Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng thu được tại vùng núi langbiang, đà lạt, lâm đồng bằng phương pháp phân tích phả hệ phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ PHẠM THỊ THÚY NGỌC HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THU ĐƯỢC TẠI VÙNG NÚI LANGBIANG, ĐÀ LẠT, LÂM ĐỒNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ PHẠM THỊ THÚY NGỌC HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THU ĐƯỢC TẠI VÙNG NÚI LANGBIANG, ĐÀ LẠT, LÂM ĐỒNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS LAO ĐỨC THUẬN TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự – Hạnh phúc KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC GIẤY XÁC NHẬN Tôi tên là: Phạm Thị Thúy Ngọc Ngày sinh: 15/02/1988 Nơi sinh: An Giang Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 2184202011008 Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh kết nối tồn văn thơng tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ký tên Phạm Thị Thúy Ngọc X0 CỘNG HÒA XẢ HỘI CHỦ NGHĨA Vl£T NAM Dộc lâp - Tư - Hanh phúc Ỷ KIẺN CHO PHÉP BÀO VỆ LUẬN VÀN THẠC sĩ CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DÀN Giảng viên hướng dan: TS Lao Đức Thuận Học viên thực hiện: Phạm Thị Thúy Ngọc Lớp: MBIO021A Ngày sinh: 15/02/1988 Nơi sinh: An Giang Tên đề tầỉ: HÔ trợ định danh mẫu nám ký sinh côn trùng thu đưực vùng núi LangBiang Đà Lạt, Lim Đồng bảng phương pháp phán tích phả hệ phân tử Ý kiền cùa giáo viên hướng dln việc cho phép học viên dược bảo vộ luận vân tmớc Hội Thành phổ Hồ Chi Minh, ngày tháng .nám 20 Người nhập xét LỜI CAM ĐOAN Tôi xác nhận luận văn “Hỗ trợ định danh mẫu nấm ký sinh côn trùng thu vùng núi LangBiang, Đà Lạt, Lâm Đồng phương pháp phân tích phả hệ phân tử” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Ngồi tài liệu tham khảo trích dẫn luận văn này, tơi khẳng định toàn phần luận văn chưa công bố sử dụng để đăng ký cấp nơi khác Tôi tuân theo tất quy định nguyên tắc trích dẫn tài liệu nghiên cứu người khác sử dụng chúng luận văn Khơng có sản phẩm cơng trình nghiên cứu người khác sử dụng luận văn mà khơng trích dẫn cách Luận văn chưa nộp để nhận cấp trường đại học sở đào tạo khác Thành phố Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm 2023 Phạm Thị Thúy Ngọc i LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn hướng dẫn hỗ trợ chân thành TS Lao Đức Thuận trình thực luận án tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án tiến độ Đồng thời, xin gửi lời biết ơn đến TS Trương Bình Nguyên giúp cung cấp mẫu thực nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị, bạn Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử Trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh ln quan tâm giúp đỡ thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Lê Huyền Ái Thúy, TS Trương Kim Phượng tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ cho tơi để luận án hồn thành tốt Xin chân thành cám ơn Tác giả Phạm Thị Thúy Ngọc ii TÓM TẮT Nghiên cứu tập trung vào việc xác định phân loại lồi nấm chi Cordyceps lồi có mối quan hệ gần cách sử dụng phân tích phân tử dựa nhiều gene khác Phân tích phân tử giúp so sánh thông tin gene mẫu nấm để xác định xác chúng thuộc loài Kết nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân tích phân tử để xác định lồi nấm phù hợp với việc sử dụng đặc điểm hình thái (như hình dạng, kích thước) chúng Các phát sinh lồi dựa thơng tin gene cho thấy tính mạnh mẽ có ủng hộ cao (giá trị bootstrap) cho phương pháp phân tích sử dụng Dựa kết phân tích đơn gen, đa gene lần ủng hộ kết định danh hình thái Cụ thể: mẫu nghiên cứu bao gồm: Cordyceps takaomontana, Simplicillium lamellicola, Cordyceps ninchukispora, Ophiocordyceps langbianensis Ophiocordyceps sphecocephala Phân tích đa gene cung cấp kết đáng tin cậy minh chứng cho tính đơn huyết thống nhóm nấm nghiên cứu Phương pháp vượt qua hạn chế phân tích đơn gene giữ vai trị quan trọng việc nghiên cứu xác định loài nấm Việc xác định xác lồi nấm quan trọng không việc hiểu đa dạng sinh học mà cịn có ý nghĩa ứng dụng thực tế nghiên cứu dược liệu bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên Nghiên cứu chứng minh phân tích đa gene cơng cụ mạnh mẽ việc giải thách thức việc định danh phân loại loài nấm iii ABSTRACT This study focuses on identifying and classifying fungal species within the genus Cordyceps and closely related species using molecular analysis based on multiple genes Molecular analysis helps compare the genetic information of fungal samples to accurately determine their species The research results indicate that using molecular analysis to identify fungal species aligns well with using morphological characteristics (such as shape and size) Phylogenetic trees based on genetic information show robustness and high support (bootstrap values) for each analysis method used Based on the results of single-gene analysis, multi-gene analysis once again supports the identification results based on morphological traits Specifically, the studied samples include Cordyceps takaomontana, Simplicillium lamellicola, Cordyceps ninchukispora, Ophiocordyceps langbianensis, and Ophiocordyceps sphecocephala The multigene analysis provides reliable results and evidence for the study's monophyletic nature of the fungal groups This method surpasses the limitations of single gene analysis and plays a crucial role in researching and identifying fungal species Accurately identifying fungal species is important for understanding biological diversity and practical applications such as medicinal research and the conservation of natural resources This study demonstrates that multi-gene analysis is a powerful tool for addressing challenges in the identification and classification of fungal species iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CÁM ƠN II TÓM TẮT III ABSTRACT .IV MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ VII DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT………………………………………………………… X CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1 Cơ sở hình thành luận văn 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu chi tiết Câu hỏi nghiên cứu 4 Phạm vi đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa nghiên cứu Kết cấu luận văn CHƯƠNG II CƠ SỞ TỔNG QUAN Tổng quan chi nấm Cordyceps Fr 1.1 Sơ lược chi nấm Cordyceps Fr 1.2 Tiềm ứng dụng CÁC PHƯƠNG PHÁP định danh LOÀI 2.1 Định danh dựa vào hình thái 2.2 Định danh dựa vào phân tích phân tử nghiên cứu nước 13 Các phương pháp kỹ thuật phân tử 14 4.1 Tách chiết khuếch đại trình tự 14 v 4.2 Giải trình tự 15 Nghiên cứu phát sinh loài 15 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 Vật liệu 21 1.1 Mẫu nấm 21 1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 21 1.3 Quy trình thực 23 Tiến trình thực 25 2.1 Tách chiết DNA phương pháp Phenol/Chloroform 25 2.2 Phản ứng PCR khuếch đại gene mục tiêu giải trình tự 26 2.3 Phân loại phân tích phả hệ phân tử 26 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 Khảo sát mồi 31 1.1 Kết kiểm tra thông số vật lý mồi 31 1.2 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi 33 Kết thực nghiệm 35 2.1 Kết tách chiết khuếch đại gene mục tiêu 35 2.2 Kết hiệu chỉnh trình tự 37 2.3 Tạo sở liệu 40 2.4 Kết xây dựng phát sinh loài 43 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 KẾT LUẬN 55 ĐỀ NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 vi