Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi cordyceps và tương tự bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh họ

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS VÀ TƯƠNG TỰ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ KẾT HỢP TIN SINH HỌC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS LAO ĐỨC THUẬN CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG _/ 2016 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chi nấm Cordyceps Fr (Họ Clavicipitaceae) chi nấm ký sinh trùng có độ đa dạng cao tập trung nghiên cứu Trong đó, mức độ đa dạng cao nằm quốc gia Đông Á Đông Nam Á Đây chi nấm có nhiều ứng dụng rộng lớn lĩnh vực y học, nơng nghiệp, … Chính vậy, việc xây dựng sưu tập loài nấm bước nghiên cứu đặc tính dược học lồi nấm ký sinh trùng địa nước ta Hiện nay, việc định danh thực chủ yếu dựa hình thái Tuy nhiên, phương pháp gặp nhiều khó khăn đa dạng hình thái nấm hệ lưỡng danh Vì vậy, phương pháp hỗ trợ khác sử dụng để làm rõ thành phần lồi nấm, có phương pháp sử dụng phát sinh phân tử dựa trình tự DNA Đề tài “Hỗ trợ định danh loài nấm thuộc chi Cordyceps tương tự kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh học” xây dựng đạt kết sau: (1) Đề tài xây dựng thành công cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 kết qủa hỗ trợ định danh 27 trình tự thu nhận từ mẫu nấm Cordyceps; (2) Xây dựng sở liệu cục trình tự gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB ATP6 từ việc thu nhận trình tự gen từ Genbank; (3) khảo sát thành công thông số mồi dựa vào phần mềm OligoAnalyzer Primer-BLAST; (4)lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tối ưu phương pháp sử dụng proteinase K kết hợp với CTAB Về khuếch đại trình tự mục tiêu, đề tài khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB ATP6 với thông số nhiệt độ bắt cặp thời gian kéo dài xác định cụ thể; (4) xây dựng thành công phát sinh phân tử đơn gen đa gen nhằm hỗ trợ cho trình định danh mẫu nấm thuộc chi Cordyceps Các mẫu nấm hỗ trợ định danh thành cơng đến mức lồi mẫu đến mức chi theo quan điểm lồi phát sinh chủng loại Trong đó, có mẫu nấm thuộc chi Polycephalomyces thuộc họ Ophiocordycipitaceae mẫu thuộc chi Simplicillium, Isaria Cordyceps họ Cordycipitaceae I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Cordyceps Fr (Clavicipitaceae) is an entomopathogenic fungal genus with high diversity and of high interest in recent years Further, the peak of diversity of this genus is expected to lie within East and Southeast Asia This genus is famous for its various applications in medicine, agriculture Therefore, establishment of a collection for this genus is the first step towards investigation of the medicinal effects of the local entomopathogenic fungi in Vietnam Currently, the identification process is mainly based on morphology However, this method often faces with many difficulties due to the diverse fungal characteristics and the existence of a binominal nomenclature system Therefore, alternative methods for supporting the identification have been developed, including the use of molecular phylogenetics basing on DNA sequences The research project “Assisting the identification of Cordyceps and related species using molecular biology and bioinformatics” have been established and produced the following results: (1) The project successfully the secondary structures of ITS-5.8S-ITS2 region and supported the identification of 27 Cordyceps sample; (2) The project established a database of nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB, and ATP6 sequences from Genbank; (3) The project successfully analyzed the physical parameters of primers using OligoAnalyzer and Primer-BLAST; (4) The project identified the optimized DNA extraction method using proteinase K with CTAB For sequence amplification, the project successfully amplified the nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB, and ATP6 regions with the specified annealing temperature and elongation