcal/mol và 3,47 kcal/mol lần lượt với mồi xuôi và mồi ngược, cấu trúc Hetero-dimer có ∆G bằng -6,62 kcal/mol Điều đó cho thấy cấu trúc Hairpin-dimer và cấu trúc Hetero-dimer sẽ không ảnh hưởng đến sản phẩm PCR Trong khi đó, cấu trúc Self-dimer có giá trị ∆G của mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là -9,69 kcal/mol và -12,91 kcal/mol, thấp hơn -9 kcal/mol Trong trường hợp này, năng lượng cần thiết để phá vỡ các dimer cao hơn, có thể giải quyết vấn đề này bằng cách tăng nhiệt độ nóng chảy (T m )

Bảng 3.1 trình bày thông tin về trình tự và các thông số vật lý để đánh giá cặp mồi khuếch đại gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 Cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4 và CRpb1/Rpb1Cr đáp ứng các thông số về độ dài, nhiệt độ nóng chảy, %GC, cấu trúc Hairpin-dimer, Self-dimer và Hetero-dimer Tuy nhiên, cấu trúc Self-dimer của cặp mồi CRpb1/Rpb1Cr có ΔG < 9 kcal/mol nhưng vẫn trong ngưỡng chấp nhận được.

3.1.2 Kết quả kiểm tra mồi bằng BLAST, ClustalX2 và Annhyb của các cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4, CRpb1/Rpb1Cr

3.1.2.1 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 khuếch đại gen nrLSU

Kết quả BLAST cho thấy cặp mồi có thể khuếch đại vùng gen nrLSU của nhiều loài nấm Cordyceps khác nhau như: Cordyceps militaris, Cordyceps sp., Cordyceps takaomontana, Cordyceps tuberculata, Cordyceps cicadae,… Điều này cho thấy cặp mồi này có tính phổ quát

Hình 3.1: Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 bằng BLAST (NCBI)

So sánh trình tự nhánh với trình tự Cordyceps militaris cho thấy sự ghép nối giữa mồi và trình tự đích có điểm tương tự cao (34,2), hệ số Expect thấp (0,003), độ bao phủ cao (100%) và độ tương đồng tối đa đạt 100% Những kết quả này cho thấy rằng cặp mồi LR0R/LR5 đặc hiệu cho trình tự gen nrLSU.

Hình 3.2: Kết quả sắp gióng cột của mồi xuôi LR0R với trình tự gen nrLSU

Hình 3.3: Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal cho thấy cặp mồi LR0R/LR5 bắt cặp khá đặc hiệu tại vùng trình tự tương đồng Mồi xuôi LR0R bắt tại vị trí 751-770 và mồi ngược LR5 bắt cặp với trình tự tại vị trí 1647-1663 trên trình tự Cordyceps takaomontana Từ đó có thể dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại được khi sử dụng cặp mồi này trong thực nghiệm khoảng 913 bp

Hình 3.4: Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R/LR5 trên trình tự gen nrLSU

Kết quả Annhyb giữa cặp mồi LR0R/LR5 và trình tự gen nrLSU với đại diện là Cordyceps militaris thể hiện ở Hình 3.4 Theo kết quả này, mồi xuôi cho kết quả tốt hơn so với mồi ngược.

LR0R bắt cặp bổ sung từ vị trí 718-736 (18bp) và mồi ngược LR5 bắt cặp bổ sung từ vị trí 1629-1645 (17 bp), cặp mồi LR0R/LR5 bắt cặp với trình tự gen nrLSU của

Cordyceps militaris thu được sản phẩm khuếch đại có chiều dài 928 bp Kích thước này chênh lệch 26bp so với kích thước 954 bp của Sung et al., 2007 đã công bố

3.1.2.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4 khuếch đại gen nrSSU

Kết quả BLAST cho thấy cặp mồi có thể khuếch đại vùng gen nrSSU của nhiều loài nấm Cordyceps khác nhau như: Cordyceps militaris, Cordyceps taishanensis, Cordyceps biusisfora, Cordyceps gunii, Cordyceps sp.,… Điều này cho thấy cặp mồi này có tính phổ quát

