Côn trùng (insectum) là động vật thuộc về ngành không xương sống thuộc lớp Insecta. Chúng là nhóm lớn nhất trong ngành động vật chân đốt. (N.Đ Khiêm, 2010). Trong đó, các loài ong được xếp vào nhóm côn trùng “monophyletic” (Danforth et al. 2013), bao gồm hơn 19000 loài khác nhau được công bố trên thế giới (Ascher et al, 2009). Ong là nhóm côn trùng có tầm quan trọng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: nông nghiệp (thụ phấn của thực vật); cung cấp mật ong trong lĩnh vực thực phẩm và chăm sóc sức khoẻ. Hiện nay ong có bảy họ được công nhận: Andrenidae, Apidae, Colletidae, Halictidae, Megachilidae, Melittidae và Stenotritidae (Michener et al, 2007). Họ ong mật (Apidae) là một trong những họ lớn nhất của loài ong, với hơn 5700 loài khác nhau và được chia thành ba phân họ (Apinae, Xylocopinae và Nomadinae) tương ứng với 34 tộc (tribes) và 209 chi (Ascher et al., 2012). Vùng trình tự gen COI được ứng dụng trong phân tích phát sinh loài, phân loại và xác định được mật ong của hai loài Apis và Trigon (Kek et al, 2017). Theo nghiên cứu của BatalhaFilho và cộng sự, 2010 họ đã thực hiện phân tích giải trình tự 852 bp của vùng trình tự gen COI từ 145 mẫu ong, kết quả cho thấy được cấu trúc di truyền quần thể và lịch sử học của M. quadrifasciata, biến đổi hình thái có sự tương quan mật thiết đến tính chất phát sinh loài trên dữ liệu gen COI. Hệ thống phát sinh loài của ong đang được phát triển nhanh chóng, Theo nghiên cứu của Brady và cộng sự, 2004 đã phát hiện vùng trình tự elongation factor1α (EF1α) chỉ được phát hiện ở họ Colletidae phân họ của ong mật với độ dài từ 101 đến 1044 bp. Tác giả cũng đã chứng minh rằng đoạn trình tự EF1α không xuất hiện ở bất kỳ loài côn trùng khác, kể cả một số nhóm có đặc tính giống với bộ cánh màng. Với những lợi ích to lớn mà loài ong đem lại, chúng ta phải hiểu rõ hơn về đa dạng sinh học, phát sinh loài, tiến hoá và đa dạng hoá của loài ong. (Danforth et al. 2013). Hiện nay, phân tích phát sinh loài và phân tích mô hình tiến hoá của họ ong mật dựa trên vùng trình tự gen COI và EF1α thì chưa được phổ biến. Vì vậy, chúng tôi thực hiện chuyên đề thực tập “Bước đầu xây dựng mô hình phân tích phả hệ phân tử (Molecular phylogentic analysis) nhằm hỗ trợ định danh một số loài ong”, nghiên cứu là bước đầu tìm hiểu mô hình phát sinh loài (phả hệ phân tử) ở một số loài ong.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG MƠ HÌNH PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LỒI ONG DÚ Ở VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: TS Trương Kim Phượng SVTH: Phạm Văn Nam MSSV: 1953012044 Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG MƠ HÌNH PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ NHẰM HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI ONG DÚ Ở VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: TS Trương Kim Phượng SVTH: Phạm Văn Nam MSSV: 1953012044 Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2023 LỜI CẢM ƠN Kết nghiên cứu kết trình học tập, tìm hiểu cố gắng em Để thực nghiên cứu thiếu bảo, hướng dẫn thầy cô Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh tận tâm hướng dẫn chúng em qua buổi học lớp Cô TS Trương Kim Phượng, giảng viên hướng dẫn chúng em thực nghiên cứu này, ln tận tình giúp đỡ em buổi học, buổi nói chuyện thảo luận Cơ giúp đỡ em tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian thực tập Các bạn chung khoá 2019 với em; bạn Hồ Bảo An, Hồ Châu Q, Trương Đình Thi động viên, nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ trình thực tập Cuối xin cảm ơn ba mẹ chị người ln quan tâm chăm sóc, u