time; (4) The project successfully established monogenic and multigenic phylogentic trees to support the identification process Nine fungal samples have been identified to species level and one to genus level, according to the phylogenetic view of species In particular, sample belonged to Polycephalomyces (Ophiocordycipitaceae) and samples belonged to Cordyceps, Isaria, and Simplicillium (Cordycipitaceae) II MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT II MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VII DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ X PHẦN MỞ ĐẦU XIV 1.1 Tổng quan Cordyceps Fr (họ Clavicipitaceae) 1.1.1 Sơ lược chi nấm Cordyceps 1.1.2 Ứng dụng 1.2 1.1.2.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp 1.1.2.2 Trong y dược: Phân loại học 1.2.1 1.2.1.1 1.3 Theo quan niệm hình thái học (Morphological analysis) Theo quan niệm phát sinh phân tử (Molecular phylogenic analysis) Phát sinh phân tử 1.3.1 Định nghĩa: 1.3.2 Cây phát sinh gen phát sinh loài 12 1.3.3 Phương pháp phân tích 13 1.3.4 Phương pháp kiểm tra 17 1.3.5 Vai trò phát sinh phân tử hỗ trợ phân loại định danh chi nấm Cordyceps Fr.: 19 1.4 PCR suy biến 20 III 1.4.1 Khái niệm 20 1.4.2 Mồi suy biến 20 1.4.3 Tối ưu hóa phương pháp PCR suy biến với mồi suy biến 21 1.5 Dự đoán cấu trúc bậc hai (secondary structure) rDNA hỗ trợ định danh 22 1.6 Một số mẫu nấm Cordyceps thu nhận vùng núi LangBiang, Lâm Đồng [4]: 23 1.6.1 Tổng quát 23 1.6.2 DL0004 – Ophiocordyceps neovolkiana 23 1.6.3 DL0015 – Cordyceps pseudomilitaris 24 1.6.4 DL0038A DL0038B – Cordyceps takaomontana: 26 1.6.4.1 DL0038A 26 1.6.4.2 DL0038B 27 1.6.5 DL0006, DL0050 DL0067 – Paecilomyces sp.: 28 1.6.5.1 DL0006 28 1.6.5.2 DL0050 29 1.6.5.3 DL0067 29 1.6.6 DL0069, DL0075 DL0077 – Cordyceps sp 30 1.6.6.1 DL0069 30 1.6.6.2 DL0075: 31 2.1 Vật liệu 33 2.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, phần mềm sử dụng 33 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 33 2.2.2 Hóa chất 34 2.2.3 Phần mềm 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Khảo sát mồi 34 2.3.1.1 Trình tự mồi 34 2.3.1.2 Tiến trình thực hiện: 35 IV 2.3.1.3 2.3.2 Tiêu chuẩn đánh giá: 36 Khảo sát quy trình tách chiết DNA 36 2.3.2.1 Phương pháp tách chiết 36 2.3.2.2 Phương pháp đánh giá 37 2.3.3 Khảo sát suy trình PCR 38 2.3.3.1 Phương pháp thực 38 2.3.3.2 Phương pháp đánh giá 38 2.3.4 Giải trình tự hiệu chỉnh trình tự: 38 2.3.5 Xây dựng sở liệu 39 2.3.6 Phân tích phát sinh phân tử 39 2.3.7 Phương pháp dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 40 3.1 Kết dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 41 3.1.1 Kết phân tích cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 41 3.1.2 Tóm tắt kết định danh hình thái 27 trình tự mẫu nấm Cordyceps với hỗ trợ phân tích cấu trúc bậc hai 53 3.2 Khảo sát mồi 55 3.2.1 Thông số vật lý mồi 55 3.2.2 Tính đặc hiệu mồi 58 3.3 Tách chiết DNA 63 3.4 Khuếch đại gen mục tiêu 64 3.5 Hiệu chỉnh trình tự: 67 3.6 Xây dựng sở liệu cục 70 3.7 Xây dựng phát sinh phân tử 79 3.7.1 Mơ hình tiến hóa 79 3.7.2 Phân tích đơn gen 80 3.7.3 Phân tích đa gen 85 3.7.3.1 Khối liệu bốn gen 85 3.7.3.2 Khối liệu sáu gen 90 V 3.8 Tổng hợp kết phân tích mẫu nấm T001 đến T010 96 3.8.1 Mẫu T001 96 3.8.2 Mẫu T002 97 3.8.3 Mẫu T003 99 3.8.4 Mẫu T004, T005, T006, T007 101 3.8.5 Mẫu T008, T010 102 3.8.6 Mẫu T009 103 4.1 Kết luận 105 4.2 Kiến nghị 106 PHỤ LỤC: MINH CHỨNG ẤN PHẨM KHOA HỌC 116 PHỤ LỤC: KẾT QUẢ ĐÀO TẠO 118 VI DANH MỤC CHỮ KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ ATP6 Mitochondrially Encoded ATP Synthase BLAST basic local alignment search tool bp(s) Basepair(s) CSDL Cơ sở liệu EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid HTU hypothetical taxomonic unit ITS Internal Transcribed Spacer ML Maximum likelihood MP Maximum parsimony nrLSU nuclear large subunit ribosomal DNA NJ Neigbour joining nrSSU nuclear small subunit ribosomal DNA OTU operational taxomonic unit PCI Phenol Chloroform Isoamyl alcohol