khảo sát đột biến gen stxbp2 trong hội chứng thực bào máu bằng kỹ thuật giải trình tự dna

Trong đó, gen STXBP2 nằm trên nhiễm sắc thể số 19, có vai trò mã hóa cho protein Munc18-2 tham gia vào quá trình vận chuyển trong tế bào, điều khiển SNARE các thụ thể protein gắn các yếu

TỔNG QUAN

Tổng quan về HLH

Hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) được Scott và Robb-Smith mô tả đầu tiên vào năm 1939 [36], được biết đến là một rối loạn hiếm gặp, có thể đe dọa tính mạng, đặc trưng bởi phản ứng viêm rất nghiêm trọng, gây ra bởi sự tăng sinh các tế bào lympho và đại thực bào hoạt hóa quá mức, tăng cytokine, làm tổn thương tế bào, suy đa cơ quan [20]

Những người mắc phải HLH thường biểu hiện các triệu chứng bệnh trong những tháng đầu hoặc năm đầu của bệnh Các triệu chứng có thể bao gồm sốt, gan lách to, giảm tế bào máu ngoại vi, tăng triglyceride máu, giảm fibrinogen máu, thường có co giật và có thể có biểu hiện triệu chứng thần kinh trung ương đi kèm [29]

HLH được chia làm hai thể bao gồm: HLH thể nguyên phát hay HLH có tính chất gia đình (Primary or Familial HLH) chia thành 5 subtype tương ứng với sự bất thường trên các gen PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 và HLH thể thứ phát (Secondary HLH) [29]

HLH nguyên phát được phân thành 2 nhóm nhỏ: (1) HLH có tính chất gia đình (FHL) và (2) HLH liên quan tới sự thiếu hụt bẩm sinh của hệ thống miễn dịch như hội chứng Griscelli type 2 (GS2), hội chứng Chediak- Higashi (CHS) và rối loạn thâm nhiễm lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 1 và 2 (XLP1, XLP2) [28]

FHL là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường (gồm nhiễm sắc thể số 6, 9, 10, 17 và 19) hoặc nhiễm sắc thể giới tính X [7] Có thể tự xuất hiện hoặc khởi phát sau khi nhiễm trùng, thường có biểu hiện lâm sàng từ lúc tuổi nhỏ, tỷ lệ trẻ em mắc bệnh dưới 1 tuổi là 1,1/100.000 ca Tuy nhiên cũng không loại trừ trường hợp FHL ở trẻ lớn hơn [20] và tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả nam và nữ

HLH thứ phát (Secondary HLH) hay HLH mắc phải chiếm tỷ lệ cao hơn HLH nguyên phát, thường xảy ra sau một yếu tố khởi phát thường là sau nhiễm siêu vi Thể thứ phát có thể tìm thấy trong các bệnh tự miễn, bệnh ác tính (bạch cầu huyết, lymphoma) và bệnh do rối loạn chuyển hóa [1, 23] có thể gặp ở tất cả các lứa tuổi nhưng thường xuất hiện ở trẻ lớn và người lớn [6]

Cả HLH thứ phát và FHL đều có thể xuất hiện sau nhiễm trùng nên triệu chứng lâm sàng của chúng rất khó phân biệt Do đó, các xét nghiệm sinh học phân tử là cần thiết để chẩn đoán xác định.

1.1.3 Nguyên nhân Ở HLH di truyền hay FHL gây ra do sự bất thường về gen nằm trên các nhiễm sắc thể thường số 6, 9, 10, 17 và 19 chiếm khoảng 25% các trường hợp HLH [7]

HLH thứ phát gây ra do yếu tố gia đình hoặc gen, thường được tìm thấy trong các bệnh nhiễm trùng, bệnh tự viêm, tự miễn (được biết đến phổ biến như hội chứng hoạt hóa đại thực bào - MAS), bệnh lý ác tính, ức chế miễn dịch, cấy ghép tế bào gốc tạo máu, cấy ghép nội tạng, nhiễm HIV và các bệnh chuyển hóa [1, 29]

Nguyên nhân gây HLH ở cả 2 thể nguyên phát và thứ phát được trình bày chi tiết trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Nguyên nhân dẫn đến HLH [28]

Phân loại HLH Gen Protein

Vị trí nhiễm sắc thể HLH nguyên phát

HLH có tính chất gia đình (FHL)

FHL1 Chưa xác định Chưa xác định 9q21.3-22

Protein 2 gắn vào Syntaxin hay Munc 18-2

Hội chứng thiếu hụt miễn dịch liên quan đến HLH nguyên phát

Hội chứng Griscelli type 2 RAB27A Rab27a 1q42.1-q42.2

Hội chứng Chediak- Higashi LYST Lyst 15q21

Ngoài ra còn có các bệnh miễn dịch hiếm gặp như HPS-2, SCID, ITK

Bệnh tự viêm và tự miễn (MAS)

Bệnh ức chế miễn dịch, cấy ghép tế bào gốc tạo máu, cấy ghép nội tạng, HIV và các bệnh rối loạn chuyển hóa

− XLP-1: rối loạn thâm nhiễm Lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 1

− XLP-2: rối loạn thâm nhiễm Lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 2

− HPS-2: Hội chứng Hermansky-Pudlak type 2 (Hermansky-Pudlak syndrome 2)

− SCID: Bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng (severe combined immunodeficiency)

− ITK: interleukin-2 inducible T-cell kinase

Theo các nghiên cứu đã công bố, tỷ lệ mắc Hội chứng kích hoạt đại thực bào (HLH) ước tính trong khoảng 1/50.000 - 1/100.000 dân số mỗi năm Tuy nhiên, các dữ liệu chưa được công bố cho thấy con số này có thể cao hơn, do các bác sĩ lâm sàng đã cải thiện khả năng nhận diện các dấu hiệu lâm sàng, dẫn đến chẩn đoán chính xác hơn về bệnh lý này.

Theo đó, một ước tính gần đây về tỷ lệ mắc HLH ở những người dưới 18 tuổi là 1,07/100.000 Tỷ lệ mắc FHL ước tính ở Thụy Điển là 0,12/100.000 trẻ em dưới 15 tuổi mỗi năm hoặc với tần suất 1/50.000 trẻ đẻ sống [31], hầu như các trường hợp mắc bệnh đều được chẩn đoán trong vòng một năm đầu sau sanh [20] và tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả nam và nữ Tuy nhiên, cũng không loại trừ chuẩn đoán FHL ở trẻ trên 1 tuổi [40] Tỷ lệ mắc HLH ở người lớn mặc dù không được biết chính xác, nhưng người ta ước tính rằng có khoảng 1/2.000 người lớn nhập viện tại các trung tâm y tế địa phương [34, 35]

Năm khiếm khuyết di truyền FHL đã được xác định, tương ứng với 5 subtype của FHL (Bảng 1.1) [37] Tần số xuất hiện của các subtype HLH là khác nhau giữa các chủng tộc [41] Ở Châu Á có khoảng 70 - 80% ở bệnh nhân FHL biểu hiện bệnh dưới 1 tuổi, và chỉ có 10% bệnh nhân có triệu chứng biểu hiện trong giai đoạn sơ sinh [29] Các trường hợp FHL hầu như đều tử vong nếu không được điều trị, thời gian sống trung bình được báo cáo trong các nghiên cứu là khác nhau từ 2 - 6 tháng sau khi được chẩn đoán [8]

Các trường hợp được chẩn đoán HLH thứ phát thường đi kèm với nhiễm trùng, đặc biệt là nhiễm EBV Tại Nhật Bản, khoảng 40% bệnh nhân HLH có liên quan đến nhiễm EBV [26] HLH phát triển trong bệnh lý ác tính, được biết với tên gọi là bệnh ác tính liên quan đến HLH (MAHS) Trong một nghiên cứu với tất cả 52 trẻ mắc phải MAHS thì có 60% trường hợp liên kết với u lympho không Hodgkin (Non- hodgkin’s lymphoma), tiếp theo là bệnh bạch cầu cấp (Leukemias), hội chứng rối loạn sinh tủy (Myelodysplastic syndromes), bệnh mụ bào (Langerhans cell histiocytosis) Ngoài ra, HLH thứ phát còn được tìm thấy trong các trường hợp ức chế miễn dịch, sau khi cấy ghép [30]

HLH thứ phát thường xảy ra ở độ tuổi lớn hơn so với FHL Tuy nhiên, bệnh nhân HLH thứ phát có thể tự giới hạn ở một số trường hợp, biểu hiện bằng khả năng phục hồi hoàn toàn sau khi được chăm sóc hỗ trợ (tiêm immunoglobulin tĩnh mạch IVIG) Ngược lại, hầu hết bệnh nhân HLH ở người lớn có triệu chứng trên hệ thần kinh trung ương (CNS) thường không thể thuyên giảm lâu dài mà không cần liệu pháp ức chế miễn dịch và gây độc tế bào.

Hơn hai thập kỷ qua, sinh lý bệnh học của HLH đã được xác định, mặc dù người ta chưa hiểu hoàn toàn về những giai đoạn gây bệnh của nó [24] Giải thiết hiện tại được chấp nhận được cho là liên quan đến các khiếm khuyết về chức năng của tế bào lympho

Tổng quan về gen STXBP2

1.2.1 Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen STXBP2

Dựa vào thông tin trên cơ sở dữ liệu NIH (National Institutes of Health), gen STXBP2 (Syntaxin Binding Protein 2) nằm trên vùng cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số 19, định vị tại vị trí 19p13.2 từ vị trí nuleotide 7.637.101 đến 7.647.875 (Hình 1.4) Gen STXBP2 có độ dài 10.774 bp gồm 19 exon

Hình 1.4 Vị trí gen STXBP2 trên nhiễm sắc thể số 19 [43]

1.2.2 Chức năng của gen STXBP2

Gen STXBP2 mã hóa cho protein 2 gắn kết với Syntaxin hay còn được biết đến với tên gọi là Munc18-2, một thành viên thuộc họ protein SEC/ MUNC gồm 593 amino acid, có kích thước phân tử 66.453 Da Protein được mã hóa này tham gia vào việc vận chuyển

16 bên trong tế bào, điều khiển việc lắp ráp phức hợp SNARE (các thụ thể protein gắn các yếu tố nhạy cảm N - ethylmaleimide hòa tan - Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor

Attachment protein Receptor) Phức hợp này thực hiện vai trò hòa màng giữa tế bào đích và túi tiết chứa các hạt ly giải gồm perforin và granzyme B, sau đó giải phóng các hạt perforin và granzyme B đến khe miễn dịch (Immunological Synapse - IS) [18, 21]

Perforin là một protein nội bào, khi có mặt của ion Ca 2+ , perforin được polyme hóa tạo cấu trúc dạng ống, đâm xuyên vào lớp lipit kép của màng tế bào đích (hay tế bào nhiễm) làm thủng màng đồng thời vận chuyển các granzyme B theo lỗ thủng vào các tế bào đích Tiếp đó, granzyme B xâm nhập vào trong nhân của tế bào đích để tham gia khởi phát quá trình chết theo chương trình (apoptosis) Thiếu perforin, các tế bào

CTL và NK cho thấy giảm hoặc mất khả năng ly giải tế bào đích [47, 48]

Hình 1.5 Vai trò của gen STXBP2 trong con đường giết tế bào nhiễm bằng các hạt ly giải tế bào [8]

Protein STXBP2 hay Munc 18-2 tương tác với Syntaxin 11 - một protein liên quan đến FHL4 STXBP2 rất quan trọng, cần thiết trong con đường giải phóng các hạt ly giải tế bào xâm nhập vào tế bào đíchkhởi phát quá trình chết theo chương trình, giết tế bào bị nhiễm bằng cách gắn kết với Syntaxin 11 tạo thành phức hợp SNARE Vì vậy, đột biến ở gen STXBP2 ảnh hưởng đến chức năng của STXBP2, sự thiếu hụt protein

STXBP2 dẫn đến hoạt tính gây độc của tế bào NK và CTL giảm hoặc mất khả năng ly giải lên tế bào nhiễm, là nguyên nhân gây ra FHL5 [42]

FHL5 được báo cáo chiếm khoảng 10% cá thể FHL ở Thổ Nhĩ Kỳ và Arab Saudi, 20% ở Đức [7, 33] Hơn 100 kiểu biến đổi của gen STXBP2 đã được báo cáo trên Clinvar của ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/), bao gồm 39 đột biến sai nghĩa (missense mutation), 2 đột biến lệch khung (frameshift mutation), 2 đột biến vùng nối (splice site mutation) Hầu hết bệnh nhân FHL5 mang hai loại đột biến khác nhau trên cả hai alen nằm trên hai nhiễm sắc thể Trong đó, đột biến sai nghĩa là loại đột biến phổ biến nhất

Đột biến gen STXBP2 ở bệnh nhân hội chứng FHL5 ảnh hưởng đến toàn bộ vùng mã hóa Các đột biến thường gặp bao gồm:

• c.1430C>T (p.Pro477Leu): đột biến sai nghĩa được phát hiện ở 5 bệnh nhân từ Ả Rập

• c.1621G>A (p.Gly541Ser): được tìm thấy ở 7 bệnh nhân chủ yếu là người da trắng

Ngoài ra, còn có đột biến tại vùng nối c.1247-1G>C ảnh hưởng đến vị trí cắt nối của exon 15 được xác định trên 12 bệnh nhân, 5 trường hợp đồng hợp tử và 7 trường hợp kết hợp với một đột biến khác Những đột biến loại này thường được tìm thấy ở các bệnh nhân từ Đức và Thổ Nhĩ Kỳ [33]

Hội chứng HLH qua xem xét hồ sơ dữ liệu về mặt dịch tễ học cho thấy không có ưu thế về chủng tộc nào Nghiên cứu tại các quốc gia châu Âu như Thụy Điển, Anh và Ý

18 báo cáo với các số liệu thống kê tương tự nhau Đồng thời bệnh cũng không có ưu thế cho giới tính nào [8] Ở Việt Nam, các nghiên cứu về HLH phần lớn mô tả về các đặc điểm lâm sàng, chuẩn đoán và điều trị HLH thứ phát Trong đó, có 2 công trình nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến FHL gồm: “Phát hiện đột biến gen Perforin gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA” của Hoàng Anh Vũ và cộng sự (2012) và “Phát hiện đột biến gen UNC13D gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA” của Hoàng Anh Vũ và cộng sự (2013) Đột biến STXBP2 vẫn còn khá mới ở Việt Nam, nhất là các nghiên cứu về tính chất đột biến ở các gen liên quan đến FHL, vì vậy việc “KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN

STXBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI

TRÌNH TỰ DNA” là vô cùng cần thiết

1.2.4 Tính đa hình đơn nucleotide (SNP)

Tính đa hình là sự xuất hiện hai hay nhiều biến thể hoặc các hình thức khác nhau được gọi là kiểu hình thay thế trong một quần thể loài Có 3 dạng: đa hình cân bằng, đa hình di truyền, đa hình đơn nucleotide (SNP)

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) là sự thay đổi của nucleotide đơn trên một chuỗi trình tự DNA mà sự thay đổi đó chiếm một tỉ trọng đủ lớn (>1%) trong cộng đồng Marker này thường được dùng để phân tích genome người, hiện nay được áp dụng cho genome nhiều sinh vật khác với số lượng lớn nhờ một đột biến điểm tại một nucleotide trên genome

Hình 1.6 Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G-C bằng A-T hoặc ngược lại tạo ra một SNP [48]

SNP xuất hiện tại các vùng không mã hóa nhiều hơn so với vùng mã hóa là kết quả của chọn lọc tự nhiên, tần suất tái tổ hợp và đột biến di truyền Tuy nhiên, khi SNP xuất hiện tại vùng mã hóa, nó không nhất thiết dẫn đến sự thay đổi trình tự amino acid do đặc tính thoái hóa của mã di truyền.

Các SNP trong vùng mã hóa có hai loại: đa hình đồng nghĩa (không ảnh hưởng đến chuỗi protein) và đa hình thay thế (thay đổi trình tự amino acid của protein) SNP không nằm trong vùng mã hóa protein vẫn ảnh hưởng đến sự liên kết gene, sự gắn kết yếu tố sao chép và sự thoái hóa RNA

Kỹ thuật di truyền phân tử xác định đột biến gen STXBP2 trong hội chứng thực bào máu

Kỹ thuật PCR được phát hiện bởi Kary Mullis vào năm 1980 PCR là một phản ứng khuếch đại trình tự DNA được thực hiện trong điều kiện in vitro với sự tham gia của các thành phần như: DNA mạch khuôn, dNTP (gồm 4 thành phần: dATP, dTTP, dGTP, dCTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm)

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì đều gồm 3 bước:

• Giai đoạn biến tính (denaturation) ở 90 - 98 o C: Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands).Thời gian biến tính trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút

• Giai đoạn gắn mồi (annealing): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi – Tm) cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn DNA, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40- 70°C (nhiệt độ cần cho sự bắt cặp đặc hiệu giữa mồi với mạch khuôn

20 là Ta, Ta < Tm khoảng 5°C) Thời gian bắt cặp trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút

• Giai đoạn kéo dài hay tổng hợp (extension): nhiệt độ được tăng lên 72°C, là nhiệt độ tối ưu của DNA polymerase chịu nhiệt, thực hiện quá trình tổng hợp mạch DNA mới theo nguyên tắc bổ sung với trình tự đích Thời gian tổng hợp phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại Thường thì thời gian tổng hợp trong phản ứng PCR kéo dài trong khoảng 30 giây đến nhiều phút

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase

Hình 1.8 Các chu kỳ của kỹ thuật PCR

Là phương pháp định tính nucleic acid dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt phân tử nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường Sự di chuyển này phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide của phân tử), kiểu cấu trúc (mạch thẳng hay đơn, vòng hay xoắn) và nồng độ của chất cấu thành gel Sau đó, các acid nucleic trong gel agarose sẽ phát quang dưới tia tử ngoại khi liên kết với chất nhuộm màu thường là ethidium bromide (EtBr) hoặc gel red

Trình tự acid nucleic là một trình tự nối kết liên tiếp nhau theo một thứ tự xác định của các nucleotide Việc xác định trình tự acid nucleic nhằm tìm hiểu bản chất của acid nucleic tương ứng với gen gì, có chức năng điều hòa hay phiên mã cho protein nào Ngoài ra, nó còn cho phát hiện chính xác các đột biến điểm, thay đổi nhỏ thêm hoặc bớt trên trình tự acid nucleic…

Các phương pháp xác định trình tự có thể kể đến như phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert, phương pháp enzymecủa Sanger và cộng sự, phương pháp giải trình tự trực tiếp bằng máy tự động

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert khó thực hiện vì phải xác định nhiều thông số cho thí nghiệm Vì vậy, hiện nay người ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội

Phương pháp Sanger được đưa ra bởi Frederick Sanger và cộng sự năm 1977 Nguyên tắc chung của phương pháp này là tổng hợp các đoạn DNA từ mạch DNA khuôn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide, có các đầu tận cùng là dideoxynucleotide (ddNTP) - một phân tử triphosphate nhân tạo có cấu trúc tương tự như phân tử deoxynucleotide (dNTP) nhưng ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là

Phương pháp chuỗi gián đoạn Sanger dựa trên việc sử dụng bốn loại ddNTP được gắn đồng vị phóng xạ để bổ sung cho sợi đơn bổ sung đang tổng hợp Nếu ddNTP gắn vào đầu 3' thì sự tổng hợp sẽ dừng lại Bằng cách điện di trên gel polyacrylamide biến tính và phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi, trình tự đoạn DNA có thể được xác định từ các vạch này, tương tự như phương pháp Maxam và Gilbert.

1.3.3.3 Máy giải trình tự tự động dựa trên phương pháp Sanger cải tiến [9]

Máy giải trình tự tự động ngày nay sử dụng phương pháp Sanger với những cải tiến, trong đó, phản ứng giải trình tự với bốn ddNTP đánh dấu huỳnh quang được thực hiện trong cùng một microtube và được nạp vào máy giải trình tự sau khi đã tinh sạch DNA Máy giải trình tự sẽ tự động nạp đầy gel vào vi ống rồi nạp mẫu DNA vào 1 đầu của vi ống, áp dung một hiệu điện thế lên vi ống để các đoạn DNA được phân tách trong gel và di chuyển về đầu còn lại của vi ống Ở cuối vi ống có một cửa sổ quang học cho phép đầu đọc bằng tia laser ghi nhận từng vạch DNA di chuyển qua với mẫu huỳnh quang tương ứng Tín hiệu này sẽ được máy tính chuyển thành sắc ký đồ (chromatograph) và trình tự tương ứng

Hình 1.9 Sơ đồ quy trình giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động [49]

Hình 1.10 Máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer

1.3.4 Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự Nucleotide

Cơ sở dữ liệu là nơi tập hợp và lưu trữ một cách có tổ chức những thông tin nghiên cứu về tính chất, cấu trúc của các phân tử sinh học, các dữ liệu về bộ gen và vô số những dữ liệu hữu ích khác Sau quá trình giải trình tự mẫu bệnh phẩm, tiến hành phân tích kết quả bằng cách so sánh trình tự thu nhận với cơ sở dữ liệu Có nhiều nguồn dữ liệu cho việc phân tích: trình tự của những gen đã được công bố, cơ sở dữ liệu gen của tổ chức National Center for Biotechnology Information (NCBI) Trong đó, NCBI là cơ sở dữ liệu thường được lựa chọn vì quy mô lớn và phổ biến rộng rãi NCBI có giao diện liên kết đơn giản, dễ sử dụng với khả năng lưu trữ, tìm kiếm, so sánh và tính toán nhanh chóng

1.3.4.2 Phần mềm phân tích trình tự Nucleotide

Công cụ CLC Sequence Viewer do các nhà khoa học của CLC Bio thiết kế vào năm 2005 với tên gọi ban đầu là CLC Free WorkBench Đến năm 2008, phần mềm được đổi tên thành CLC Sequence Viewer, hỗ trợ người dùng thực hiện nhiều phân tích dữ liệu trình tự, bao gồm sắp xếp trình tự, xác định vị trí cắt giới hạn của enzyme, phân tích biểu hiện gen, thiết kế mồi, sao chép phân tử và phân tích phát sinh loài Ngoài ra, phần mềm còn có khả năng quản lý dữ liệu theo thứ tự.

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được chẩn đoán HLH theo tiêu chuẩn HLH - 2004 của Henter và cộng sự (2004) (Bảng 1.4) [23]

Mẫu máu sau khi thu nhận được bảo quản chống đông bằng EDTA hoặc citrate, giữ ở nhiệt độ phòng và nhanh chóng chuyển đến phòng xét nghiệm, tiến hành tách chiết

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): ngân hàng cơ sở dữ liệu dùng cho việc khai thác thông tin, thu thập các công trình nghiên cứu

IDT (https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer): công cụ trực tuyến giúp đánh giá các thông số vật lý của mồi

Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) được sử dụng để kiểm tra các thông số và độ đặc hiệu của mồi

Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/): công cụ tin sinh học giúp đánh giá các biến thể nucleotide có thể là đột biến hay SNP

Phần mềm CLC Main Workbench phiên bản 5.5 được ứng dụng trong việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho các exon của gen STXBP2 và phân tích các kết quả giải trình trình tự của exon mẫu bệnh phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành thu thập các công bố khoa học trên các công cụ trực tuyến PubMed (NCBI), Google Scholar,… tổng quan về HLH cũng như khảo sát tính chất đột biến ở gen STXBP2 trong FHL5

Dựa vào các bài báo nghiên cứu chúng tôi tiến hành phân tích dữ liệu nhằm xác định tính chất đột biến trên gen STXBP2, đồng thời đưa ra được phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến tốt nhất, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu

2.2.2.1 Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc

Thu nhận trình tự nucleotide gen STXBP2 trên cơ sở dữ liệu NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) với mã số truy cập (accession number) là NG_016709 đồng thời xác định cấu trúc của gen

2.2.2.2 Thiết kế - đánh giá mồi cho phản ứng PCR kết hợp giải trình tự

Để tiến hành nghiên cứu các đột biến, bao gồm cả các đột biến mới, phương pháp an toàn và hiệu quả nhất là sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR), kết hợp với giải trình tự DNA.

Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu nhằm khuếch đại các vùng exon của gen STXBP2 gồm exon 1 – 4, exon 5 – 6, exon 7 – 13, exon 14 – 16, exon 17 – 19 bằng phần mềm CLC Main Workbench version 5.5 (phần mềm chuyên dụng cho phép thiết kế mồi của phản ứng PCR từ trình tự gen có sẵn) (Bảng 2.1)

Các công cụ trực tuyến Oligo Analyzer 3.1

(https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer) và Primer-BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) được sử dụng để kiểm tra các thông số vật lý và độ đặc hiệu của mồi

Cặp mồi được thiết kế có nhiệt độ gắn mồi xấp xỉ nhau đồng thời đạt các thông số lý thuyết theo yêu cầu Sau khi kiểm tra các thông số vật lý và độ đặc hiệu của mồi, mồi sẽ được tổng hợp tại công ty IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ)