Hình 3.5: Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4 bằng BLAST (NCBI)

Bảng sắp gióng cột trình tự Cordyceps taishanensis so với trình tự đích cho thấy khả năng bắt cặp cao giữa mồi và đích Điểm số tương đối đạt 38,2, hệ số xác suất (E-value) rất thấp (3e-04) Ngoài ra, độ bao phủ (Query coverage) và độ tương đồng tuyệt đối giữa hai trình tự cũng lớn.

SVTH: Nguyễn Hải Châu 39 nhất (Max ident) đạt 100% Những điều này chứng tỏ cặp mồi NS1/NS4 đặc hiệu với trình tự gen nrSSU

Hình 3.6: Kết quả sắp gióng cột của mồi xuôi NS1 với trình tự gen nrSSU

Kết quả thực nghiệm

3.2.1 Xây dựng và kế thừa quy trình thực nghiệm khuếch đại gen nrLSU, nrSSU,

Rpb1 cho các mẫu nấm ký sinh côn trùng

3.2.1.1 Thu nhận, tách chiết DNA và kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết

Quy trình tách DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform có bổ sung β- mercaptoethanol và CTAB được khảo sát Sau khi tiến hành tách chiết thực hiện với

4 mẫu: DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069, kết quả kiểm tra định tính và định lượng thông qua việc đo mật độ quang tại bước sóng 260 nm, 280 nm được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 0.2: Kết quả kiểm tra DNA bằng mật độ quang phổ kế các mẫu nấm tách chiết có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Mẫu OD 260/280 Nồng độ (àg/ml)

Giá trị OD 260/280 của 4 mẫu thấp hơn 1,8 Dựa vào kết quả OD cho thấy các mẫu vẫn còn lẫn protein nên tỉ số OD 260/280 thấp hơn 1,8 Chứng tỏ, quá trình thao tác thu nhận DNA vẫn bị tạp nhiễm và protein chưa được tủa hết bởi Phenol/Chloroform Tuy nhiên, nồng độ DNA tách chiết bằng phương pháp Phenol/Chloroform có bổ sung β-mercaptoethanol tương đối cao Do đó, các mẫu DNA này được sử dụng để khảo sát sự khuếch đại của cặp mồi tương ứng với gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 trong thực nghiệm Sau khi tách chiết, mẫu DNA được tiến hành PCR

3.2.1.2 Khuếch đại sản phẩm bằng phản ứng PCR với các cặp mồi tương ứng

Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU tách chiết theo phương pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Hình 3.14: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen Rpb1 tách chiết theo phương pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB Kết quả điện di 4 mẫu: DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069 (Hình 3.13) cho thấy băng xuất hiện đúng kích thước mong đợi, chứng âm không xuất hiện băng kí sinh khẳng định sản phẩm PCR không bị tạp nhiễm, thang và băng khá thẳng tương đương với điện trường ổn định Cặp mồi LR0R/LR5 khuếch đại thành công gen

SVTH: Nguyễn Hải Châu 46 nrLSU, sản phẩm sau PCR có kích thước gần bằng 954 bp Tương ứng, hai cặp mồi

NS1/NS4 và CRpb1/Rpb1Cr cũng khuếch đại thành công gen nrSSU và Rpb1 với sản phẩm sau PCR có kích thước xấp xỉ lần lượt là 1102 bp và 803 bp Kết quả này phù hợp với khảo sát in silico cũng như tham khảo từ bài báo của Sung et al

3.2.2 Kết quả hiệu chỉnh trình tự

Sau khi giải trình tự gen, dữ liệu được phân tích trên phần mềm Chromas Lite 2.1.1 Ngoài ra, phần mềm Seaview và Annhyb được sử dụng để hiệu chỉnh trình tự các mẫu nhằm đảm bảo độ chính xác của dữ liệu.

Trong báo cáo này, trình bày hiệu chỉnh một trình tự đại diện gen nrLSU của mẫu DL0038B Chiều dài trình tự gen nrLSU mẫu DL0038B trước khi hiệu chỉnh: mạch xuôi 908 bp và mạch ngược 1092 bp Nhìn chung, hai mạch này đều có tín hiệu khá rõ với các peak rõ ràng, chỉ một vài vị trí tại hai đầu trình tự có tín hiệu không rõ ràng và một vài vị trí mismatch trong trình tự Do đó, trình tự được tiến hành hiệu chỉnh trình tự đối với hai mạch này

Hình 3.15: Hiệu chỉnh tín hiệu nhiễu ở đầu mạch xuôi của nrLSU

Hiệu chỉnh tại vị trí số 1: mạch xuôi là chữ T, mạch ngược là chữ A Nhìn trình tự trên mạch ngược, tín hiệu peak Nucleotide chữ A rõ ràng, còn chữ T bị nhiễu do

SVTH: Nguyễn Hải Châu 47 nằm trên vùng đầu 5', do đó tại vị trí này mạch xuôi chữ T được hiệu chỉnh bằng chữ a (Nu hiệu chỉnh viết bằng chữ thường).

Hiệu chỉnh tại vị trí số 2: tín hiệu vùng này ở mạch xuôi không rõ ràng do rơi vào đầu 5’ giải trình tự do tín hiệu bị nhiễu, khó xác định được nu có chất lượng cao nên phải dựa trên tín hiệu ở mạch ngược (tín hiệu tại vị trí này các peak rõ ràng)

Hình 3.16: Vị trí sai lệch của hai kết quả giải trình tự ở đầu mạch xuôi của nrLSU Tại các vị trí (i) đến (vi) không có sự tương đồng giữa hai mạch, ví dụ tại vị trí (i): mạch xuôi là C, mạch ngược là G Nhưng tín hiệu ở mạch ngược rõ ràng phải được hiệu chỉnh mạch xuôi từ chữ C thành chữ g

Bảng 3.3: Hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí (i) đến (vi)

Vị trí (mạch xuôi) Nu gốc Nu hiệu chỉnh

(vi) G a Đối với các trình tự Nu ở giữa, tất cả các peak đều rõ ràng, và có sự trùng khớp ở hai mạch nên giữ nguyên không cần hiệu chỉnh

Hình 3.17: Hiệu chỉnh ở vùng giữa trên 2 mạch của gen nrLSU

Vùng 3 cần hiệu chỉnh do cặp nu tại vị trí 863 và 864 trên mạch xuôi là T và A, còn trên mạch ngược tại vị trí 1091 và 1092 là G và G, không tương đồng Tuy nhiên, trên mạch xuôi tại vùng 3, đỉnh T và A rất rõ ràng, trong khi trên mạch ngược không rõ ràng và chất lượng đỉnh thấp Do đó, giữ nguyên hai nu T và A trên mạch xuôi.

Vùng 4 có các Nu ở mạch xuôi từ 856 đến 860 có peak rõ ràng Tuy nhiên, ở mạch ngược tương ứng với Nu 1084 đến 1088, tín hiệu bị nhiễu Do đó, các Nu ở mạch xuôi được giữ nguyên để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

Hình 3.18: Hiệu chỉnh vùng 3, vùng 4 trên mạch xuôi nrLSU

Tại vùng đầu 3’ mạch xuôi từ vị trí Nu 865 đến 904 ta thấy trên mạch ngược không có xuất hiện Nu Tuy nhiên, dựa trên hình phổ, ta thấy các Nu từ vị trí 865 đến 878 có peak rõ ràng Do đó, phần Nu này giữ lại, và bỏ các nu từ 879 đến 904

