hỗ trợ định danh chi nấm cantharellus dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrlsu nrssu

Việc phân loại và định danh nấm Cantharellus đã được nghiên cứu kĩ lưỡng ở nhiều nơi trên thế giới dựa trên một số khóa phân loại của Corner 1966, Largent 1986, Rolf Singer 1985 và chủ y

Đặc điểm chung và thành phần loài

Họ Cantharellaceae gồm 2 chi lớn là Cantharellus và Craterellus, 2 chi nấm này có đặc điểm hình thái khá giống nhau chúng có mũ khá rõ ràng ở thân cây hoặc có hình kèn trumpet Các bề mặt mang bào tử của chúng xuất hiện ở mặt dưới nắp và từ mịn đến nhăn Tuy nhiên, ở Cantharellus có độ dày của thịt ở phần tai kèn lớn hơn so với Craterrellus (Kuo M 2015)

Tên Cantharellus Adans : Fr có nguồn gốc từ tiếng pháp “chanterelle” mà chúng ta tìm thấy trong các hồ sơ được công vào giữa thế kỷ 17 (Bauhin và Cherler 1651) Theo Eyssartier và Buyck (2000), tên “chanterel” được nhà thực vật học người pháp Adanson (1763) sử dụng ở cấp độ chung Khái niệm về tên chi của ông được thông qua và phê chuẩn bởi Fries (1821) với bản chỉnh hình được Latin hóa như hiện tại Như đại diện cho chi chanterelle, từ “cibarius” của Cantharellus cibarius có nguồn gốc từ tiếng latin là “thực phẩm” nên có thể dịch cả câu là “chén thực phẩm”

Thực tế, hầu hết các loài nấm thuộc chi nấm Cantharellus đều có thể ăn được, có giá trị kinh tế cao và góp vai trò quan trọng trong tự nhiên Chi nấm này được

SVTH: Ngô Văn Tài Page 3 tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như: Châu Á, Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ (Danell et al 1999, Dunham et al 2003) Chúng là loài nấm Mycorrhizal, loài nấm cộng sinh với rễ thực vật, do đó rất khó để nuôi trồng và chủ yếu là được thu thập trong tự nhiên Cantharellus có giá trị kinh tế cao nhờ hàm lượng protein, chất béo, khoáng chất, vitamin và một số nutraceuticals trong thể quả của chúng điều đó dẫn đến nhiều nghiên cứu về sinh thái, sinh lý học và cây phát sinh loài của chi nấm này (Danell et al 1994; Dunham et al 2003; Eyssartier et al 2009; Buyck and

Hofstetter 2011; Tian et al 2012; Buyck et al 2013)

Theo nguồn thống kê eElurikkus (https://elurikkus.ee/, chủ yếu ở Estonia, châu Âu) có 325 loài thuộc chi Cantharellus đã được mô tả

Hình 1.2 Hình biểu diễn tổng số loài thuộc chi Cantharellus đã được công bố theo nguồn thống kê eElurikkus

Ngoài ra nhiều báo cáo nghiên cứu của các nhóm tác giả về công tác định danh loài Nấm Cantharellus cũng đã được công bố (Corner 1966; Danell 1994a;

Feibelman et al., 1997; Pegler et al., 1997; Persson và Mossberg 1997; Watling and Turnbull 1998; Dahlman et al., 2000; Eyssartier và Buyck 2001,2011,2013) Có hơn 70 loài “Chanterellus thực” đã được công bố và nhiều loài khác vẫn chưa được đặt tên Hầu hết các loài thuộc chi Cantharellus được tìm thấy trên các địa chất có rừng với cây chủ ectomycorrhizal (một hình thức của mối quan hệ cộng sinh xảy ra giữa một symbiont nấm và rễ của các loài thực vật khác nhau)

SVTH: Ngô Văn Tài Page 4

Phân loại khoa học

Theo Kirk và cộng sự 2008 thì chi nấm Cantharellus được phân loại như sau:

Tiềm năng ứng dụng

Các phân tích sinh hóa cho thấy Cantharellus có chứa rất thành phần dinh dưỡng như: protein, chất béo, khoáng chất (Ca, Fe, P, Po, Mg, ), vitamin (B2, B3, B5, B6, D và C) Ngoài ra, một số loài có chứa nutraceuticals trong thể quả của chúng

Carbohydrates: Carbohydrate xuất hiện trong nấm như 1 bộ phận của thành tế bào polysaccharides dưới dạng các polysaccharides tự do, oligosacccharides, monosaccharides và đường rượu Tổng lượng carbohydrate trong nấm khoảng từ 9.94 mg/g ở C isabellinus – 26.5 mg/g ở C minor (Kumari et al 2011) Barros và cộng sự (2008) báo cáo oligosaccharide phổ biến nhất, tức là trehalose được tìm thấy trong quả thể của C cibarius với hàm lượng 3.12 g/100 g

