Hỗ trợ định danh các chi nấm ký sinh côn trùng thuộc bộ Ascomycota dựa trên phân tích phát sinh chủng loài gen nrLSU nrSSU rpb1

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1. Bộ mẫu sử dụng trong thực nghiệm

Chromas Lite: phiên bản 2.1.1 là phần mềm có tính năng mở, chỉnh sửa và lưu các tập tin trình tự thuộc nhiều dạng khác nhau (Fasta, text, EMBL, SwissProt,…) đặc biệt là các trình tự được giải bằng hệ thống ABI dưới dạng biểu đồ huỳnh quang. BLAST (http://BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi): phần mềm trực tuyến với các thông số mặc định sẵn trên NCBI nhằm đánh giá độ đặc hiệu của mồi, sự tương đồng giữa các trình tự gửi giải với các trình tự trên NCBI,…. IDT analyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer): giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer).

Bên cạnh đó, tìm hiểu các nguyên nhân, lý do mà các nhà nghiên cứu lại sử dụng gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 để tiến hành hỗ trợ định danh các chi nấm trong họ nấm túi Ascomycota. Sau đó tiến hành thu nhận thông tin về tiêu chí đánh giá cặp mồi này, các công trình nghiên cứu khác có sử dụng cặp mồi này, khảo sát kích thước sản phẩm khuếch khi dùng cặp mồi này. Sau khi thu nhận thông tin và trình tự cặp mồi khuếch đại gene nrLSU, nrSSU, Rpb1 tiến hành kiểm tra và đánh giá các thông số vật lý của cặp mồi bằng công cụ trực tuyến IDT analyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer) giúp xác định các thông số quan trọng của mồi.

Sau khi đánh giá các thông số của mồi, tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm trực tuyến như BLAST để kiểm tra đoạn mồi có tính phổ quát hay không và mức độ tương đồng với các loài nào trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Đồng thời thu nhận các trình tự fasta của gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 có trên Genbank của NCBI về và sắp gióng cột với cặp mồi tương ứng để kiểm tra kích thước sản phẩm dự kiến có sai khác gì nhiều so với các bài báo công bố về gen nrLSU, nrSSU, Rpb1. Nếu kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng về chiều dài, không có sự sai khác giữa các giữa các nucleotide với trình tự nghiên cứu thì trình tự hiệu chỉnh được chấp nhận.

Trường hợp trình tự hiệu chỉnh có sai khác đối với các trình tự trên Gen bank của NCBI thì tiến hành xem xét lại các nucleotide có sự sai khác này dựa vào peak tương ứng trên Chromas Lite 2.1.1 để xác định chính xác có thể là lỗi kỹ thuật trong quá trình hiệu chỉnh. Cũn nếu peak khụng rừ ràng (khụng thể nhận biết là nucleotide nào) thỡ tiến hành thu nhận các trình tự có mức độ tương đồng cao nhất so với trình tự nghiên cứu trên NCBI, sắp gióng cột và kiểm tra tần số xuất hiện tại nucleotide cần hiệu chỉnh rồi xác định nucleotide cần thay thế ở vị trí đó. Ngoài các mẫu nấm được trực tiếp thu nhận trình tự, trình tự của các loài nấm thuộc chi Cordyceps và các chi họ hàng trong họ Clavicipitaceae được tham khảo chủ yếu trong bài báo của Sung et.

Quá trình đồng bộ được thực hiện sau khi sắp gióng cột nhằm tạo sự đồng nhất về chiều dài của các trình tự, tăng mức độ tin cậy và giá trị bootstrap cho cây phát sinh loài. Cuối cùng, cây phát sinh loài được xây dựng theo ba phương pháp: Maximum Likelihood, Neighbor-Joining và Maximum Parsimony được thực hiện bằng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar, 2013), thiết lập chạy với giá trị bootstrap là 1000 lần.

Khảo sát in silico các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR 1. Đánh giá mồi trên IDT

SVTH: Nguyễn Hải Châu 33 Chú thích: F là mồi xuôi, R là mồi ngược, L là chiều dài của đoạn mồi, Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi, Hairpin-dimer là cấu trúc kẹp tóc, Self-dimer tự bắt cặp của mồi, Hetero-dimer là mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp với nhau. Kết quả BLAST cho thấy cặp mồi có thể khuếch đại vùng gen nrLSU của nhiều loài nấm Cordyceps khác nhau như: Cordyceps militaris, Cordyceps sp., Cordyceps takaomontana, Cordyceps tuberculata, Cordyceps cicadae,… Điều này cho thấy cặp mồi này có tính phổ quát. Kết quả BLAST cho thấy cặp mồi có thể khuếch đại vùng gen nrSSU của nhiều loài nấm Cordyceps khác nhau như: Cordyceps militaris, Cordyceps taishanensis, Cordyceps biusisfora, Cordyceps gunii, Cordyceps sp.,… Điều này cho thấy cặp mồi này có tính phổ quát.