Bảng 2.1 Trình tự các mồi sử dụng để PCR khuếch đại các exon gen STXBP2

Exon Tên mồi Trình tự mồi

Kích thước khuếch đại (bp)

- ACCTTGGGACA…: trình tự nucleotide Trong đó, Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C), Guanine (G)

2.2.3.1 Sơ đồ tổng quát quy trình xác định đột biến trên gen STXBP2 ở bệnh nhân mắc HLH

Mẫu máu bệnh nhân được chẩn đoán HLH

Tách chiết gDNA bằng bộ kít QIAamp

Thực hiện PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế cho 21 exon

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng enzyme Exo-SAP

Thực hiện phản ứng Cycle Sequecing

Tủa sản phẩm Cycle Sequencing Đọc và phân tích kết quả Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

2.2.3.2 Tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mẫu máu

Phương pháp dùng cột silica dựa trên khả năng gắn DNA lên màng lọc silica dưới sự hiện diện của tác nhân biến tính chaotropic Tác nhân biến tính guanidine thiocyanate (GuSCN) có trong dung dịch ly giải có khả năng biến tính các đại phân tử như protein, lipit bằng cách can thiệp vào các liên kết nội phân tử như liên kết hydrogen, lực ion cũng như tương tác kị nước Do đó màng tế bào bị phá hủy, protein bị biến tính tạo điều kiện để gắn DNA lên màng silica Lúc này DNA nằm ở pha rắn sẽ được thu nhận bằng cách ly tâm và đồng thời loại bỏ các thành phần không mông muốn ở pha lỏng Sau cùng, DNA bám vào màng silica sẽ giải phóng ra khỏi màng silica bằng cách dùng dung dịch rửa giải và ly tâm

• Thiết bị và hóa chất

Máy ly tâm Eppendorf Cenfrifuge 5415R Máy Vortex Reax Top

Máy lắc ủ nhiệt Eppendorf Proteinase K Thermo Scientific QIAamp DNA Blood Mini Kit gồm:

Lysis Solution Thermo Scientific Ethanol 100% Thermo Scientific Wash Buffer I Thermo Scientific Wash Buffer II Thermo Scientific Elution Buffer Thermo Scientific Cột lọc tinh sạch DNA Thermo Scientific Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được chuẩn đoán HLH sau khi chống đông bằng EDTA sẽ tiến hành tách chiết gDNA theo quy trình được trình bày trong Sơ đồ 2.1

Hình 2.1 Cột lọc dùng tách chiết DNA mẫu máu

Sơ đồ 2.1 Quy trình tách chiết gDNA mẫu máu ngoại vi bằng QIAamp Mini Kit

2.2.3.3 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận

Kiểm tra chất lượng gDNA sau khi tách chiết bằng phương pháp đo quang phổ

Hàm lượng DNA trong dung dịch có thể được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 260 nm, kết quả thu được gọi là giá trị OD260 (Optical Density 260 nm) Giá trị OD260 cho biết mật độ quang học của DNA tại bước sóng 260 nm, tương ứng với lượng DNA có trong dung dịch Cụ thể, tại OD260 = 1.0, nồng độ DNA sẽ là 50 ng/µl.

30 sợi đôi) Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/ A280 Có thể xem DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1.8 – 2.0

• Thiết bị và hóa chất:

Máy NanoDrop 2000 Thermo Scientific Elution Buffer Thermo Scientific

• Các bước tiến hành: gDNA sau khi tách chiết bằng QIAamp DNA Blood Mini Kit (Thermo, Đức) được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách

- Lấy 2 àl dung dịch gDNA lờn bộ phận đặt mẫu của mỏy đo quang phổ NanoDrop

- Đóng nắp và đọc kết quả trên máy tính đã được kết nối

Tiến hành thực hiện phản ứng PCR bằng 5 cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1), khuếch đại các vùng exon mục tiêu (gồm exon 1 – 4, exon 5 – 6, exon 7 – 13, exon 14 – 16, exon

• Thiết bị và hóa chất:

Máy PCR Mastercycler@Pro S Eppendorf

Tủ hút khí độc cấp 2 Esco Máy Vortex Reax Top Hedolph Máy ly tâm Mini Star Silverline Takara Taq TM Hot Start Version gồm:

Takara Taq HS 5U/ àl Takara Bio 10X PCR Buffer Takara Bio dNTP Mixture 2,5 mM Takara Bio Mồi IDT gDNA sau khi tách chiết