Protein và amino acids: Lượng protein chứa trong các loài nấm thường rất lớn (Ilievska và Petrovska 2000) và protein từ nấm được cho là có chất lượng tương đương với protein từ động vật (Longvah và Deosthale, 1998) Lượng protein trong nấm Cantharellus cibarius được đánh giá là khá cao (1.06 mg/g) với lượng đạm lên tới 34.17% (Pandey và Budhathoki, 2017), lượng acid glutamic là 15.6 μg/mg và chứa lượng nhỏ methionine (1.2 μg/mg) khối lượng khô

Acid béo: So với động vật nấm có hàm lượng chất béo rất thấp Lượng chất béo dao động từ 1.1-8.3% trọng lượng khô và 0.1-0.3% trọng lượng tươi

SVTH: Ngô Văn Tài Page 5

Cantharellus cibarius chứa linoleic và oleic acid trong khoảng 0.48%, các chất béo bão hòa chiếm 39% (Kumari, 2011)

Hoạt tính chống oxy hóa và các hợp chất phenolic: Nấm có chứa các hợp chất polyphenolic được công nhận là một chất chống oxy hóa mạnh do khả năng đào thải các electron tự do của chúng (Hirano et al., 2001) Cantharellus cibarius có sự hiện diện của các hợp chất (3-, 4-, and 5-O-caffeoylquinic acid, caffeic acid, p-coumaric acid và rutin) Màu hồng đỏ của C cinnabarinus và cam của C friesii được tạo thành gần như hoàn toàn dựa trên canthaxanthin, một sắc tố được tìm thấy trong cá hồi và lông chim hạc (Gill và Steglich, 1987) Hợp chất này có khả năng bảo vệ các mô của con người khỏi tác động của các gốc oxy hóa (Chen và Tappel, 1996)

Carotenoids (hay beta carotene): Beta carotene là hợp chất chính tạo nên màu vàng của nhiều loài nấm Cantharellus (Arpin và Fiasson 1971; Gill và Steglich

1987; Mui et al 1998) các chanterelle vàng, Cantharellus cinnabarius và Cantharellus minor chứa beta-carotene và lượng nhỏ các carotenoid khác (Gill và

Vitamin: Những nghiên cứu về nấm Cantharellus đã chỉ ra rằng chúng là nguồn cung cấp vitamin B như niacin, flavin và pyridoxine (Solomko và Eliseeva, 1988) Nấm Cantharellus cũng là nguồn giàu vitamin A và D (Pilz et al 2003)

Hawksworth và cộng sự (1983) báo cáo rằng quả thể của nấm Cantharellus cibarius là một nguồn cung cấp vitamin A dồi dào Các loài nấm bậc cao chứa lượng vitamin B1 và B2 có thể cung cấp tới hơn 40% nhu cầu hàng ngày của con người (Kelley 1997) Cantharellus cibarius có chứa hàm lượng vitamin B1 là 0.3 mg/100g và B2 là 0.12 mg/100g (Caglarirmak et al 2002).

Đặc điểm phân bố của chi nấm Cantharellus

Chi nấm Cantharellus có lịch sử phân loại phức tạp và rộng rãi Theo Index

Fungorum là một dự án quốc tế để lập chỉ mục tất cả các tên chính thức trong ngành Nấm đã liệt kê được hơn 500 tên khoa học đã được áp dụng cho chi Cantharellus, mặc dù số lượng tên khoa học phù hợp chỉ dưới 100 loài (Pilz et al., 2003) Ngoài

SVTH: Ngô Văn Tài Page 6 các loài có mối quan hệ đồng loài, nhiều loài đã được chuyển sang các chi khác như

Afrocantharellus, Arrhenia, Craterellus, Gomphus, Hygrophoropsis và

Pseudocraterellus Phương pháp phân tích phát sinh loài phân tử giúp cung cấp thông tin mới về các mối quan hệ họ hàng giữa các hệ nấm chanterelle Sau đây là các loài thuộc chi Cantharellus:

In Europe, seven commonly found species of Cantharellus are known: C amethysteus, C cibarius, C pallens, C pseudominimus, C romagnesianus, C subpruinosus, and C friesii Among these, C cibarius is the most widespread and is commonly referred to as the yellow chanterelle, known for its trumpet shape and yellow to orange color Notably, C friesii and C cibarius var amethysteus are more prevalent in northern regions of Europe.

Nam châu Âu C pallens là loài nấm màu xanh xám (pale), mũ nấm gấp cuộn lai, với hình thức sống là ectomycorrhizal quan hệ mật thiết với các cây gỗ thân gỗ (cây phì, hazels) và cây sồi (oaks) Eyssartier và Buyck (1999a) cũng đã mô tả 2 loài khác là C pseudominimus và C romagnesianu Năm 2000, loài Cantharellus subpruinosus đã được mô tả đầu tiên ở Pháp là loài thuộc họ Cantharellaceae bởi nhóm tác giả Eyssartier G và Buyck B, được tìm thấy trong hệ sinh thái rêu kết hợp với rừng đang thời kỳ rụng lá và cây vân sam (spruce)