Hình 3.19: Hiệu chỉnh vùng cuối mạch xuôi nrLSU

Hình 3.20: Hiệu chỉnh vùng 3’ trên mạch xuôi của nrLSU Như vậy, sau khi hiệu chỉnh, chiều dài mạch xuôi có kích thước là 882 bp Kết quả chiều dài hiệu chỉnh (882 bp) nằm trong kích thước (950 bp) mà đã được kiểm tra trên Cluxtal và kết quả PCR, điện di vì vậy việc hiệu chỉnh được sử dụng trong phân tích các mẫu tiếp theo

Hình 3.21: Hình kết quả BLAST trình tự gen nrLSU mạch xuôi đã hiệu chỉnh

Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng

STT Mẫu Tín hiệu Kết luận (*)

1 DL0038A Rõ cả hai mạch X

2 DL0038B Rõ cả hai mạch X

3 DL0067 Rõ cả hai mạch X

4 DL0069 Rõ cả hai mạch X

(*) Kết luận: X - có thể dùng cho các phân tích về sau Bảng 3.5: Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh

Chiều dài trước hiệu chỉnh (bp)

Chiều dài sau hiệu chỉnh (bp)

Chú thích: “Chấp nhận” được hiểu là so sánh với các trình tự trên cơ sở dữ liệu Genbank

Kết quả định danh phân tử

3.3.1 Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA

Ngoài các mẫu nấm được trực tiếp thu nhận trình tự, trình tự của các loài nấm thuộc chi Cordyceps và các chi họ hàng trong họ Clavicipitaceae được tham khảo chủ yếu trong bài báo của Sung et al., (2007), và trên genbank sau đó đưa bộ dữ liệu vào trong phân tích phát sinh loài Trình tự gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 của 5 mẫu DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069, DL0075 được đưa vào bộ dữ liệu tham chiếu để xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và cây đa gen để hướng đến hỗ trợ định danh các mẫu trên

3.3.2 Xây dựng cây phát sinh loài phân tử

Trước khi xây dưng cây phát sinh loài thì bộ dữ lệu của các gen đều được sắp gióng cột và đồng bộ hóa Một số trình tự sẽ được loại bỏ do có kích thước sai khác khá lớn so với các trình tự trong bộ dữ liệu ban đầu Trình tự các gen nrLSU, nrSSU,

Rpb1 được đưa vào sắp gióng cột chung với bộ dữ liệu riêng của mỗi gen Sau khi sắp gióng cột và đồng bộ hóa thu được bộ dữ liệu có chuỗi trình tự tương đồng về mặt trình tự cũng như chiều dài Bộ dữ liệu đa gen được xây dựng và thiết lập sau khi đồng bộ hóa vùng trình tự các đơn gen Trình tự của bộ dữ liệu này được nối lại bằng tay Trình tự trong bộ dữ liệu đa gen phải đồng nhất về trình tự gen, vật chủ ký sinh và ngân hàng giống Vì vậy bộ dữ liệu đa gen chỉ còn lại là 48 trình tự chứa thông tin chắc chắn cùng một loài ký sinh trên một vật chủ và thuộc chung một ngân hàng giống đồng nhất với trình tự 4 gen của cùng một mẫu DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069, DL0075

Cây phát sinh loài đơn gen và đa gen của các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 xây dựng cây bằng phần mềm MEGA 6.0 cả 3 cây được xây dựng bằng các phương pháp Neighbor Joining (NJ), Maximun Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML) Kết quả xây dựng cây phát sinh loài được đánh giá dựa vào giá trị bootstrap của 3 cây NJ/MP/ML

Bộ dữ liệu hoàn chỉnh sau bước sắp gióng cột của đơn và đa gen được tiến hành tinh chế Kết quả chiều dài và số lượng trình tự tham chiếu được thể hiện trong bảng 3.6

Bảng 3.6: Kết quả đồng bộ khối dữ liệu dựng cây phát sinh loài đơn và đa gen

Tên gen Chiều dài đồng bộ (bp) Số lượng trình tự nrLSU 753 bp 99 trình tự nrSSU 1365 bp 100 trình tự