Mỗi phản ứng PCR luôn được thực hiện kèm theo chứng âm (thay gDNA bằng nước cất) Phản ứng PCR được thực hiện với thể tớch 15 àl, thành phần và chu trỡnh luõn nhiệt của phản ứng PCR được trình bày như trong Bảng 2.2 và Hình 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Thể tớch (àl)

Hình 2.2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR

Chú thích: T a là nhiệt độ bắt cặp đặc hiệu của mồi

[45x] là số chu kì thực hiện phản ứng PCR

Dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt phân tử nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường, các acid nucleotide trong gel agarose sẽ phát quang dưới tia tử ngoại (UV) khi liên kết với chất nhuộm màu gel red Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ00nm) Kích thước của các acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước với thang chuẩn

• Thiết bị và hóa chất:

Lò vi sóng Sharp Máy đọc Geldoc - ItTM UVP

Bộ điện di Takara Agarose dạng bột Promega Dung dịch TBE 5X gồm:

Tris Merch, Mỹ Acid Boric Merch, Mỹ EDTA pH=8 Merch, Mỹ

Bộ điện di Takara Gel Red 5X Thermo Scientific Thang DNA 1kb plus (0,1 àg/àl) Thermo Scientific

Cân 0, 75g hòa tan trong 50 ml dung dịch TBE 0,5X (được pha loãng từ dung dịch TBE 5X), làm tan agarose bằng cách đun trong lò vi sóng (đến khi gel tan hoàn toàn), để nguội đến nhiệt độ khoảng 50 – 55 o C, đổ gel vào khuôn và lắp lược

Chuyển gel sau khi đông lên buồng điện di, đổ dung dịch TBE 0,5X vào bồn điện di

Hỳt 2 àl mẫu sản phẩm PCR và 2 àl dung dịch Gel Red 5X, mix đều và bơm vào giếng

- Đậy nắp buồng điện di lại và điện di với hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút

- Đọc kết quả điện di bằng máy Máy đọc Geldoc - It TM UVP, đối chiếu với thang chuẩn 1Kb Plus DNA (Ladder) để xác định kích thước sản phẩm PCR

2.2.3.6 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng enzyme ExoSAP-IT để thủy phân mồi (primer) và các nucleotide (dNTP) còn dư sau khi thực hiện phản ứng PCR, chuẩn bị mẫu DNA cho bước giải trình tự sau này

• Thiết bị và hóa chất:

Máy PCR Mastercycler@Pro S Eppendorf Máy Vortex Reax Top Hedolph Máy ly tâm Mini Star Silverline Enzyme ExoSAP-IT Thermo Scientific Sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng enzyme ExoSAP-IT TM PCR Product Cleanup của Thermo Scientific.Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện với tổng thể tớch 5 àl, thành phần và chu trỡnh nhiệt của quy trỡnh tinh sạch sản phẩm PCR được trỡnh bày trong Bảng 2.3 và Bảng 2.4

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tinh sạch sản phẩm PCR

Thành phần Thể tớch (àl)

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt quy trình tinh sạch sản phẩm PCR Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian

2.2.3.7 Phản ứng giải trình tự (Cycle Sequencing)

• Thiết bị và hóa chất:

Máy PCR Mastercycler@Pro S Eppendorf Máy Vortex Reax Top Hedolph Máy ly tâm Mini Star Silverline Primer (1.6 àM)

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 từ Applied Biosystems theo 1 chiều hoặc mồi xuôi hoặc là mồi ngược cho từng vựng exon mục tiờu với tổng thể tớch 9,8 àl; thành phần, trỡnh tự mồi và chu trỡnh nhiệt của phản ứng Cycle Sequencing trình bày ở Bảng 2.5, Bảng 2.6 và Hình 2.3

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng Cycle Sequencing

Thành phần Thể tớch (àl)

Bảng 2.6 Trình tự mồi dùng cho phản ứng Cycle Sequencing các exon của gen STXBP2

Tên mồi Trình tự mồi (5’- 3’) Exon

Hình 2.3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Cycle Sequencing

Chú thích: [25x] là số chu kì thực hiện phản ứng Cycle Sequencing

2.2.3.8 Tủa sản phẩm Cycle Sequencing

Thời gian thực hiện và địa điểm

Đề tài được tiến hành từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 04 năm 2019 tại Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.