Kết quả BLAST cho thấy cặp mồi có thể khuếch đại vùng gen Rpb1 của nhiều loài nấm Cordyceps khác nhau như: Cordyceps militaris, Cordyceps cicadae, Cordyceps brongniartii, Cordyceps cylindrica, Cordyceps sp.,… Điều này cho thấy cặp mồi này có tính phổ quát. SVTH: Nguyễn Hải Châu 43 Hình 3.12: Kết quả Annhyb cặp mồi CRpb1/Rpb1Cr trên trình tự gen Rpb1 Hình 3.12 thể hiện kết quả Annhyb giữa cặp mồi CRpb1/Rpb1Cr và trình tự gen Rpb1 với đại diện là Cordyceps militaris. Cây phát sinh loài đơn gen và đa gen của các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 xây dựng cây bằng phần mềm MEGA 6.0 cả 3 cây được xây dựng bằng các phương pháp Neighbor Joining (NJ), Maximun Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML).

SVTH: Nguyễn Hải Châu 53 Hình 3.22: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen nrLSU (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây. SVTH: Nguyễn Hải Châu 54 Hình 3.23: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen nrSSU (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây. SVTH: Nguyễn Hải Châu 56 Hình 3.25: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần. lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại).

Tuy nhiên khi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gen Rpb1 và đa gen thì trình tự gen Rpb1 của trình tự tham chiếu Cordyceps takaomontana lại chưa có trên ngân hàng dữ liệu NCBI vì vậy không thể xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự tham chiếu là Cordyceps takaomontana. Đối với mẫu DL0067 khi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài đơn gen thì kết quả cho thấy mẫu này luôn phân nhóm cùng với hai mẫu DL0038A, DL0038B vào cùng một nhánh. Cụ thể là phân nhóm với trình tự tham chiếu là Cordyceps takaomontana trên dữ liệu gen nrLSU, nrSSU với mã số truy cập là AB044637 (nrLSU) và AB044631 (nrSSU), phân nhóm với thể vô tính của Cordyceps takaomontana là Isaria tenuipes trên gen Rpb1 với mã số truy cập là DQ522395 (Rpb1).

Kết hợp với cây phát sinh loài đa gen của ba gen nrLSU, nrSSU, rpb1 cũng phân nhóm với đại diện tham chiếu là Simplicillium lamellicola và Simplicillium lanosoniveum với các thông số bootstrap của ba cây NJ/MP/ML lần lượt là 99/98/99% và 100/100/99%. Trên cây ML đa gen thì trình tự mẫu DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069, DL0075 đều phân nhóm vào Clavicipitaceae nhóm C nên xét một cách chi tiết hơn về sự phân nhóm này 3 trình DL0038A, DL0038B, DL0067 được phân vào nhóm với Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OSC111005, với giá trị bootstrap cao và ủng hộ cho phân nhóm này là 95%,trình tự mẫu DL0069 được phân vào nhóm Simplicillium lamellicola thuộc ngân hàng giống CBS 116.25 với giá trị boostrap cao và ủng hộ cho sự phân nhóm này là 99%, trình tự mẫu DL0075 được phân vào nhóm của Cordyceps staphylinidicola ký sinh trên vật chủ là staphylinid pupae (Coleoptera) thuộc ngân hàng giống ARSEF 5717 với giá trị boostrap là 100%, so với các tham chiếu còn lại thuộc nhóm C gồm: các đại diện thuộc chi Cordyceps bao gồm: Cordyceps cf. Từ các kết quả cây phát sinh loài đơn gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 kết hợp với cây phát sinh loài của ba gen trên bước đầu này cho thấy phân tích phát sinh chủng loài phân tử trên gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 ủng hộ quan điểm định danh dựa trên hình thái: hai mẫu DL0038A và DL0038B là các mẫu nấm thuộc loài Isaria tenuipes (thể anamorph của Cordyceps takaomontana).

Tuy nhiên khi dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen của gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 thì luôn phân nhóm với Isaria tenuipes ( thuộc họ Isaria), dựa vào kết quả định danh hình thái kết hợp định danh phân tử thì mẫu DL0067 có thể là Isaria tennuipes hoặc Isaria sp. Đối với cây phát sinh loài đơn gen nrLSU, Rpb1 cũng cho kết quả ủng hộ cho sự phân nhóm này.Tuy nhiên khi xây dựng cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU thì cho kết quả là mẫu DL0069 không phân nhánh vào nhóm Simplicillium mà phân nhánh vào Beauveria clade với giá trị bootstrap trên 3 cây NJ/MP/ML lần lượt là 29/27/28%. SVTH: Nguyễn Hải Châu 79 Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp NJ dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên là giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại).