Khảo sát in silico và nghiên cứu cơ sở dữ liệu khoa học trong việc hỗ trợ định danh một số loài nấm thuộc chi pleurotus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT IN SILICO VÀ NGHIÊN CỨU CƠ SỞ DỮ LIỆU KHOA HỌC TRONG VIỆC HỖ TRỢ ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOÀI NẤM THUỘC CHI PLEUROTUS Khoa: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Y dược Giảng viên hướng dẫn: TS Lao Đức Thuận TS Vũ Tiến Luyện LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập trường, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý thầy cô bạn bè ủng hộ từ gia đình Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt q thầy khoa Cơng Nghệ Sinh Học giảng dạy tận tình, truyền đạt cho em kiến thức vững Để thực tập đạt kết tốt, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến TS Lao Đức Thuận, người tận tình hướng dẫn, dạy cho em thêm nhiều kiến thức bổ ích để em hồn thành tốt q trình thực tập Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn trân thành đến TS Vũ Tiến Luyện dành thời gian quý báu để giúp đỡ em thời gian thực tập cho em biết thêm nhiều kiến thức chuyên môn Ngồi ra, khơng thể thiếu giúp đỡ anh chị bạn lab sinh học phân tử Em xin cảm ơn ThS.Thiều Hồng Huệ, bạn Phạm Thị Phương Trinh, bạn Đào Thị Trà My, bạn Vũ Lâm Thông, bạn Trần Kiến Tường quan tâm hỗ trợ em Trong suốt tập vừa qua, em biết cịn non nớt có nhiều thiếu sót thầy bỏ qua sẵn sàng giúp đỡ em nhiều, em vơ biết ơn Em xin cảm ơn gia đình ủng hộ, quan tâm động viên em Lời cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô, anh chị bạn sức khỏe, thành công cơng việc đạt thành tích tốt Em xin chân thành cảm ơn! i DANH MỤC HÌNH ẢNH PHẦN I TỔNG QUAN Hình 1.1 Lồi đại diện cho chi Pleurotus, Pleurotus eryngii Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc vùng gene Tef1 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vùng gene Rpb2 Hình 1.4 Mười hai miền bảo tồn trình tự gene Rpb2 PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 3.1 Kết khảo sát cặp mồi EF595F/EF116OR phần mềm Annhyb… 17 Hình 3.2 Kết BLAST cặp mồi EF595F/EF116OR 18 Hình 3.3 Kết khảo sát cặp mồi fRPB25F/bRPB27.1R phần mềm Annhyb 19 Hình 3.4 Kết BLAST cặp mồi fRPB25F/bRPB27.1R 20 Hình 3.5 Kết khảo sát cặp mồi b6.9F/b11R1 phần mềm Annhyb 21 Hình 3.6 Kết BLAST cặp mồi b6.9F/b11R1 22 Hình 3.7 Cây đơn gene Tef1 xây dựng dựa phương pháp NJ 24 Hình 3.8 Cây đơn gene Tef1 xây dựng phương pháp MP 25 Hình 3.9 Cây đơn gene Tef1 xây dựng dựa phương pháp ML 25 Hình 3.10 Cây đơn gene Rpb2 xây dựng dựa phương pháp NJ 27 Hình 3.11 Cây đơn gene Rpb2 xây dựng phương pháp MP 28 Hình 3.12 Cây đơn gene Rpb2 xây dựng dựa phương pháp ML 28 Hình 3.13 Cây đa gene Tef1 Rpb2 xây dựng dựa phương pháp NJ 30 Hình 3.14 Cây đa gene Tef1 Rpb2 xây dựng dựa phương pháp MP 31 Hình 3.15 Cây đa gene Tef1 Rpb2 xây dựng dựa phương pháp ML 32 ii DANH MỤC BẢNG PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 2.1 Danh mục bảng phần mềm trang web trực tuyến 10 PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 3.1 Bảng thơng số vật lí cặp mồi định danh phân tử 15 Bảng 3.2 Cơ sở liệu 23 Bảng 3.3 Mơ hình tiến hóa 24 iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NCBI National Center for Biotechnology Information Tef1 The Elongation Factor alpha Rpb2 largest subunit of RNA polymerase II NJ Neighbor-Joining MP Maximum parsimony ML Maximum Likelihood RNA Ribonucleic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid BIC Bayesian Information Content BLAST Basic Local Alignment Search Tool iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC HÌNH ẢNH ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM PLEUROTUS 1.1 Đặc điểm chung lịch sử nghiên cứu chi nấm Pleurotus 1.2 Phân loại khoa học 1.3 Các hoạt chất Pleurotus 1.3.1 Vitamin 1.3.2 Polysaccharide 1.3.3 Eryngeolysin 1.4 Ứng dụng y học .5 1.5 Nghiên cứu định danh 1.5.1 Định danh phân tử 1.5.2 