Africa: C congolensis, C longisporus, C pseudocibarius, C platyphyllus, C tanzanicus, C sublaevis, C miomboensis, C luteopunctatus, C humidicolus, C gracilis, C cibarioides, C afrocibarius Ở châu Phi, một vài loài bao gồm C congolensis, C longisporus, C pseudocibarius và C platyphyllus đã được mô tả từ rất lâu (Corner 1966) Việc phân loại các loài nấm đã được nghiên cứu bởi các nhà nghiên cứ nấm khác nhau (Harkonen et al., 1995; Buyck et al., 1996, 2000; Buyck và Eyssartier 1999b;

Eyssartier và Buyck 2001, Buyck và Hofstetter 2012) Các nhóm tác giả đã dựa trên các tiêu chí đặc điểm hình thái và phân tử để phân loài các loài thuộc chi

Cantharellus ở châu Phi Việc mô tả rõ đặc điểm hình thái và vẽ minh họa một cách chi tiết hình thái cung cấp thông tin tổng quan cho 5 loài từ khu rừng nhiệt đới Zambezian savannah ở châu Phi: C afrocibarius, C gracilis, C humidicolus, C miomboensis and C tanzanicus

SVTH: Ngô Văn Tài Page 7

Australia: C ochraceoravus Grgurinovic, C concinnus Berk (C cibarius var australiensis), C viscosus Berk, C lilacinus

Eyssartier và Buyck (2001) đã tổng quan được 17 loài Australian chanterelle có thể phân bố và công trình đã kết luận chỉ 3 tên loài là loài chanterelles thật ở châu Úc Cantharellus lilacinus là loài thuộc chi nấm Cantharellus, được mô tả đầu tiên vào năm 1919 bởi các nhà thực vật học là botanists John Burton Cleland và Edwin Cheel và tìm thấy ở châu Úc

Central and South America: C cibarius, C cinnabarinus, C lateritius, C cibarius, C atrolilacinus, C cascadensis, C pleurotoides, C californicus, C texensis, C tenuithrix, C tabernensis, C subalbidus, C spectaculus, C quercophilus, C protectus, C phasmatis, C lewisii, C guyanensis, C formosus, C flavus, C appalachiensis, C altipes

Cantharellus guyanensis được mô tả đầu tiên bởi Camille Montagne vào năm

1854 Cantharellus formosus được biết đến là nấm ăn được mọc từ các vùng Pacific Northwest ở miền Bắc nước Mỹ, được chứng minh là tương đồng hình thái với loài

C cibarius ở Châu Âu vào năm 1990 Nấm hình dạng phểu, nhiều thịt, có màu vàng đến cam Ở phần dưới của mũ nấm mềm nhẵn, mùi vị ngọt, thơm dễ chịu Mọc đơn lẻ đến từng cụm trên các rừng cây dạng có quả nón (tùng bách) Nấm mọc từ tháng

7 đến tháng 12 Một vài loài thuộc chi Cantharellus đã được công bố phân bố ở miền Trung và miền Nam nước Mỹ và phía tây Ấn Độ và các vùng lân cận bao gồm

C cibarius và C cinnabarinus Vào năm 2000, Lorelei Norvell đã thu thập được các loài C lateritius và C cibarius ở các khu rừng sồi trên núi Talamanca ở Costa Rica Các nhóm nghiên cứu còn tìm được thêm các loài Cantharellus mới đã được thu thập trước đó bởi Halling (Halling và Mueller, 2000) và được đặt tên là C atrolilacinu C cascadensis được tìm thấy ở American Pacific Northwest (Dunham et al 2003) Henkel et al (2006) cũng đã mô tả loài mới là C.pleurotoides từ

Guyana Gần đây, Arora and Dunham (2008) đã công bố thêm loài mới là C californicus, mộc ở các khu rừng sồi ở California, USA Ở phía Bắc nước Mỹ trên các cây gỗ tùng phát hiện nấm thuộc chi nấm Cantharellus có màu hơi đỏ hồng,

SVTH: Ngô Văn Tài Page 8 nhỏ C.texensissp nov được tìm thấy ở Gulf của Mexico stages và eastern United

States, là loài nấm mới có hình dạng giống C cinnabarinus (Buyck et al., 2011) Cantharellus subalbidus thường được tìm thấy ở vùng Tây Bắc nước Mỹ, tuy giống với các loại Cantharellus khác ngoại trừ màu sắc của nấm có màu trắng và các vết thâm có màu cam ở thân (Plischke et al 2014) C subalbidus có thể mang dạng sống cộng sinh với các loài cây thân gỗ như thông, cây độc cần, Douglas-fir và Pacific madrone (Trudell, S et al., 2006; Wood et al., 2010; Arora and David

1986) C subalbidus được tìm thấy phổ biến ở các khu rừng già hơn là ở các hệ rừng sinh thái trẻ (Dunham et al., 2006) Cantharellus appalachiensis là loài nấm ăn được phổ biến của chi Cantharellus, được mọc chủ yếu ở vùng đông bắc nước

C appalachiensis, tên khác là Appalachian Mountains, sống cộng sinh trong rừng gỗ cứng C tabernensis được mô tả năm 1996, thường mọc trong rừng hỗn hợp thông và gỗ cứng, có mối liên hệ mật thiết với cây Pinus elliottiitrees C altipes và C lewisii được phát hiện năm 2011, sống cộng sinh với cây gỗ cứng Năm 2013, C phasmatis và C flavus được tìm thấy ở Bắc Mỹ.

Asia: C subcibarius, C cibarius, C lateritius, C cerinoalbus, C subamethysteus, C vaginatus, C zangii

Phương pháp phân loại cổ điển

Đây là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng cấu trúc thể quả, hình thái bào tử, cơ chế giải phóng bào tử, màu sắc và môi trường sống của nấm để phục vụ cho định danh

Chi Cantharellus Fries được mô tả đầu tiên vào năm 1821 trong cuốn

“Systema Mycologicum” (Fries, 1821-1832) Hạn chế lớn nhất trong nghiên cứu của Fries đó việc thiếu minh hoạ cụ thể hình thái của nấm, đây là yếu tố vẫn phải được xem xét Smith và Morse (1947) và Smith (1968) đã nghiên cứu bằng phương pháp định danh hình tháo ở mức hiển vi giúp việc nhận biết dễ dàng hơn và phân biệt giữa hai loài Craterellus ở phía tây và đông Bắc Mỹ, Cr tubaeformis và Cr infundibuliformis Redhead (1979) đã công bố về vấn đề cần phải xem xét, ông cho rằng Smith (1968) đã dùng các đặc điểm không nhất quán để phân biệt các cặp loài ở phía đông so với phía tây Bắc Mỹ và cũng với tên loài là Cr infundibuliformis là không có sẵn, bởi vì nó được coi là đồng loài với Cr tubaeformis Một số nhà nấm học khác (Donk, 1964; Corner, 1966; Petersen, 1971) đã đặt họ Cantharellaceae với

SVTH: Ngô Văn Tài Page 10 họ Clavariaceae trong Aphyllophorales Corner (1966) đã tiến hành kết hợp định danh hình thái dựa trên đặc điểm vĩ mô và vi mô (mức kính hiển vi) của Cantharellaceae và chia họ này thành ba chi viz Cantharellus, Craterellus và một chi mới Pseudocaterellus, bao gồm 7 loài mới; Cantharellus cuticulatus, C subcibarius, C formosus, C ianthinus, C pudorinus, Craterellus sordidus và Cr reniformis Chi mới được mô tả Pseudocaterellus (Corner et al., 1966) của Cantharellaceae đã được chứng minh bằng sự phát triển thể quả và có vách ngăn thứ cấp của sợi nấm tramal như để phân biệt với các chi khác, tách biệt với chi

Cantharellus (với hình thái thể quả và clamp của nấm phát triển tương tự, nhưng lại không có vách ngăn thức cấp của sợi nấm) Các nghiên cứu hầu hết đều kết luận rằng như mọi loại kích thước thể quả đều lớn trung bình đến màu sắc thể quả đều là màu vàng cam và đều có tên chung là Cantharellus cibarius Singer (1986) chứng minh các đặc điểm hình thái như hình dạng giống như bình hoa hoặc dạng kèn, basidia stichic và bào tử trơn nhẵn, ủng hộ mạnh mẽ về đặc điểm phân loài thuộc họ Cantharellaceae

Họrkửnen et al., (1995, 2003) cụng bố 6 loài và Buyck et al., (2000) đó cụng bố 11 loài và giới thiệu hai loài mới: Cantharellus tomentosus và C.isabellinus var parvisporus từ Tanzania Năm 2008 một loài mới Cantharellus fistulosus từ

Cantharellus tanzanicus sở hữu đặc điểm khác biệt với các loài đã công bố trước đó như hốc đặc trưng, cuống nhẵn bóng và mũ nấm màu hồng, tương phản với màu thân quả và bề mặt mũ nấm vàng nâu trước đây Ngoài ra, nghiên cứu của Hankel et al., (2005) đã ghi nhận một loài mới là Cantharellus pleurotoides tại vùng núi Pakaraima của Guyana, sinh sống trong các khu rừng nhiệt đới với loài thực vật ectomycorrhizal Dicymbe spp (họ Fabaceae) chiếm ưu thế.

Caesalpiniaceae) Loại nấm này được tác giả đề cập là số ít trong số các loài thuộc chi Cantharellus được mô tả trên toàn thế giới trong việc có pleurotoid basidioma và hình thái khác và hệ sinh thái khác được cung cấp để phân loài mới Olariaga và Salced (2008) đã công bố nấm Cantharellus ilicis từ rừng Quercus của

Mediterranean Basin, có sự khác biệt so với các taxa khác do tổ hợp đặc điểm hình thái kết hợp lại với fleshy basidiomata dày Một loài mới Cantharellus californicus được Arora và Dunham (2008) công bố, với các chanterelle vàng nổi bật của rừng

SVTH: Ngô Văn Tài Page 11 sồi ở California được đặc trưng như một loài mới khi dùng công cụ sinh học phân tử và hình thái học để phân loại Các quan sát chỉ ra rằng Cantharellus californicus là một loài lớn nhất trên thế giới, với những mảnh bào tử riêng rẻ thường nặng 1/2 kg (hoặc 1 pound) hoặc hơn khi trưởng thành Dựa trên tài liệu đã nghiên cứu của Fries và Mueller (1984) trên các thử nghiệm tính không tương thích trong quá trình sinh sản và các phương pháp thử nghiệm khác để mô tả toàn bộ hệ thống của một taxa cụ thể thì tác giả kết luận không thể dựa vào các tiêu chí hình thái để xác định giới hạn phân loài

Dựa trên các dữ liệu nghiên cứu, việc phân loại về hình thái học của nấm được chứng minh là chưa đủ chính xác và tiêu tốn nhiều thời gian (Mehmann et al., 1995) Mặc dù phương pháp phân loại hình thái cho phép xác định nhiều loài, nhưng sự tương đồng giữa một số đặc điểm hình thái đã dẫn đến việc nhận dạng sai một số loài và bỏ sót các loài mới trong nhiều nhóm phân loại phức tạp Điều này gây khó khăn trong việc xác định ranh giới giữa các phân loài hoặc xác định liệu một mẫu hình thái học có giống nhau hay không Sự mơ hồ trong việc xác định những khác biệt về hình thái đặc biệt giữa các loài có thể là thách thức lớn đối với các nhà nghiên cứu nấm trong quá trình mô tả các phân loài mới Do đó, các loài thuộc chi Cantharellus có hình thái tương tự nhau ban đầu đều được nhóm vào C cibarius (Eyssartier & Buyck, 2000; Dunham et al.,

2003 và Guevara et al., 2004) Vào thế kỷ 20, nhờ sự hỗ trợ bằng công cụ sinh học phân tử đã cho thấy rằng sự khác biệt về hình thái tuy nhỏ, không rõ ràng nhưng có thể lại xác định là các loài khác nhau của Cantharellus (Feibelman et al., 1996;

Phương pháp phân loại dựa trên phân tử

Phản ứng khuếch đại chuỗi bằng Polymerase (PCR) là kỹ thuật nhân bản nhanh nhiều bản sao của một đoạn DNA cụ thể mà không cần phải tạo dòng tế bào Nguyên lý của PCR dựa trên tổng hợp DNA sử dụng trình tự DNA đích ban đầu làm khuôn, enzyme polymerase nhân bản khuôn này thành hàng triệu bản sao dưới sự hỗ trợ của một cặp mồi (primer).

SVTH: Ngô Văn Tài Page 12 đặc hiệu cho đoạn DNA này Phương pháp này không qua các khâu giải phẫu hình thái, định danh hình thái, cơ chế hay chu trình sống của loài Phương pháp PCR thuận lợi khi áp dụng cho bất kỳ giai đoạn nào trong vòng đời của một loài nấm bao gồm thể quả, các nấm rễ cộng sinh (mycorrhizas), hệ sợi nấm thuần được phân lập bằng phương pháp in vitro Phương pháp giúp tăng độ tin cậy cho việc thu thập nguồn dữ liệu sinh học một cách đa dạng thuộc giới Nấm Các nghiên cứu phân tử về các loại nấm khác nhau đã làm sáng tỏ phân loại nấm trong tự nhiên (Hibbett và Vilgalys 1993; Bunyard et al., 1994; Drehmel et al., 1999; Liu et al., 1997)

Có hai vấn đề quan trọng dẫn đến việc sử dụng các kỹ thuật phân tử trong định danh phân loài Thứ nhất, sự hình thành của các tế bào nấm hoặc thậm chí bào tử đơn, vật liệu mẫu nấm khô hay sự mất cân bằng hệ sinh thái nấm Thứ hai, việc lựa chọn các loại mồi oligonucleotide đặc hiệu cho nấm, đã cung cấp cho việc giải ra dễ dàng các trình tự nucleotide (Guarro et al 1999) Các kỹ thuật phân tử ngày càng trở nên quan trọng như một phương tiện để các nhà nghiên cứu có thể xác lập các mối quan hệ phân loại và phát sinh chủng loài giữa các nhóm nấm nội loài (Zambino và Szabo 1993) Giới hạn phân loài các chủng nấm dựa trên một số đặc điểm hình thái có thể được ứng dụng bằng cách sử dụng các kỹ thuật dựa trên DNA như RAPD, AFLP, RFLP hoặc phân tích trình tự DNA (ITS, nrLSU, mtSSU, nrSSU và RPB1) Bất kỳ phương pháp phân tử nào cũng có thể được kết hợp với các phương pháp hình thái để xác định các loài nấm để đạt độ tin cậy cao (Khush et al

1992; Calonje et al 1997) Các phương pháp phát sinh loài phân tử thiết lập mối quan hệ tiến hóa dựa trên cây phát phả hệ phân tử đã chứng tỏ, phương pháp cung cấp nguồn thông tin có giá trị hướng tới mục tiêu mở nhiều hướng hiểu biết về mối quan hệ giữa các nhóm nấm nội loài (Mitchell et al., 1995).

Nghiên cứu phát sinh loài

Định danh phân tử

Định danh phân tử là phương pháp nghiên cứu về phân loại, mối quan hệ của sinh vật ở mức độ phân tử dựa trên sự so sánh sự khác biệt trình tự nucleotide và axit amin trong di truyền phân tử DNA, RNA, protein Trong nghiên cứu định danh

Định danh phân tử là bước thiết yếu trong nghiên cứu phân loại học, giúp lựa chọn vùng trình tự DNA, RNA, protein bảo tồn cao trong cùng loài nhưng biến đổi lớn giữa các loài khác nhau Gen giữ nhà thường dùng để định danh loài, thể hiện trên cây phả hệ phân tử Các chỉ tiêu về địa hình học, bootstrap và sự phân nhóm giúp phân tích mối tương quan của các đối tượng Kết hợp với dữ kiện hình thái, giải phẫu học hỗ trợ định danh chính xác Định danh phân tử bổ sung các phương pháp mới cho phân loại học truyền thống, giải quyết các vấn đề đa dạng di truyền, phát sinh loài và định danh loài khó xác định bằng hình thái.

Nuclear Large Subunit Ribosomal RNA (LSU)

Hình 1.3 Hình biểu diễn hệ thống cấu trúc vùng gene LSU

Gen mã hóa RNA của ribosome (nrSSU, nrLSU) chứa nhiều thông tin di truyền có tính bảo tồn cao, được biết rộng rãi trên thế giới và có khả năng thiết kế được các cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự các trình tự của nhiều loài nấm Trình tự nrLSU-rRNA là gen mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu phần lớn của ribosom) Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao do đó phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn Cấu trúc của nrLSU-rRNA ngoài những vùng bảo tồn còn có những vùng biến động gọi là domain D1/D2 (D- divergence region, các số đuợc đánh thứ tự 1, 2,…bắt đầu từ đầu 5’-3’) Các domain

SVTH: Ngô Văn Tài Page 14 khác nhau của 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU) chứa nhiều thông tin cho phép so sánh các cấp phân loại từ cao xuống đến cấp độ loài (Gueho et al., 1993) Ðặc biệt, vùng DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome gần đây được xem là rất hữu ích cho việc phân loại phần lớn các loài nấm có giá trị y duợc (Kurtzman & Robnett, 1997; Fell et al., 2000) Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được biết đến nhiều nhất và cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây (Vilgalys & Hester, 1990) Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp (Sonnenberg et al., 2007)

Hình 1.4 Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự gen nrLSU

Nhiều công trình nghiên cứu phân tích phát sinh phân tử gene nuclear large subunit rRNA (nrLSU) trên chi thuộc loài Cantharellus đã được tiến hành và tìm ra được nhiều loài mới (Redhead et al 1997; Dunham et al 2003; Arora and Dunham 2008) Và từ nghiên cứu này giải quyết được nhiều vấn đề nội-ngoại trong mối quan hệ tiến hóa loài thuộc chi Cantharellus như công tác hoàn thành phân tử gen nrLSU phải được tiến hành song song trong quá trình phân tích phát sinh loài Nghiên cứu về các mối quan hệ phát sinh loài trong họ Cantharellaceae qua việc phân tích trình tự của nrLSU trong nghiên cứu của Feibelman et al., 1997 Khoảng 325 bp gần đầu 5' của gene nuclear 28S ribosomal được giải trình tự, khi đem so sánh và chứng minh thì Cantharellus và Craterellus nên được coi là các chi khác biệt Việc phân tích phát sinh loài bằng cách sử dụng phương pháp parsimony đã chỉ ra rằng

Cantharellus tubaeformis và Pseudocraterellus sinuosus nên được phân loài thuộc

Vùng ITS2-nrLSU (ITS2-nrLSU) được chứng minh là có tiềm năng hỗ trợ phân loại nấm chi Cantharellus Phân tích ITS2-nrLSU đã giúp phân loại thành công một số loài Cantharellus mới và phân biệt các loài trong phạm vi chi Craterellus Tuy nhiên, độ phân giải cấp độ loài của vùng này trong chi Cantharellus thường thấp Năm 2015, phân tích phát sinh sử dụng vùng ITS2-nrLSU đã hỗ trợ mối liên hệ trên cây phát sinh phả hệ phân tử của các loài Cantharellus có quan hệ họ hàng gần Cặp mồi phổ biến LR0R/LR5, được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 của gen nrLSU, cũng đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phả hệ phân tử nấm.

Small subunit ribosomal RNA (nrSSU, 18S ribosomal RNA)

Trình tự nrSSU–rRNA là vùng gen mã hóa 18S rRNA (đơn vị hình thành tiểu phần nhỏ của ribosome), nrSSU tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền (Guarro et al., 1999) Gen nrSSU có tính bảo tồn cao do nó phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ và xa hơn, được dùng trong việc khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Vùng nrSSU có thể được đọc trình tự bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer) Các cặp mồi này được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide bảo tồn của gen 18S rRNA (White et al.,1990) Cặp mồi NS1/NS4 được sử dụng trong nghiên cứu này bởi tính phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự được nhiều mẫu nấm Ðây là cặp mồi đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử trong những năm gần đây (White et al., 1990)

SVTH: Ngô Văn Tài Page 16

Hình 1.5 Cấu trúc gen và vị trí mồi NS1/NS4 khuếch đại vùng gen nrSSU

Các nghiên cứu phát sinh gen ở mức phân loại cao hơn dựa vào các tiểu đơn vị nhỏ (nrSSU) và các chuỗi nrLSU cho công tác nghiên cứu phát sinh loài phân tử cho phân nhóm nấm cantharelloid đã không được ủng hộ mạnh mẽ bởi những khó khăn khi phân tích kết quả các giả trị ủng hộ liên kết giữa các nhóm loài đều thấp, nguyên nhân được đặt ra là do tốc độ tiến hóa phân tử của các gen rDNA hạt nhân trong các phân loại này tăng lên trong phân nhánh các tập hợp thuộc chi nấm Cantharellus (Moncalvo et al., 2006) Tuy nhiên, nghiên cứu này còn phân tích đa gene dựa trên sự kết hợp trên 4 gene bao gồm nrSSU, nrLSU, mtSSU, RPB2 đã cung cấp thêm nguồn giải quyết triệt để và tạo thêm giá trị ủng hộ mạnh mẽ cho nhiều phân nhánh trong nhiều tập hợp nhóm loài thuộc chi Cantharellus.

Phương pháp phân tích phân sinh loài đa gene

Một số nghiên cứu phát sinh loài dựa trên ribosomeDNA (Artjariyasripong et al 2001, Sung et al., 2001, Stensrud et al., 2005) không thể giải quyết và hỗ trợ định danh một cách rõ ràng của một họ nấm (ví dụ, đơn ngành của Clavicipitaceae), mặc dù đã cung cấp nhiều luận cứ để xây dựng cây phát sinh loài hỗ trợ định danh họ này Nhưng nghiên cứu này bị hạn chế bởi thông tin trình tự và DNA ribosome không đủ để giải quyết các mối quan hệ giữa các chi, loài, nhóm có quan hệ xa tuy đã áp dụng các mô hình, phương thức tính toán về mặt thống kê Ngoài ra các nghiên cứu phát sinh gen ở mức phân loại cao hơn dựa vào các tiểu đơn vị nhỏ (nrSSU) và các chuỗi nrLSU cho công tác nghiên cứu phát sinh loài phân tử cho

SVTH: Ngô Văn Tài Page 17 phân nhóm nấm cantharelloid đã không được ủng hộ mạnh mẽ bởi những khó khăn khi phân tích kết quả các giả trị ủng hộ liên kết giữa các nhóm loài đều thấp, nguyên nhân được đặt ra là do tốc độ tiến hóa phân tử của các gen rDNA hạt nhân trong các phân loại này tăng lên trong phân nhánh các tập hợp thuộc chi nấm Cantharellus

(Moncalvo et al., 2006) Khó khăn trong xây dựng cây phát sinh loài đơn gen

(phylogenies single-gen) được khắc phục bằng cách phân tích phát sinh loài của bộ dữ liệu bao gồm nhiều gen mã hóa nằm trong nhân (phylogenies đa gen) vì thông tin phát sinh loài ở nhiều gen lớn hơn trong bất kỳ đơn gen nào

Trong nghiên cứu của Kumari et al (2011) và Shao et al (2014) thì

Ribosomal nuclear large subunit (nrLSU) đã được sử dụng để ủng hộ cho sự thiết lập mối quan hệ phát sinh loài mới, nhưng vùng này thường có độ phân giải cấp độ loài rất thấp giữa các loài có mối quan hệ huyết thống đối với nhau (Buyck et al

2011), đặc biệt là trong loài Cantharellus Ngày càng nhiều nghiên cứu như của

Hazels và oaks Olariaga và Buyck (1999a) đã mô tả nhiều trình tự di truyền cho các loài thuộc chi Cantharellus ở các lục địa khác nhau thuộc Châu Âu nhưng không có bất kỳ nghiên cứu nào ước đoán vùng giới hạn phân loài của chi

Cantharellus khi sử dụng các thông tin di truyền có sẵn này

Việc phân tích lại để xác định giới hạn phân loài và các nhóm có mối quan hệ đơn huyết thống trong tập hợp nhóm cantharelloid đã được đề cập bởi nhóm nghiên cứu Moncalvo et al., 2006 Nhóm tác giả đã phân tích dựa trên thông tin trình tự các gene nrLSU, nrSSU, mitSSU và RPB2 Kết quả phân tích ủng hộ mạnh mẽ mối quan hệ 6 phân nhóm giữa 2 chi Cantharellus và Craterellus Các phân nhóm Craterellus có thể được ghi nhận trong khu vực ôn đới: Cr cornucopioides (bao gồm Cr fallax và Cr konradii), phân nhóm Cr tubaeformis (bao gồm Cr infundibuliformis), Cr odoratus, Cr lutescens và Cr ignicolour Đặc biệt trong nghiên cứu này việc phân tích đa gene dựa trên sự kết hợp trên 4 gene bao gồm nrSSU, nrLSU, mtSSU, RPB2 đã cung cấp thêm nguồn giải quyết triệt để và tạo thêm giá trị ủng hộ mạnh mẽ cho nhiều phân nhánh trong nhiều tập hợp nhóm loài thuộc chi Cantharellus Và kết quả

SVTH: Ngô Văn Tài Page 18 cũng cho thấy hai loài C minor và C appalachiensis có mối quan hệ gần gũi với các loài nhóm loài C cinnabarinus.

Tình hình nghiên cứu

Trong nước

Ở Việt Nam, nghiên cứu về nấm Cantharellus vẫn còn hạn chế, chủ yếu mới dừng lại ở việc phát hiện và định danh hình thái Mặc dù vậy, vẫn chưa có nhiều công trình cụ thể về định danh phân tử của loài nấm này.

Năm 2014, Phan Hữu Hùng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và cộng sự tiến hành phân tích thành phần hóa học và định danh các loài nấm cộng sinh trong rừng thông Đà Lạt dựa trên so sánh hình thái giải phẫu và công bố về sự tồn tại của chi Cantharellus cibarius tại Việt Nam

Ngoài ra, sinh học phân tử đã được ứng dụng hỗ trợ cho phân tích hình thái cũng như phát sinh loài của chi Nấm Cantharellus tại Việt Nam Cơ sở dữ liệu làm tiền đề cho xây dựng cây phát sinh loài được nhóm tác giả Trinh Van Hanh et al.,

2018 ứng dụng thành công với vùng gene mục tiêu là nrLSU, phân tích được 6 phân nhóm của Cantharellus Bộ dữ liệu này góp phần giúp hỗ trợ định danh các mẫu

Nấm Cantharellus tại Việt Nam sau này.

Ngoài nước

Nấm Cantharellus đã được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới, với trọng tâm đặc biệt vào việc xác định hình thái Các đặc điểm hình thái của chi nấm này đã được phân tích kỹ lưỡng, mặc dù khả năng phân biệt chính xác các loài dựa trên đặc điểm hình thái vẫn chưa cao.

Do đó, Trong những năm gần đây tình hình nghiên cứu về chi nấm

Cantharellus này được nghiên cứu rộng rãi đặc biệt sử dụng các dữ liệu từ các gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house-keeping genes) như : ITS (internal transcribed spacer), nrLSU (nuclear ribosomal small subunit - tiểu đơn vị nhỏ ribosome), nrSSU (nuclear ribosomal large subunit - tiểu đơn vị lớn ribosome), Tef1

SVTH: Ngô Văn Tài Page 19

(elongation factor 1α - nhân tố kéo dài 1α), Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II), Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA polymerase II)… nhằm mục đích hỗ trợ định danh chính xác hơn

Một số công trình tiêu biểu như: Năm 2013 việc phân tích đa gene dựa trên bốn gene nrLSU, nrSSU, RPB2 và tef-1 đã xây dựng thành công cơ sở dữ liệu và thể hiện mối quan hệ phát sinh loài phân tử rõ ràng để định danh hơn 1 nữa số loài nấm

Cantharellus trên thế giới dựa trên nghiên cứu của nhóm tác giả của Buyck et al.,

2013 và kết luận có 6 phân nhóm loài được công nhận và phân nhóm

Afrocantharellus được coi như một chi riêng biệt Năm 2016, phân tích phát sinh loài đã thành công trong việc phân tích đa gene bao gồm: ITS2, nrLSU, Tef-1, RBP2 bởi nhóm tác giả Olariaga, Ibai, et al., 2016 và kết luận công trình phù hợp với công trình nghiên cứu định danh phân tử trên toàn loài Cantharellus của Buyck et al

1.5 Nguyên tắc tách chiết và thu nhận DNA ở loài nấm

Thành tế bào nấm có khoảng 80% là các polysaccharides góp phần tạo nên cấu trúc vững chắc cho tế bào Ngoài polysaccharides, vách tế bào còn có sự hiện diện của protein Các thành phần chính của polysaccharide bao gồm α, β-glucan, chitin, chitosan Các sợi α, β-glucan được sắp xếp phức tạp chồng chéo lên nhau chúng kết hợp với protein màng tạo thành mạng lưới vách tế bào vững chắc Protein (hoặc là glycoprotein) tham gia một phần nhỏ cấu thành nên thành tế bào (