Rpb1 518 bp 98 trình tự Đa gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 2236 bp 48 trình tự

Các trình tự trên sau đồng bộ hóa được tiến hành dò tìm mô hình tiến hóa tối thích trước khi xây dựng cây phát sinh loài cho cây Maximum Likelihood (ML) Kết quả đo tìm cho bộ dữ liệu trên cho thấy mô hình tiến hóa phù hợp

Bảng 3.7 Kết quả dò tìm mô hình tiến hóa của các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 và đa gen

Chú thích: TN93: Tamura-Nei, K2: Kimura 2-parameter, GTR: General Time Reversible, I: evolutionarily invariable, G: Gamma distribution

Gen Mô hình tiến hóa Parameters BIC AICc lnL nrLSU TN93+G+I 212 15170.255 13247.605 -6411.101 nrSSU K2+G+I 184 12425.275 10733.850 -5182.457

Rpb1 GTR+G+I 219 27049.794 25129.625 -12344.802 nrLSU, nrSSU và

Hình 3.22: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen nrLSU (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây

NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại)

Hình 3.23: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen nrSSU (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây

NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại )

Hình 3.24: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây

NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại )

Hình 3.25 thể hiện cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 Các con số hiển thị trên các nhánh lần lượt là giá trị bootstrap của các cây NJ/MP/ML với 1000 lần lặp lại.

Mẫu DL0038A, DL0038B phân nhóm với đại diện tham chiếu Cordyceps talkaomontana thuộc ngân hàng giống CBS 116.25 với mã số truy cập AB044637

(nrLSU), AB044631 (nrSSU) Tuy nhiên khi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gen Rpb1 và đa gen thì trình tự gen Rpb1 của trình tự tham chiếu Cordyceps takaomontana lại chưa có trên ngân hàng dữ liệu NCBI vì vậy không thể xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự tham chiếu là Cordyceps takaomontana Nhưng Sung et al., (2007) có đề cập tới Isaria tenuipes chính là thể anamorph của Corcyceps takaomontana và từ thông tin này thì dữ liệu trình tự gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 của Isaria teniupes được thu nhận trên ngân hàng dữ liệu và thay thế làm trình tự tham chiếu cho hai mẫu DL0038A, DL0038B Kết quả mẫu DL0038A, DL0038B phân nhóm với trình tự tham chiếu Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OCS111007 với mã số truy cập DQ522395 (Rpb1) và giá trị bootstrap trên cả ba cây NJ/MP/ML của đơn gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 lần lượt là 62/97/64%; 46/34/44%; 99/99/99% Cây đa gen được xây dựng cho thấy mức độ tương đồng cao của hai mẫu ủng hộ cao và có ý nghĩa với giá trị bootstrap gần như tuyệt đối trên cả ba cây (NJ-BP%, MP-BP%, ML-BP%) Kết quả phân tích DL0038A, DL0038B và Cordyceps takaomontana (thể vô tính là Isaria tenuipes) có quan hệ rất gần hoặc chính cùng một loài Đối với mẫu DL0067 khi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài đơn gen thì kết quả cho thấy mẫu này luôn phân nhóm cùng với hai mẫu DL0038A, DL0038B vào cùng một nhánh Cụ thể là phân nhóm với trình tự tham chiếu là Cordyceps takaomontana trên dữ liệu gen nrLSU, nrSSU với mã số truy cập là AB044637

(nrLSU) và AB044631 (nrSSU), phân nhóm với thể vô tính của Cordyceps takaomontana là Isaria tenuipes trên gen Rpb1 với mã số truy cập là DQ522395

(Rpb1) Giá trị bootstrap ủng hộ cao cho sự phân nhóm này Khi xây dựng cây phát sinh loài đa gen thì mẫu DL0067 lại phân nhóm với DL0038A với giá trị bootstrap tuyệt đối trên cả ba cây (NJ-BP0%, MP-BP0%, ML-BP0%) và hai mẫu nấm này đều phân nhóm với Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OSC111005 với giá trị bootstrap rất cao là 98/99/95% lần lượt trên 3 cây NJ/MP/ML ủng hộ mạnh mẽ cho phân nhóm này Từ kết quả cây phát sinh loài đơn và đa gen thì mẫu