RPB1 largest subunit of RNA polymerase II SDS sodium dodecyl sulfate TBE buffer Tris Borate EDTA buffer TE Tris EDTA TEF1 elongation factor 1 TUB  tubulin VII DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1.1 Ký hiệu cho mồi suy biến 21 2.1 Danh sách mẫu sử dụng đề tài 33 2.2 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 35 2.3 Tiêu chí lựa chọn mồi sử dụng cho phản ứng PCR 46 2.4 Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm 47 3.1 Kết phân tích dự đốn cấu trúc bậc hai vùng gen ITS2 53 3.2 Kết khảo sát thông số vật lý mồi 56 3.3 Kết phân tích thơng số vật lý theo cặp mồi 58 3.4 3.5 3.6 3.7 Nhiệt độ bắt cặp (Ta) đề xuất cho cặp mồi sử dụng nghiên cứu Kết phân tích mồi đặc hiệu phần mềm PrimerBLAST Thời gian kéo dài kích thước sản phẩm khuếch đại mong đợi Kết tách chiết DNA 10 mẫu nấm sử dụng đề tài 58 60 62 64 3.8 Điều kiện phản ứng ban đầu cho phản ứng PCR gen 64 3.9 Kết tối ưu hóa mồi 66 3.10 Kết hiệu chỉnh trình tự trình tự tương thích BLAST 69 3.11 Cơ sở liệu 116 taxon sử dụng nghiên cứu 73 3.12 Kích thước khối liệu mơ hình phù hợp 80 3.13 Kết phân tích định danh dựa phát sinh phân tử 97 4.1 Tổng hợp kết định danh theo quan điểm hình thái lồi phát sinh phân tử VIII 107 IX T009 Cordyceps staphylinidicola Beauveria bassiana Beauveria bassiana Cordyceps scarabaeicola Beauveria caledonica Hình 3.36 Một phần phát sinh phân tử gen dựng phương pháp Maximum Likelihood với giá trị bootstrap tương ứng nhánh mẫu T009 104 4.1 Kết luận Dựa kết thu nhận được, kết luận đưa ra: Nội dung Đề tài xây dựng thành công cấu trúc bậc hai vùng gen ITS1-5,8SITS2 kết qủa hỗ trợ định danh 27 trình tự thu nhận từ mẫu nấm Cordyceps Nội dung Xây dựng sở liệu gồm 116 taxon bao gồm trình tự gen mục tiêu Đồng thời, khảo sát thành công thông số mồi dựa vào phần mềm OligoAnalyzer Primer-BLAST Từ đó, thơng số ban đầu cho trình PCR đề xuất Nội dung Đề tài lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tối ưu phương pháp sử dụng proteinase K kết hợp với CTAB Về khuếch đại trình tự mục tiêu, đề tài khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB ATP6 với thông số nhiệt độ bắt cặp thời gian kéo dài xác định cụ thể Giải trình tự hiệu chỉnh trình tự Đề tài giải trình tự thành cơng 60 trình tự thuộc gen 10 mẫu nấm Các trình tự sau hiệu chỉnh cho kết hỗ trợ định danh loài tốt Nội dung Đề tài xây dựng thành công phát sinh phân tử đơn gen đa gen nhằm hỗ trợ cho trình định danh mẫu nấm thuộc chi Cordyceps Các phát sinh đơn gen chứng minh cho thấy không hỗ trợ tốt cho công tác định danh so với đa gen Tổ hợp đa gen bốn gen (nrSSU, nrLSU, TEF1 RPB1) có đủ khả phân tích mẫu nấm tương đương với tổ hợp sáu gen (nrSSU, nrLSU, TEF1, RPB1, TUB ATP6) Các mẫu nấm hỗ trợ định danh thành cơng đến mức lồi mẫu đến mức chi theo quan điểm loài phát sinh chủng loại (Bảng 4.1) Trong đó, có mẫu nấm thuộc chi Polycephalomyces thuộc họ Ophiocordycipitaceae mẫu thuộc chi Simplicillium, Isaria Cordyceps họ Cordycipitaceae Các kết sử dụng để định hướng cho trình định danh hình thái dẫn liệu mặt hình thái ghi nhận thêm Bảng 4.1 Tổng hợp kết định danh theo quan điểm hình thái lồi phát sinh phân tử Mẫu Định danh hình thái Định danh phát sinh phân tử 105 T001 Cordyceps neovolkiana Polycephalomyces formosus T002 Paecilomyces sp Isaria javanica T003 Cordyceps pseudomilitaris Cordyceps pruinosa ? T004 Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana T005 Cordyceps takaomontana Cordyceps takaomontana T006 Paecilomyces sp Isaria tenuipes T007 Paecilomyces sp Isaria tenuipes T008 Cordyceps sp Simplicillium chinense T009 Cordyceps sp Cordyceps staphylinidicola T010 Cordyceps sp Simplicillium chinense 4.2 Kiến nghị Để nâng cao khả hỗ trợ phương pháp xây dựng phát sinh phân tử để hỗ trợ định danh mẫu nấm thuộc chi Cordyceps, đưa đề nghị sau: Thứ nhất, kết hợp phân tích gen ITS và/hoặc gen RPB2 để nâng cao độ ủng hộ nhánh Thứ hai, nghiên cứu sử dụng phương pháp dựng theo phương pháp hậu nghiệm Bayes nhằm bổ sung thêm độ ủng hộ từ phân tích thống kê Thứ ba, nghiên cứu q trình gióng cột nhằm sử dụng tối ưu vùng mang thông tin rõ ràng làm rõ vai trò vùng chưa rõ ràng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: [1] Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân, Phạm Kim Sơn (2006), "Tạo sinh khối thử nghiệm hiệu lực số loại nấm ký sinh sâu ăn tạp rầy mềm hại rau cải TP Cần Thơ", Tạp chí nghiên cứu khoa học, trường ĐH Cần Thơ [2] Nguyễn Dương Khuê (2005), "Sử dụng nấm Metarhizium anisopliae Sorok phòng trừ mối nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo phương pháp lây nhiễm", Hội nghị trùng học tồn quốc lần thứ 5, 409 – 414 [3] Nguyễn Thị Lộc, Võ Thị Bích Chi, Nguyễn Thị Nhàn, Phạm Quang Hưng, Huỳnh Văn Nghiệp, Vũ Tiến Khang, Nguyễn Đức Thành (2002), "Nghiên 106 cứu, sản xuất ứng dụng hai chế phẩm sinh học để quản lý loài sâu hại lúa", Viện lúa ĐBSCL, 274 – 295 [4] Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Ngun (2014), "Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps Tây Nguyên khảo sát tiềm ứng dụng chúng y dược", Hội thảo hợp tác khoa học công nghệ phát triển bền vững nông nghiệp Lâm Đồng – Tây Nguyên, 39-40 [5] Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2007), "Đặc điểm sinh học khả gây bệnh nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đối vời sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.)", Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp - ĐH Nơng lâm TP Hồ Chí Minh, - 2, 58-63 [6] Đặng Hoàng Quyên, Trần Phi Hoàng Yến, Võ Thị Xuyến, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Ngun (2012), "Khảo sát hoạt tính kháng cholinesterase cao chiết từ sinh khối số chủng nấm Cordyceps sp phân lập Việt Nam", Tạp chí Công nghệ sinh học, 10 (4A): 1033 - 1039 [7] Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR Ứng dụng phân tích DNA, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội [8] Huỳnh Thư, Ngô Đại Nghiệp, Võ Thị Xuyến, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên (2013), "Nghiên cứu tiềm Cordyceps sp việc bảo vệ tế bào gan HEPG2 chống lại tác nhân oxy hóa", Tạp chí Khoa học Công Nghệ, 51(5B), 339-343 [9] Huỳnh Thư, Ngô Đại Nghiệp, Võ Thị Xuyến, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên (2012), "Nghiên cứu khả kháng oxy hóa cao chiết từ số chủng nấm Cordyceps sp Phân lập Việt Nam", Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 10(4A), 1041-1046 [10] Nguyễn Thị Thúy, Nguyễn Viết Tùng, Trần Ngọc Lân, Thái Thị Ngọc Lam (2015), "Một số đặc điểm sinh vật học lồi nấm Ký sinh trùng Isaria javanica (Frider & Bally) Samson & Hywel-Jones Vườn Quốc Gia Pù Mát, Nghệ An", Tạp chí Khoa học Phát Triển, 13 (5),687-693 [11] Phạm Thị Thùy, Trần Văn Huy, Nguyễn Duy Mạn (2005), "Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria 107 Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương đậu xanh Hà Tĩnh năm 2003-2004", Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, 494 -497 [12] Nguyễn Xuân Viết (2009), Giáo trình tiến hóa, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội [13] Lê Thị Anh Đào, Phạm Nữ Kim Hoàng, Nguyễn Trương Kiến Khương, Lê Huyền Ái Thúy, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Ngun (2010) Phát lồi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps pseudomilitaris Hywel-Jones & Sivichai, 1994 núi Langbian-Đà Lạt, Việt Nam Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 8(3B), tr.1507-1511 [14] Phạm Thị Hạnh, Lê Huyền Ái Thúy, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên (2011) Phát loài thuộc chi Cordyceps, Ophiocordyceps Langbianensis núi Langbian, tỉnh Lâm Đồng Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 9(4B), tr.825-829 [15] Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps Tây Nguyên khảo sát tiềm ứng dụng chúng y dược Kỷ yếu Hội thảo Quốc tế “Hợp tác Khoa học Công nghệ & Phát triển bền vững Nông nghiệp Lâm Đồng – Tây Nguyên 2014” 39-40 [16] Lê Thùy Liên, Phạm Nữ Kim Hoàng, Đỗ Thị Thiên Lý, Lê Huyền Ái Thúy, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên (2010) Phát lồi nấm ký sinh trùng Cordyceps neovolkiana núi Langbian-Đà Lạt, Việt Nam Tạp chí Cơng Nghệ Sinh Học, 8(3A), tr.1007-1013 Tài liệu tiếng Anh: [17] Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers E et al (1990), "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 [18] Bos DH, Posada D (2005), "Using models of nucleotide evolution to build phylogenetic trees", Developmental and Comparative Immunology, 29(3), 211 – 227 [19] Brinkman FS, Leipe DD (2001), “Phylogenetic analysis”, Bioinformatics: A practical guide to the analysis of genes and proteins, John Wiley & Sons Inc, 323 – 358 108 [20] Castlebury LA, Rossman AY, Sung GH, Hyten AS, Spatafora JW (2004), “Multigene phylogeny reveals new lineage for Stachybotrys chartarum, the indoor air fungus”, Mycological research, 108(8), 864-872 [21] Castresana J (2007), “Topological variation in single-gen phylogenetic trees”, Genome Biology, 8(6), 216 – 220 [22] Castrillo LA, Humber RA (2009), "Molecular methods for identification and diagnosis of fungi", Insect pathogens, CABI, 50-70 [23] Chen YQ, Wang N, Qu L, Li T, Zhang W (2001), "Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA", Biochemical systematics and ecology, 29(6), 597-607 [24] Cracraft J (1983), "Species concepts and speciation analysis", Current ornithology, Springer, 159-187 [25] Cracraft J (1989), "Speciation and its ontology The empirical consequences of alternative species concepts for understanding patterns and processes of differentiation", Speciation and its Consequences, Sinauer Asscociates, 2859 [26] Felsentein J (1981), “Evolutionary Trees from DNA Sequences: A Maximum Likelihood Approach”, Journal of Molecular Evolution, 17(6), 368 – 376 [27] Giegerich R (2000), “A systematic approach to dynamic programming in bioinformatics”, Bioinformatics, 16(8), 665 – 677 [28] Gontia-Mishra I, Tripathi N, Tiwari S (2014), "A simple and rapid DNA extraction protocol for filamentous fungi efficient for molecular studies", Indian Journal of Biotechnology, 13, 536-539 [29] Gouy M, Guindon S, Gascuel O (2010), "SeaView version : a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building", Molecular Biology and Evolution, 27(2), 221224 109 [30] Guindon S, Gascuel O (2003), “A simple, fast and accurate method to estimate large phylogenies by maximum-likelihood”, Systematic Biology, 52(5), 696 – 704 [31] Gul HT, Saeed S, Khan FZA (2014), "Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: A review", Applied Sciences and Business Economics, 1(1), 10-18 [32] Hall BG (2013), “Building Phylogenetic Trees form Molecular Data with MEGA”, Molecular Biology and Evolution, 30(5),1229 – 1235 [33] Hall BD (2003), “Molecular systematics using gene sequences encoding nuclear RNA polymerase subunits”, Washington University [34] Harrison CJ, Langdale JA (2006), “A step by step guide to phylogeny reconstruction”, The Plant Journal, 45(4), 561 – 572 [35] Holder M, Lewis PO (2003), “Phylogeny estimation: Traditional and Bayesian approaches”, Genetics, 4(4), 275 – 284 [36] Huelsenbeck JP, Ronquist F, Nielsen R, Bollback JP (2001), “Bayesian Inference of Phylogeny and Its Impact on Evolutionary Biology”, Science, 294, 2310 – 2314 [37] Isaka M, Kongsaeree P, Thebtarononth Y (2001), "Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620 II Structure elucidation", The Journal of anitbiotics, 54(1), 36-43 [38] Johnson D, Sung GH, Hywel-Jones NL, Luangsa-Ard JJ et al (2009), "Systematics and evolution of the genus Torrubiella (Hypocreales, Ascomycota)", Mycological research, 113(3), 279 - 289 [39] Kepler R, Ban S, Nakagiri A, Bischoff J et al (2013), "The phylogenetic placement of hypocrealean insect pathogens in the genus Polycephalomyces: an application of One Fungus One Name", Fungal Biology, 117(9), 611 - 622 [40] Kobayasi Y (1941), "The genus Cordyceps and its allies", Science reports of the Tokyo Bunrika Daigaku, 84, 53-260 110 [41] Kobayasi Y (1982), "Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella", Transactions of the Mycological Society of Japan, 23, 329364 [42] Kobayasi Y, Shimizu D (1980), "Cordyceps species from Japan", Bulletin of the National Science Museum, Tokyo [43] Kosiol C, Bofkin L, Whelan S (2006), "Phylogenetics by likelihood: Evolutionary modeling as a tool for understanding the genome", Journal of Biomedical Informatics, 39(1), 51 - 61 [44] Kumar S, Filipski AJ (2001), “Molecular phylogeny reconstruction”, Encyclopedia of life sciences, – [45] Kuo HC, Su YL, Yang HL and Chen TY (2008) Establishment and Application of PCR-SSCP Profile for Molecular Typing of Cordyceps Fungi Food biotechnology 22(4) p.311-325 [46] Lin GN, Zhang C, Xu D (2011), “Polytomy identification in microbial phylogenetic reconstruction”, BMC System Biology, 5(3), 52 – 62 [47] Lo HC, Hsieh C, Lin FY, Hsu TH (2013), "A systematic review of the mysterious caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis in DongChongXiaCao and related bioactive ingredients", Journal of traditional and complementary medicine, 3(1), 16-32 [48] Luangsa-ard, Hywel-Jones NL, Manoch L, Samson RA (2005), "On the relationships of Paecilomyces sect Isarioidea species", Mycological research, 109(5),581-589 [49] Lutzoni F, Kauff F,Cox CJ, McLaughlin D et al (2004), "Assembling the fungal tree of life: progress, classification, and evolution of subcellular traits", American Journal of Botany, 91(10), 1446-1480 [50] Mains EB (1958), "North American entomogenous species of Cordyceps", Mycologia, 50, 169-222 [51] Maser P, Thomine S, Schroeder JI, Ward JM et al (2001), “Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis”, Plant Physiology, 126(4), 1646 – 1667 111 [52] McNeill J, Barrie FR, Burdet HM, Demoulin V et al.(2006), International code of Botanical Nomenclature, International Association for Plant Taxonomy [53] McNeill J, Barrie FR, Buck V, Demoulin V et al.(2012), International code of Nomenclature for algae, fungi and plants, International Association for Plant Taxonomy [54] Meng Z, Kang J, Wen T, Lei B et al (2015), "Cordycepin and N6-(2hydroxylethyl)-adenosine from Cordyceps pruinosa and their interaction with human serum albumin", PLoS One, 10(3) [55] O’Donnel K, Cigelnik E (1997), “Two diveregent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous”, Molecular phylogenetics and evolution, 7(1), 103-116 [56] Page RDM, Charleston MA (1997), “From Gene to Organismal Phylogeny: Reconciled Trees and the Gene Tree/Species Tree Problem”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 7(2), 231 – 240 [57] Paterson RR (2008), "Cordyceps: a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?", Phytochemistry, 69(7), 1469-1495 [58] Pereira F, Carneiro J, Amorim A (2008), "Identification of species with DNA-based technology: Current progress and challenges", Recent Patents on DNA & gene sequences, 2(3), 187-199 [59] Pervez MT, Babar ME, Nadeem A, Aslam M et al (2014), “Evaluating the Accuracy and Efficiency of Multiple Sequence Alignment Methods”, Evolutionary Bioinformatics, 10, 205 – 217 [60] Pevsner J (2009), Bioinformatics and Functional Genomics, WileyBlackwell Publishing [61] Phillips A, Janies D, Wheeler W (2000), “Multiple sequence alignment in phylogenetic analysis”, Molecular Phylogenetics and Evoluion, 16(3), 317 – 330 [62] Quandt CA, Kepler RM, Gams W, Araujo JP et al (2014), "Phylogeneticbased nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium", IMA fungus, 5(1), 121-134 112 [63] Rehner SA (2009), "Molecular systematics of entomopathogenic fungi", Insect pathogens, CABI, 145-165 [64] Rehner SA, Samuels GJ (1994), “Taxomony and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences”, Mycological research, 98(6), 625-634 [65] Rehner SA (2001), “Primer for Enlogation Factor 1-α (EF1-α)”, Insect Biocontrol Laboratory [66] Ronquist F, Deans AR (2010), “Bayesian Phylogenetics and Its Influence on Insect Systematics”, Annual Review of Entomology, 55, 189 – 