thương tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2023 Phạm Văn Nam DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình I Đặc điểm cấu tạo trùng Hình I Đặc điểm thành phần ong mật Hình I Khu vực sống Ong không đốt giới Hình I Tổ số lồi ong khơng đốt (a Dactylurina staudingeri, b Meliponula ferruginea, c Hypotrigona sp.) Hình I Chi ong thuộc họ Meliponini (Taxonomy NCBI) Hình I Cấu trúc tiểu đơn vị COI Hình III Kết Blast mồi CO1-2166F 18 Hình III Kết Blast mồi CO1-2386R 18 Hình III Kết phân tích cơng cụ AnnHyb với chi Liotrigona mahafalya 19 Hình III Kết phân tích công cụ AnnHyb với chi Partamona bilineata 20 Hình III Kết phân tích cơng cụ AnnHyb với chi Mourella caerulea 20 Hình III Kết Blast mồi EB1-F 22 Hình III Kết Blast mồi EB1-R 22 Hình III Kết phân tích cơng cụ AnnHyb với chi Mourella caerulea 23 Hình III Kết phân tích cơng cụ AnnHyb với lồi Tetragonisca angustula 24 Hình III 10 Kết phân tích cơng cụ AnnHyb với lồi Oxytrigona mediorufa 24 Hình III 11 Đặc điểm hình thái mẫu ong Dú 25 Hình III 12 Kết điện di mẫu ong Dú với mồi CB2-F CB2-R 26 Hình III 13 Kết điện di mẫu ong Dú với mồi EB1-F EB1-R 26 Hình III 14 Kết Blast trình tự gene COI mẫu C8 Genbank 28 Hình III 15 Kết Blast trình tự gene COI mẫu C12 Genbank 28 Hình III 16 Kết Blast trình tự gene EF-1α mẫu E3 Genbank 29 Hình III 17 Kết Blast trình tự gene EF-1α mẫu E4 Genbank 29 Hình III 18 Kết Blast trình tự gene EF-1α mẫu E6 Genbank 30 Hình III 19 Kết Blast trình tự gene EF-1α mẫu E6 Genbank 30 Hình III 20 Bảng mơ hình tiến hố liệu gen COI 31 Hình III 21 Cây ML xây dựng từ trình tự gen COI 31 Hình III 22 Cây MP xây dựng từ trình tự gen COI 32 Hình III 23 Cây NJ xây dựng từ trình tự gen CO 32 Hình III 24 Bảng mơ hình tiến hố chi thuộc họ Meliponini dựa gen EF-1α 33 Hình III 25 Cây ML xây dựng từ trình tự gen EF-1α 34 Hình III 26 Cây MP xây dựng từ trình tự gen EF-1α 34 Hình III 27 Cây NJ xây dựng từ trình tự gen EF-1α 35 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng III Bộ trình tự gen COI thu thập từ nguồn liệu Genbank (NCBI) 16 Bảng III Bộ trình tự gen EF-1α thu thập từ nguồn liệu Genbank (NCBI) 17 Bảng III Trình tự mồi khảo sát gen COI 17 Bảng III Thông số vật lí cặp mồi CO1-F CO1-R 21 Bảng III Thông số khảo sát cặp mồi F R IDT analyzer 21 Bảng III Kết đo mật độ quang mẫu tách chiết DNA mẫu ong Dú 25 Bảng III Thành phần phản ứng 27 Bảng III Chu trình nhiệt 27 DANH TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base Pair DNA Deoxyribonucleic Acid NCBI National Center Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reactionr RNA Ribosomal Ribonucleic acid Tm Nhiệt độ nóng chảy COI Cytochrome Oxidase I IDT OligoAnalyzer Integrated DNA technologies OligoAnalyzer MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis NJ Neighbour-Joining ML Maximum likelihood MP Maximum parsinomy EF-1α elongation factor-1α MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU PHẦN I MỞ ĐẦU 10 Tổng quan tài liệu 1.1 Khái niệm côn trùng 1.2 Cấu tạo côn trùng 1.3 Tổng quan Bộ cánh màng 1.4 Gen COI 1.5 Gen EF-1α (elongation factor-1α) PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật Liệu Phương pháp nghiên cứu PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khai thác liệu 16 Khảo sát máy tính để thiết kế mồi phù hợp, đặc hiệu vùng trình tự gen COI, EF-1α số loài ong 17 2.1 Kết khảo sát mồi vùng trình tự gen COI 17 2.2 Kết khảo sát mồi vùng trình tự gen EF-1α 21 Khảo sát thực nghiệm 25 3.1 Kết tách chiết 25 3.2 Kết khuếch đại vùng gen COI cặp mồi CB2-F CB2-R 25 3.3 Kết khuếch đại vùng gen EF-1α cặp mồi EB1-F EB1-R 26 3.4 Kết thiết lập chu kỳ nhiệt PCR khuếch đại vùng gene COI EF-1α mẫu ong Dú 26 Kết giải trình tự 27 Phân tích phát sinh loài phân tử 30 5.1 Phân tích phả hệ phân tử gene COI 30 5.2 Phân tích phả hệ phân tử gen EF-1α 33 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Côn trùng (insectum) động vật thuộc ngành không xương sống thuộc lớp Insecta Chúng nhóm lớn ngành động vật chân đốt (N.