DL0067 được định danh sơ bộ là Cordyceps takaomontana (thể vô tính là Isaria tenuipes)

Hình 3.26: Một phần của cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) Khi tiến hành dựng cây phát sinh loài đơn gen thì mẫu DL0069 luôn phân nhóm với đại diện tham chiếu là Simplicillium lamellicola (CBS 116.25) và Simplicillium lanosoniveum (CBS 101267) với giá trị bootstrap của cây phát sinh loài sử dụng gen nrLSU, Rpb1 đều ủng hộ cho sự phân nhóm này ở mức ý nghĩa Kết hợp với cây phát sinh loài đa gen của ba gen nrLSU, nrSSU, rpb1 cũng phân nhóm với đại diện tham chiếu là Simplicillium lamellicola và Simplicillium lanosoniveum với các thông số bootstrap của ba cây NJ/MP/ML lần lượt là 99/98/99% và 100/100/99% Kết quả phân tích DL0069 và Simplicillium lamellicola, Simplicillium lanosoniveum có quan hệ rất gần với nhau

Hình 3.27: Một phần của cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) Đối với mẫu DL0075 khi được tiến hành xây dựng cây đơn gen thì luôn được phân nhóm với trình tự tham chiếu là Cordyceps staphylinidicola ký sinh trên vật chủ là staphylinid pupae (Coleoptera) thuộc ngân hàng giống ARSEF 5717 với mã số truy cập là EF468836 (nrLSU), EF468981 (nrSSU), EF468881 (Rpb1) và giá trị bootstrap của cây đơn gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 trên cả ba cây NJ/MP/ML lần lượt là 97/93/97%, 99/96/99%, 99/99/99%; đều lớn hơn 70% và các giá trị này ủng hộ cho sự phân nhóm trên đều có ý nghĩa cao Khi tiến hành xây dưng cây đa gen đối

SVTH Nguyễn Hải Châu 59 với mẫu DL0075 cũng phân nhóm với trình tự tham chiếu là Cordyceps staphylinidicola, nhận giá trị hỗ trợ tuyệt đối trên cả ba cây NJ-BP 0%.

MP-BP0%, ML-BP0%) Kết quả phân tích DL0075 và Cordyceps staphylinidicola có quan hệ rất gần hoặc cùng một loài

Hình 3.28: Một phần của cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) Xét về địa hình học (topology) của các cây phát sinh loài: trong phần này chỉ phân tích cây phát sinh loài đa gen của gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 Trên cây ML, 45 trình tự tham chiếu thuộc họ Clavicipitaceae, trong đó 21 trình tự đại diện cho nhóm

A, 12 trình tự đại diện cho nhóm C, 12 đại diện cho nhóm B đều được phân nhóm hợp lý và giá trị bootstrap ủng hộ cao Các trình tự đều phân nhóm hoàn toàn hợp lý và phù hợp với công bố của Sung et al.,(2007) và so với các tình tự nhóm (hai trình tự thuộc loài Glomerella cingulata và một trình tự thuộc loài Verticillium dahlia là các loài nấm ký sinh trên thực vật thuộc nhóm ngoại) Trên cây ML đa gen thì trình tự mẫu DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069, DL0075 đều phân nhóm vào Clavicipitaceae nhóm C nên xét một cách chi tiết hơn về sự phân nhóm này 3 trình DL0038A, DL0038B, DL0067 được phân vào nhóm với Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OSC111005, với giá trị bootstrap cao và ủng hộ cho phân nhóm này là 95%,trình tự mẫu DL0069 được phân vào nhóm Simplicillium lamellicola thuộc ngân hàng giống CBS 116.25 với giá trị boostrap cao và ủng hộ cho sự phân nhóm này là 99%, trình tự mẫu DL0075 được phân vào nhóm của Cordyceps staphylinidicola ký sinh trên vật chủ là staphylinid pupae (Coleoptera) thuộc ngân hàng giống ARSEF 5717 với giá trị boostrap là 100%, so với các tham chiếu còn lại thuộc nhóm C gồm: các đại diện thuộc chi Cordyceps bao gồm: Cordyceps cf purinosa, Phytocordyceps ninchukipora, đại diện thuộc chi Beauveria: B

SVTH: Nguyễn Hải Châu 60 caledonica, đại diện thuộc chi Simplicium: S lamellicola, S obclavatum, S lanosoniveum

Bảng 3.8: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đơn gen

Mẫu Gen Cây tiến hóa NJ Cây tiến hóa MP Cây tiến hóa ML Kết luận sơ bộ

Cordyceps takaomotana nrSSU Cordyceps takaomotana

Cordyceps takaomotana Rpb1 Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes

Cordyceps takaomotana Rpb1 Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes

Cordyceps takaomotana nrSSU Cordyceps takaomotana

Cordyceps takaomotana Rpb1 Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes

Simphicillium lamellicola nrSSU Beauveria caledonica Beauveria caledonica Cordyceps staphylindicola

Beauveria caledonica hoặc Cordyceps staphylindicola

Cordyceps staphylindicola nrSSU Cordyceps staphylindicola

Chú thích: Isaria tenuipes chính là thể vô tính của Cordyceps takaomontana

Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đa gen nrLSU, nrSSU, Rpb1

Mẫu Cây tiến hóa NJ Cây tiến hóa MP Cây tiến hóa ML Kết luận sơ bộ

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

Isaria tenuipes (anamorph của Cordyceps takaomontana)

DL0069 Simphicillium lamellicola Simphicillium lamellicola Simphicillium lamellicola Simphicillium lamellicola

Kết quả định danh hình thái kết hợp sinh học phân tử

Từ các kết quả cây phát sinh loài đơn gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 kết hợp với cây phát sinh loài của ba gen trên bước đầu này cho thấy phân tích phát sinh chủng loài phân tử trên gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 ủng hộ quan điểm định danh dựa trên hình thái: hai mẫu DL0038A và DL0038B là các mẫu nấm thuộc loài Isaria tenuipes (thể anamorph của Cordyceps takaomontana) Trình tự mẫu DL0067 được định danh hình thái là Isaria sp Tuy nhiên khi dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen của gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 thì luôn phân nhóm với Isaria tenuipes ( thuộc họ Isaria), dựa vào kết quả định danh hình thái kết hợp định danh phân tử thì mẫu DL0067 có thể là Isaria tennuipes hoặc Isaria sp

Mẫu DL0069 được xác định là Simplicillium lamellicola (CBS 116.25) dựa trên phân tích phát sinh loài đa gen, cụ thể là gen nrLSU, Rpb1 và nrSSU Mặc dù gen nrSSU cho kết quả không ủng hộ, nhưng khi kết hợp cả ba gen, cây phát sinh loài đã giải quyết được vấn đề này, cung cấp thông tin tiến hóa đáng tin cậy hơn Ngoài ra, phân tích phát sinh loài đa gen cũng hỗ trợ định danh hình thái trước đó của mẫu DL0069 là Simplicillium sp., chỉ ra rằng Simplicillium lamellicola thuộc họ Simplicillium.

BP0%, ML-BP0%) Giá trị bootstrap trên cây đơn và đa gen đều lớn hơn 70% tương đương với giá trị xác xuất lớn hơn 95% ủng hộ mạnh mẽ cho sự phân nhóm này Kết hợp định danh phân tử mẫu DL0075 là Cordyceps staphylinidicola

SVTH: Nguyễn Hải Châu 65 phù hợp với định danh hình thái là Cordycep sp góp phần hỗ trợ định danh hình thái của mẫu nấm sau này