Vùng gene Tef1 1.5.3 Vùng gene Rpb2 1.6 Nghiên cứu phát sinh loài 1.6.1 Phả hệ phân tử nghiên cứu phát sinh loài 1.6.2 Các bước nghiên cứu phát sinh loài 1.6.2.1 Bộ liệu dựng phả hệ 1.6.2.2 Sắp gióng cột 1.6.2.3 Dựng phả hệ phân tử TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU 10 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 10 2.1 Khai thác liệu 10 v 2.2 Đánh giá mồi 11 2.3 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 11 2.4 Xây dựng sở liệu .12 2.5 Đồng sở liệu .12 2.6 Dị tìm mơ hình tiến hóa .12 2.7 Phân tích phát sinh lồi phân tử 12 PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 14 KẾT QUẢ KHẢO INSILICO 15 1.1 Kết khảo sát insilico gene định danh phân tử 15 1.2 Kết kiểm tra cặp mồi EF595F/EF116OR .17 1.3 Kết kiểm tra cặp mồi fRPB25F/bRPB27.1R b6.9F/b11R1 .19 XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TỬ 22 CƠ SỞ DỮ LIỆU CỤC BỘ 23 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI 23 4.1 Cây phát sinh phân tử xây dựng trình tự gene Tef1 24 4.2 Cây phát sinh phân tử xây dựng dựa trình tự Rpb2 27 4.3 Cây phát sinh phân tử xây dựng dựa trình tự gene Tef1 Rpb2 30 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm nhóm sinh vật đa dạng, nuôi trồng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực giới Trong đó, chi nấm Pleurotus biết đến lồi nấm có giá trị dinh dưỡng cao, đánh giá cao hương vị ngon, có chứa hàm lượng protein, carbohydrates, khống chất, vitamin cao hàm lượng chất béo thấp Một số loài nấm thuộc chi Pleurotus như: Pleurotus florida, Pleurotus ostreatus, trồng nhiều nước ta Những năm gần đây, nghiên cứu cho thấy chi Pleurotus cịn có tiềm ứng dụng y học lồi thuộc chi nấm có khả sinh tổng hợp hoạt chất giúp giảm cholesterol máu, kháng khuẩn kháng u Loài đại diện cho chi, Pleurotus eryngii loài nấm quan tâm nghiên cứu nhiều cơng nhận nguồn cung cấp chất chống oxy hóa chúng chứa thành phần có lợi chất chuyển hóa thứ cấp bảo vệ chống lại tác hại trình oxy hóa Việc phát hàm lượng dinh dưỡng cao loại nấm ăn protein, carbohydrate, vitamin, canxi sắt, với kết hợp hợp chất hoạt tính sinh học sinh lý có lợi cho sức khỏe người, nâng cao giá trị chữa bệnh chúng năm gần Ngoài Pleurotus eryngii, loài khác thuộc chi Pleurotus như: Pleurotus otreatus, Pleurotus djamor, Pleurotus dryinus chứng minh có khả tổng hợp hợp chất chứa hoạt tính sinh học Vì có tiềm y dược cao nên việc xác định loài chi cần thiết Hiện nay, việc định danh số loài nấm thuộc chi Pleurotus chủ yếu dựa vào phân loại hình thái Tuy nhiên phương pháp gặp vài khó khăn ảnh hưởng môi trường dẫn đến thay đổi đặc điểm hình thái hình dạng, màu sắc, kích thước nấm Mặt khác, trường hợp mẫu nấm sau thu nhận khơng cịn nguyên vẹn ảnh hưởng đến việc định danh hình thái khơng xác Vì thế, nhiều năm trở lại đây, ngồi phương pháp định danh hình thái nhà nghiên cứu áp dụng thêm phương pháp định danh phân tử Với mục đích nghiên cứu phân tích đặt điểm hỗ trợ định danh loài nấm thuộc chi Pleurotus, đề tài: “Khảo sát in silico nghiên cứu sở liệu khoa học việc hỗ trợ định danh số loài nấm thuộc chi Pleurotus” thực Đề tài sử dụng vùng gene Tef1 Rpb2 làm đối tượng nghiên cứu, gồm mục tiêu sau: (1) Thu nhận trình tự vùng gene Tef1 Rpb2, (2) Thu nhận cặp mồi số loài nấm thuộc chi Pleurotus, (3) Đánh giá thông số vật lý kiểm tra độ đặc hiệu mồi, (4) Xây dựng phả hệ phân tử để xác định mối quan hệ loài xác định mối quan hệ tương quan loài thuộc chi Pleurotus PHẦN I: TỔNG QUAN KR493224.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 91 91 GU139130.1 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 85 KU612982.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC4234 60 KU612984.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 60 KR493219.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 60 GU139139.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 75 GU139140.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 KR493218.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 58 GU186800.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 66 GU186801.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 96 71 KU612986.1 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 KU612974.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 100 96 KU612975.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 93 GU186804.1 Pleurotus ostreatus isolate WC739 KU612987.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 99 KR493227.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 KU612989.1 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 KJ143924.1 Ganoderma boninense strain WD 2028 99 Out group JX029974.1 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Hình 3.8 Cây đơn gene Tef1 xây dựng phương pháp MP KU612984.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 92 KU612982.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC4234 KR493224.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 74 GU139130.1 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 KR493218.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 92 GU139140.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 84 52 KR493219.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 GU139139.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 GU186800.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 98 92 KU612986.1 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 GU186801.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 99 KU612974.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 98 KU612975.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 GU186804.1 Pleurotus ostreatus isolate WC739 100 KR493227.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 KU612987.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 KU612989.1 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 KJ143924.1 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 JX029974.1 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Out group Hình 3.9 Cây đơn gene Tef1 xây dựng dựa phương pháp ML 25 Cây phả hệ phân tử đơn gene xây dựng dựa vùng gene Tef1 phần mềm Mega 11 Ba phương pháp chủ yếu sử dụng nghiên cứu để xây dựng phả hệ phân tử Neighbor-Joining (NJ), Maxium Parsimony (MP) Maxium Likelihood (ML) Kết xây dựng phả hệ phân tử đánh giá dựa số bootstrap ba NJ, MP ML với giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần Từ kết định danh, xây dựng phả hệ phân tử đơn gene cho thấy có tương đồng vị trí cụm Nhóm ngoại phân tách riêng biệt khơng có hỗ trợ bootstrap với nhóm nội Nhóm ngoại gồm Ganoderma boninense Ganoderma lingzhi hỗ trợ với giá trị bootstrap NJ, MP ML 100/99/100 chứng tỏ có độ tin cậy cao Pleurotus eryngii var eryngii, Pleurotus eryngii var ferulae Pleurotus neibrodensis phân thành cụm khác NJ ML Trong đó, cụm Pleurotus eryngii var eryngii hỗ trợ giá trị bootstrap 93/92, cụm Pleurotus eryngii var ferulae hổ trợ giá trị bootstrap 83/84 cụm Pleurotus neibrodensis hỗ trợ giá trị bootstrap 68/93 Ở MP, Pleurotus eryngii var eryngii Pleurotus eryngii var ferulae phân thành cụm Ngoài ra, Pleurotus eryngii var tuoliensis, Pleurotus ostreatus, Pleurotus dryinus phân thành cụm riêng biệt với giá trị bootstrap 100/96/98, 99/99/100 100/100/99 Tuy nhiên nhóm nội chưa phân clade rõ ràng NJ, MP, ML Dựa kết phả hệ phân tử NJ, MP ML có tương đồng mặt phân loài 26 Cây phát sinh phân tử xây dựng dựa trình tự Rpb2 4.2 KU613021.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04234 96 KU613026.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 GU186797.1 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 86 KU613025.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 GU186825.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 GU186824.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 80 81 72 63 KU613015.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 KU613016.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 GU186813.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 70 99 68 99 GU186814.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 KU613028.1 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 KU612994.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 84 KU612995.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 KU613031.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 80 81 GU186817.1 Pleurotus ostreatus isolate WC739 KU613032.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 KU613038.1 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 KJ143964.1 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 JX029978.1 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Out group Hình 3.10 Cây đơn gene Rpb2 xây dựng dựa phương pháp NJ 27 88 88 96 KU613025.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 GU186797.1 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 KU613021.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04234 KU613026.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 99 88 GU186824.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 KU613015.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 69 73 95 KU613016.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 GU186825.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 89 100 GU186813.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 KU613028.1 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 99 GU186814.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 KU612994.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 100 100 98 KU612995.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 GU186817.1 Pleurotus ostreatus isolate WC739 KU613032.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 100 KU613031.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 KU613038.1 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 KJ143964.1 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 Out group JX029978.1 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Hình 3.11 Cây đơn gene Rpb2 xây dựng phương pháp MP KU613026.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 97 KU613021.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04234 KU613025.1 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 99 GU186797.1 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 GU186825.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 GU186824.1 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 82 99 87 75 KU613015.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 KU613016.1 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 GU186814.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 97 99 53 84 GU186813.1 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 KU613028.1 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 KU612994.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 100 KU612995.1 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 KU613031.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 92 98 GU186817.1 Pleurotus ostreatus isolate WC739 KU613032.1 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 KU613038.1 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 KJ143964.1 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 JX029978.1 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Out group Hình 3.12 Cây đơn gene Rpb2 xây dựng dựa phương pháp ML 28 Cây phả hệ phân tử đa gene xây dựng dựa vùng gene Rpb2 xây dựng phần mềm Mega 11 Ba phương pháp chủ yếu sử dụng nghiên cứu để xây dựng phả hệ phân tử Neighbor Joining (NJ), Maxium Parsimony (MP) Maxium Likelihood (ML) Kết xây dựng phả hệ phân tử đánh giá dựa số bootstrap ba NJ, MP ML với giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần Từ kết định danh, xây dựng phả hệ phân tử đơn gene cho thấy có tương đồng vị trí cụm Nhóm ngoại phân tách riêng biệt khơng có hỗ trợ bootstrap với nhóm nội Nhóm ngoại gồm Ganoderma boninense Ganoderma lingzhi hỗ trợ với giá trị bootstrap NJ, MP ML 100, 100, 100 chứng tỏ có độ tin cậy cao Pleurotus eryngii var eryngii, Pleurotus eryngii var ferulae Pleurotus neibrodensis phân thành cụm khác NJ, MP ML Trong đó, cụm Pleurotus eryngii var eryngii hỗ trợ giá trị bootstrap 96/96/97, cụm Pleurotus eryngii var ferulae hổ trợ giá trị bootstrap 81/69/99 cụm Pleurotus neibrodensis hỗ trợ giá trị bootstrap 99/100/84 Ngoài ra, Pleurotus eryngii var tuoliensis, Pleurotus ostreatus, Pleurotus dryinus phân thành cụm riêng biệt với giá trị bootstrap 84/100/100, 80/100/92 100/100/99 Tuy nhiên nhóm nội chưa phân clade rõ ràng NJ, MP, ML Dựa kết phả hệ phân tử NJ, MP ML có tương đồng mặt phân loài 29 Cây phát sinh phân tử xây dựng dựa trình tự gene Tef1 4.3 Rpb2 95 82 100 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC4234 98 63 75 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 83 51 91 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 98 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 100 100 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 100 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 100 98 Pleurotus ostreatus isolate WC739 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Out group Hình 3.13 Cây đa gene Tef1 Rpb2 xây dựng dựa phương pháp NJ 30 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC4234 99 79 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 83 98 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 60 62 75 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 87 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 100 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 100 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 100 100 97 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 Pleurotus ostreatus isolate WC739 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 100 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 Out group Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Hình 3.14 Cây đa gene Tef1 Rpb2 xây dựng dựa phương pháp MP 31 25 99 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC4234 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04219 Pleurotus eryngii var eryngii isolate WC984 52 23 Pleurotus eryngii var eryngii strain CCMSSC04218 65 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04224 Pleurotus eryngii var ferulae strain CCMSSC04229 97 41 71 87 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC929 Pleurotus eryngii var ferulae isolate WC933 Pleurotus nebrodensis strain CCMSSC00646 Pleurotus nebrodensis isolate WC777 99 100 Pleurotus nebrodensis isolate WC979 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03234 97 100 Pleurotus eryngii var tuoliensis strain CCMSSC03254 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00771 100 98 Pleurotus ostreatus isolate WC739 Pleurotus ostreatus strain CCMSSC00389 Pleurotus dryinus strain CCMSSC00762 Ganoderma boninense strain WD 2028 100 Ganoderma lingzhi voucher Cui9166 Out group Hình 3.15 Cây đa gene Tef1 Rpb2 xây dựng dựa phương pháp ML Cây phả hệ phân tử đa gene xây dựng dựa vùng gene Tef1 Rpb2 xây dựng phần mềm Mega 11 Ba phương pháp chủ yếu sử dụng nghiên cứu để xây dựng phả hệ phân tử Neighbor Joining (NJ), Maxium Parsimony (MP) Maxium Likelihood (ML) Kết xây dựng phả hệ phân tử đánh giá dựa số bootstrap ba NJ, MP ML với giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần Từ kết định danh, xây dựng phả hệ phân tử đơn gene cho thấy có tương đồng vị trí cụm Nhóm ngoại phân tách riêng biệt khơng có hỗ trợ bootstrap với nhóm nội Nhóm ngoại gồm Ganoderma boninense Ganoderma lingzhi hỗ trợ với giá trị bootstrap NJ, MP ML 100/100/100 chứng tỏ có độ tin cậy cao 32 Pleurotus eryngii var eryngii, Pleurotus eryngii var ferulae phân thành cụm khác NJ, MP ML Trong đó, cụm Pleurotus eryngii var eryngii hỗ trợ giá trị bootstrap 100/99/99, cụm Pleurotus eryngii var ferulae hổ trợ giá trị bootstrap 91/87 cụm Pleurotus neibrodensis hỗ trợ giá trị bootstrap 100/100/100 Riêng loài Pleurotus nebrodensis CCMSSC00646 bị phân sai cụm ba NJ, MP, ML Ngoài ra, Pleurotus eryngii var tuoliensis, Pleurotus ostreatus, Pleurotus dryinus phân thành cụm riêng biệt với giá trị bootstrap 100/100/100, 100/100/100 100/100/97 Dựa kết phả hệ phân tử NJ, MP ML có tương đồng mặt phân loài So sánh với đa gene nghiên cứu nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010 Zhao cs., 2016 cho thấy kết có điểm tương đồng: - Cây phân thành cụm tương đồng vị trí ở: cụm Pleurotus eryngii var tuoliensis hỗ trợ giá trị bootstrap 100, so với nghiên cứu nhóm tác giả Zhao cs., 2016 100; cụm Pleurotus ostreatus hỗ trợ giá trị bootstrap 100, so vơi nghiên cứu nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010 Zhao cs., 2016 99 100; cụm Pleurotus dryinus hỗ trợ giá trị bootstrap 97, so với nghiên cứu nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010 Zhao cs., 2016 72 100 - Cụm Pleurotus eryngii var eryngii Pleurotus eryngii var ferulae bị đảo vị trí so với nghiên cứu nhóm nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010 Zhao cs., 2016 - Cụm Pleurotus nebrodensis hỗ trợ với giá trị bootstrap 100, so với nghiên cứu nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010 100/100 So với nghiên cứu nhóm tác giả Zhao cs., 2016, thấy Pleurotus nebrodensis CCMSSC00646 bị phân sai cụm với Pleurotus eryngii var ferulae 33 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài thành công số phương diện như: − Thu thập liệu vùng gene Tef1 Rpb2 nhằm khuếch đại vị trí vùng gene mục tiêu, giải trình tự hiệu chỉnh trình tự − Xây dựng thành công phả hệ phân tử đơn gene phương pháp: NJ, ML, MP để giúp cho việc định danh mẫu nấm thuộc chi Pleurotus Tuy nhiên, đề tài số hạn chế như: − Xây dựng chưa thành công phả hệ phân tử đa gene Tef1 Rpb2 phương pháp NJ, MP ML − Kết phân tích phả hệ phân tử đa gene Tef1 Rpb2 chưa phù hợp tương đồng với kết nghiên cứu tham khảo nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010; Zhao cs., 2016; Do phân cụm sai loài Pleurotus nebrodensis CCMSSC00646 KIẾN NGHỊ Trong thời gian tới, số hướng nghiên cứu tiếp tục cho đề tài kiến nghị: − Tiến hành xây dựng lại phát sinh phân tử đa gene dựa trình tự gene Tef1 Rpb2 − Tiến hành định danh phân tử dựa trình tự vùng gene ITS, nrLSU, nrSSU, Tub − Tiến hành thêm nghiên cứu chức gene liên quan đến hoạt tính sinh học diện lồi nấm thuộc chi Pleurotus 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Ngơ Thị Phương Dung, Đặng Bích Tuyền Phạm Hồng Quang (2011) Đặc tính hình thái, di truyền điều kiện nuôi cấy meo giống Nấm Bào Ngư Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tr.146-156 [2] Hồ Minh Tùng (2015) Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa cấu trúc polysaccharide tách chiết từ nấm Đùi gà (pleurotus eryngII) [3] Lê Xuân Thám (2010), Nấm bào ngư, NXB Khoa học kỹ thuật [4] Nguyễn Thị Bích Thùy, Ngơ Xn Nghiễn, Lê Văn Vẻ, Nguyễn Thị Luyện, Nguyễn Thị Huyền Trang Phan Thu Huyền (2019) Sinh trưởng hệ sợi hình thành thể nấm sò vua Pleurotus eryngii (DC.: Fr.) chủng E2 Bản B Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 61(7) [5] Nguyễn Thị Bích Hằng Ngô Thị Hồng Vân (2015) Breeding and raising Pleurotus citronopileatus in Da Nang city UED Journal of Social Sciences, Humanities and Education, 5(4B), tr.9-15 [6] Liễu Như Ý Trần Nhân Dũng (2012) Đa dạng di truyền số loại nấm ăn dựa trình tự ITS (internal transcribed spacer) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (22b), tr.18-25 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [7] Bresinsky, A., Fischer, M., Meixner, B., & Paulus, W (1987) Speciation in Pleurotus Mycologia, 79(2), 234-245 [8] Cao, Y., Wu, S H., & Dai, Y C (2012) Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi” Fungal Diversity, 56(1), 49-62 [9] Cohen, R., Persky, L., & Hadar, Y (2002) Biotechnological applications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus Applied microbiology and biotechnology, 58(5), 582-594 [10] Dai, Y C., Zhou, L W., Hattori, T., Cao, Y., Stalpers, J A., Ryvarden, L., & Wu, S H (2017) Ganoderma lingzhi (Polyporales, Basidiomycota): the scientific binomial for the widely cultivated medicinal fungus Lingzhi Mycological Progress, 16(11), 1051-1055 36 [11] De Gioia, T., Sisto, D., Rana, G L., & Figliuolo, G (2005) Genetic structure of the Pleurotus eryngii species-complex Mycological Research, 109(1), 71–80 [12] Estrada, A E R., del Mar Jimenez-Gasco, M., & Royse, D J (2010) Pleurotus eryngii species complex: sequence analysis and phylogeny based on partial EF1α and RPB2 genes Fungal Biology, 114(5-6), 421-428 [13] Feeney, M J., Dwyer, J., Hasler-Lewis, C M., Milner, J A., Noakes, M., Rowe, S., & Wu, D (2014) Mushrooms and health summit proceedings The Journal of Nutrition, 144(7), 1128S-1136S [14] Golak-Siwulska I, Kaluzewicz A, Spizewski T, et al Bioactive compounds and medicinal properties of Oyster mushrooms (Pleurotus sp) Folia Hortic 2018; 30(2), 191–201 [15] Guzmán, G (2000) Genus Pleurotus (Jacq.: Fr.) P Kumm (Agaricomycetideae): diversity, taxonomic problems, and cultural and traditional medicinal uses International Journal of Medicinal Mushrooms, 2(2) [16] He, X L., Wu, B., Li, Q., Peng, W H., Huang, Z Q., & Gan, B C (2016) Phylogenetic relationship of two popular edible Pleurotus in China, Bailinggu (P eryngii Var tuoliensis) and Xingbaogu (P eryngii), determined by ITS, RPB2 and EF1α sequences Molecular biology reports, 43(6), 573-582 [17] Lewinsohn, D., Nevo, E., Hadar, Y., Wasser, S P., & Beharav, A (2000) Ecogeographical variation in the Pleurotus eryngii complex in Israel Mycological Research, 104(10), 1184-1190 [18] Liu, Y J., Whelen, S., & Hall, B D (1999) Phylogenetic relationships among ascomycetes: evidence from an RNA polymerse II subunit Molecular Biology and Evolution,16(12), 1799–1808 [19] Raman, J., Jang, K Y., Oh, Y L., Oh, M., Im, J H., Lakshmanan, H., & Sabaratnam, V (2021) Cultivation and nutritional value of prominent Pleurotus spp.: An overview Mycobiology, 49(1), 1-14 [20] Velez, M E V., da Luz, J M R., da Silva, M D C S., Cardoso, W S., de Souza Lopes, L., Vieira, N A., & Kasuya, M C M (2019) Production of 37 bioactive compounds by the mycelial growth of Pleurotus djamor in whey powder enriched with selenium LWT, 114, 108376 [21] Zhang, B., Li, Y., Zhang, F., Linhardt, R J., Zeng, G., & Zhang, A (2020) Extraction, structure and bioactivities of the polysaccharides from Pleurotus eryngii: a review International journal of biological macromolecules, 150, 13421347 [22] Zhao, M., Zhang, J., Chen, Q., Wu, X., Gao, W., Deng, W., & Huang, C (2016) The famous cultivated mushroom Bailinggu is a separate species of the Pleurotus eryngii species complex Scientific Reports, 6(1), 1-9 TRANG WEB TRỰC TUYẾN [23] https://ultimate-mushroom.com/edible/4-pleurotus-eryngii.html 38 39 ... nghiên cứu áp dụng thêm phương pháp định danh phân tử Với mục đích nghiên cứu phân tích đặt điểm hỗ trợ định danh loài nấm thuộc chi Pleurotus, đề tài: ? ?Khảo sát in silico nghiên cứu sở liệu khoa học. .. dựa cơng trình nghiên cứu nhóm tác giả Rodriguez Estrada cs., 2010 kết hợp với trình tự lồi nấm thuộc chi Pleurotus ngân hàng gene Genebank từ làm sở tham chi? ??u hỗ trợ định danh loài nấm thuộc chi. .. tiềm y dược cao nên việc xác định loài chi cần thiết Hiện nay, việc định danh số loài nấm thuộc chi Pleurotus chủ yếu dựa vào phân loại hình thái Tuy nhiên phương pháp gặp vài khó khăn ảnh hưởng