Đ Khiêm, 2010) Trong đó, lồi ong xếp vào nhóm trùng “monophyletic” (Danforth et al 2013), bao gồm 19000 loài khác công bố giới (Ascher et al, 2009) Ong nhóm trùng có tầm quan trọng ứng dụng nhiều lĩnh vực: nông nghiệp (thụ phấn thực vật); cung cấp mật ong lĩnh vực thực phẩm chăm sóc sức khoẻ Hiện ong có bảy họ cơng nhận: Andrenidae, Apidae, Colletidae, Halictidae, Megachilidae, Melittidae Stenotritidae (Michener et al, 2007) Họ ong mật (Apidae) họ lớn loài ong, với 5700 loài khác chia thành ba phân họ (Apinae, Xylocopinae Nomadinae) tương ứng với 34 tộc (tribes) 209 chi (Ascher et al., 2012) Vùng trình tự gen COI ứng dụng phân tích phát sinh lồi, phân loại xác định mật ong hai loài Apis Trigon (Kek et al, 2017) Theo nghiên cứu Batalha-Filho cộng sự, 2010 họ thực phân tích giải trình tự 852 bp vùng trình tự gen COI từ 145 mẫu ong, kết cho thấy cấu trúc di truyền quần thể lịch sử học M quadrifasciata, biến đổi hình thái có tương quan mật thiết đến tính chất phát sinh lồi liệu gen COI Hệ thống phát sinh loài ong phát triển nhanh chóng, Theo nghiên cứu Brady cộng sự, 2004 phát vùng trình tự elongation factor-1α (EF-1α) phát họ Colletidae phân họ ong mật với độ dài từ 101 đến 1044 bp Tác giả chứng minh đoạn trình tự EF-1α khơng xuất lồi trùng khác, kể số nhóm có đặc tính giống với cánh màng Với lợi ích to lớn mà lồi ong đem lại, phải hiểu rõ đa dạng sinh học, phát sinh lồi, tiến hố đa dạng hố lồi ong (Danforth et al 2013) Hiện nay, phân tích phát sinh lồi phân tích mơ hình tiến hố họ ong mật dựa vùng trình tự gen COI EF-1α chưa phổ biến Vì vậy, chúng tơi thực chun đề thực tập “Bước đầu xây dựng mơ hình phân tích phả hệ phân tử (Molecular phylogentic analysis) nhằm hỗ trợ định danh số lồi ong”, nghiên cứu bước đầu tìm hiểu mơ hình phát sinh lồi (phả hệ phân tử) số loài ong Mục tiêu - Mục tiêu tổng quát: Áp dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm xây dựng mơ hình phân tích phả hệ phân tử hỗ trợ định danh số mẫu ong có dược tính (ong Dú) Xây dựng mơ hình phả hệ phân tử số trình tự mục tiêu (tham chiếu) tập trung gen mục tiêu: COI, EF-1α số mẫu ong công bố liệu trực tuyến gen, genome côn trùng (Genbank,…) Nội dung nghiên cứu: Nội dung 1: Khai thác liệu Khai thác liệu, hệ thống tổng quan khoa học Nội dung 2: Khảo sát máy tính để thiết kế mồi phù hợp, đặc hiệu vùng trình tự mục tiêu: gene COI, EF-1α số loài ong Nội dung 3: Áp dụng phƣơng pháp PCR kết hợp giải trình tự thu nhận trình tự gene mục tiêu Nội dung 4: Phân tích phát sinh lồi phân tử PHẦN I MỞ ĐẦU Kết khảo sát thơng số vật lí mồi CB2-R Kết đánh giá cấu trúc kẹp tóc mồi CB2-R 43 Kết khả tự bắt cặp mồi CB2-R Kết thông số vật lí mồi EB1-F 44 Kết đánh giá cấu trúc kẹp tóc mồi EB1-F Kết khả tự bắt cặp mồi EB1-F 45 Kết đánh giả khả bắt cặp EB1-F EB1-R Kết thơng số vật lí mồi EB1-R 46 Kết đánh giá cấu trúc kẹp tóc mồi EB1-R Kết khả tự bắt cặp mồi EB1-R 47 Kết giải trình tự Kết giải trình tự C8-F Kết giải trình tự C8-R 48 Kết giải trình tự E3-F 49 Kết giải trình tự E3-R 50 Kết giải trình tự E4-F 51 Kết giải trình tự E4-R 52 Kết giải trình tự E6-F 53 Kết giải trình tự E6-R 54 Kết giải trình tự E7-F 55 Kết giải trình tự E7-R 56 Mơ hình tiến hố liệu gen COI Mơ hình tiến hố liệu gen EF-1α 57