206 [67] Russell DJ (2014), Methods in Molecular Biology 1079: Multiple sequence alignment methods, Humana Press [68] Salemi M, Vandamme AM (2009), Handbook of Phylogenetics, Cambridge University Press [69] Samson RA (1974), "Paecilmomyces and some allied Hyphomycetes", Studies in Mycology, http://www.cbs.knaw.nl/publications/1006/content_files/content.htm [70] Shrestha B, Tanaka E,Han JG, Oh J et al (2014), "A brief chronicle of the genus Cordyceps Fr., the oldest valid genus in Cordycipitaceae (Hypocreales, Ascomycota)", Mycobiology, 42(2), 93-99 [71] Sleator RD (2013), “A beginner's guide to phylogenetics”, Microbial Ecology, 66(1), – [72] Suárez-Díaz E, Anaya-Munoz VH (2008), “History, objectivity, and the construction of molecular phylogenies”, Studies in History and Philosophy of Biological and Biomedical Sciences, 39(4), 451 – 468 [73] Sullivan J, Joyce P (2005), “Model selection in phylogenetics”, Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics, 36, 445 – 466 [74] Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM,Luangsa-Ard JJ et al (2007), "Phylogenetic classification of Cordyceps and the Clavicipitaceous fungi", Studies in Mycology, 57, 5-59 [75] Sung GH, Sung JM, Hywel-Jones NL, Spatafora JW (2007), “A multi-gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of 113 localized incongruence using a combinational bootstrap approach”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 44(3), 1204 – 1223 [76] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G et al (2011), “MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods”, Molecular Biology and Evolution, 28(10), 2731 – 2739 [77] Vilgalys R, Hester M (1990), “Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species”, Journal of Bacteriology, 172(8), 4238-4246 [78] Wang WJ, Wang XL, Li Y, Xiao SR et al (2012), "Molecular and morphological studies of Paecilomyces sinensis reveal a new clade in clavicipitaceous fungi and its new systematic position", Systematics and Biodiversity, 10(2), 221-232 [79] White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990), “Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics”, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 315-322 [80] WHO (1998), Guidelines for the Appropriate use of Herbal Medicines [81] Yang Z (2006), Computational Molecular Evolution, Oxford University Press [82] Zhao D, Liu B, Li LY, Zhu XF et al (2013), "Simplicillium chinense: a biological control agent against plant parasitic nematodes", Biocontrol Science and Technology, 23(8), 980-986 [83] Zuker M (2003) Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction Nucleic Acids Res., 31(13):3406-15 Tài liệu mạng: [84] BLAST Tutorial: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html [85] Cordyceps.us: http://cordyceps.cgrb.oregonstate.edu/species/cordyceps/pruinosa [86] Designing PCR primers: 114 https://sg.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/pipettips/decoded/2013/10/21/designing-pcr-primers-and-probes [87] Ignatius: http://ignatius.blog3.fc2.com/blog-entry-421.html [88] OligoAnalyzer 3.1: https://sg.idtdna.com/calc/analyzer 115 PHỤ LỤC: MINH CHỨNG ẤN PHẨM KHOA HỌC Bài báo khoa học: Vũ Tiến Luyện, Lao Đức Thuận, Trinh Văn Hạnh, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, Lê Huyền Ái Thúy (2015), “Phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh mẫu nấm DL0038A DL0038B thuộc chi Cordyceps”, Tạp chí phát triển KH &CN ĐHQG – Chuyên san KHTN (Đang chờ đăng) Dinh Minh Hiep, Lao Duc Thuan, Vu Tien Luyen, Trinh Van Hanh, Le Huyen Ai Thuy, Truong Binh Nguyen (2015), “Discovery of entomopathogenic fungi Cordyceps takaomontana at LangBiang Mountain, Lam Dong, Vietnam”, The Journal of Science and Technology, Vietnam (In Press) Lao Duc Thuan, Dinh Minh Hiep, Truong Binh Nguyen, Pham Nguyen Duc Hoang, Le Huyen Ai Thuy, “Supporting for identification of entomopathogenic fungi by molecular analysis on ITS1-5.8S-ITS2 region” The Journal of Science and Technology, Vietnam (In press) Vu Tien Luyen, Lao Duc Thuan, Trinh Van Hanh, Dinh Minh Hiep, Truong Binh Nguyen, Le Huyen Ai Thuy (2015) “Analysis of nrLSU gene to support identification of fungus belonging to Cordyceps genus and Clavicipitaceae family” The Journal of Science and Technology, Vietnam (In press) Vũ Tiến Luyện, Lao Đức Thuận, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, Lê Huyên Ái Thúy (2015), “Phân tích phả hệ phân tử đa gen nhằm hỗ trợ định danh số mẫu nấm thuộc chi nấm ký sinh trùng”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 13(2A), 618-687 Lê Huyền Ái Thúy, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, Lao Đức Thuận, Trương Kim Phượng, Đỗ Ngọc Nam (2015) Xây dựng phương pháp luận nghiên cứu hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng phân tích phả hệ phân tử vùng ITS15.8S-ITS2 Tạp chí Khoa học Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh 1(40), 50-60 Vu Tien Luyen, Trinh Van Hanh, Trinh Hoang Luan, Nguyen Thi Bich Thao, Dinh Minh Hiep, Truong Binh Nguyen, Lao Duc Thuan (2015), “Discovery of entomopathogenic fungi Cordyceps takaomontana at LangBian mountain, Lam Dong, Vietnam”, The Journal of Science, Ho Chi Minh City Open University, 1(13), 14-20 116 Vu Tien Luyen, Lao Duc Thuan, Dinh Minh Hiep, Truong Binh Nguyen (2016) Classification of Cordyceps and related fungi – review Journal of Science Ho Chi Minh City Open University 1(17), 29 -34 Kỷ yếu hội nghị: Vũ Tiến Luyện, Lao Đức Thuận, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, Lê Huyên Ái Thúy (2015), “Phân tích phả hệ phân tử đa gen nhằm hỗ trợ định danh số mẫu nấm thuộc chi nấm ký sinh trùng”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2015 – Bio Danang 2015 Lao Đức Thuận, Vũ Tiến Luyện, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, Lê Huyền Ái Thúy (2014), “Hỗ trợ định danh loài nấm thuộc chi Cordyceps chi lân cận kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp tin sinh học”, Kỷ yếu Hội nghị Nấm học: Nghiên cứu ứng dụng khu vực phía nam năm 2014, 95 Vũ Tiến Luyện, Trịnh Văn Hạnh, Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, Lê Huyền Ái Thúy, Lao Đức Thuận (2014), “Phân tích vùng gen nrLSU nhằm hỗ trợ định danh phát sinh loài số loài nấm thuộc chi Cordyceps”, Kỷ yếu Hội nghị Nấm học: Nghiên cứu ứng dụng khu vực phía nam năm 2014, 111 Đinh Minh Hiệp, Lao Đức Thuận, Vũ Tiến Luyện, Trịnh Văn Hạnh, Lê Huyền Ái Thúy, Trương Bình Nguyên (2014), “Phát lồi nấm ký sinh trùng Cordyceps takaomontana núi Langbiang, Lâm Đồng, Việt Nam”, Kỷ yếu Hội nghị Nấm học: Nghiên cứu ứng dụng khu vực phía nam năm 2014, 111 Thuan Duc Lao, Hiep Dinh Minh, Nguyen Binh Truong, Hoang Duc Nguyen Pham, Thuy Ai Huyen Le (2014), “Supporting for identification of entomopathogenic fungi by molecular analysis on ITS1-5.8s-ITS2 region” Thuan Duc Lao, Hiep Dinh Minh, Nguyen Binh Truong, Hoang Duc Nguyen Pham, Thuy Ai Huyen Le (2014) “The analysis of secondary structure of ITS1-5.8sITS2 region supported the molecular-based methods in entomapathogenic fungi classification” The 10th International Mycological Congress, Bangkok, Thailand 117 PHỤ LỤC: KẾT QUẢ ĐÀO TẠO Luận văn Thạc Sĩ: Số lượng: Tên luận văn: Xây dựng phát sinh loài phân tử hỗ trợ định danh loài nấm thuộc chi cordyceps (họ clavicipitaceae) vùng núi Langbiang, Đà lạt, tỉnh Lâm Đồng Học viên: Vũ Tiến Luyện Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy Nơi đào tạo: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Khóa luận Cử Nhân: Số lượng: Tên sinh viên: Nguyễn Thị Thu Thảo, Nguyễn Thị Bích Thảo, Trịnh Văn Hạnh, Trịnh Hồng Ln, Ngơ Thị Diệp Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Lê Huyền Ái Thúy; ThS Lao Đức Thuận; CN Vũ Tiến Luyện Nơi đào tạo: Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu khoa học Số lượng: Giải thưởng nghiên cứu khoa học: Giải nhì Eureka cấp thành 2015 Nhóm sinh viên: Nguyễn Thị Thu Thảo, Nguyễn Thị Bích Thảo, Trịnh Văn Hạnh, Ngơ Thị Diệp Giảng viên hướng dẫn: ThS Lao Đức Thuận 118