Khảo sát các tuýp phế cầu khuẩn ( streptococcus pneumoniae) ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự sanger

pneumoniae đà dược thict lập và sứ dụng.Mục tiêu: Xác định tý lệ các tuýp phe cầu khuân Streptococcus pneumoniae ớ trỏ em dưới 5 tuôi tại Nghệ An bang kỳ thuật giải trinh tự Sanger.Dổi t

Bộ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO Bộ Y TÉ TRƯỜNG DẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYÊN MẠNH HIỂU

KHÁO SÁT CÁC TUÝP PHẾ CÀU KHUẢN

(Streptococcuspneumoniae) o I RE EM

BANG KỸ THUẬT GIÃI TRÌNH TỤ SANGER

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP BÁC SỶ Y KHOA KHÓA 2017 - 2023

Bộ GIÁO ĐỤC VÀ ĐÀO TẠO BỌ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYÊN MẠNH HIẾU

KHÁO SÁT CẤC TUÝP PHÉ CÂU KHUÂN

(Streptococcuspneumoniae) o TRE EM

BÀNG KỸ THUẬT GIÃI 1 RÌNH TỤ SANGER

Ngành đào tạo : Bác sỷ Y khoa

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc em xin gứi lời câm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thị Trang - Giàng viên cao cắp Bộ môn Y sinh học - Di truyền và ThS.BS Nguyễn Hữu Dức Anh Giang viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền Thây cô đà trực tiếp chi dạy hướng dẫn tận tinh và luôn tạo diêu kiện tót nhai cho em trong suốt quá trinh học tập nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này Thầy cô lã người dà dịnh hướng, diu dat em nhùng bước di dầu tiên trên con dường nghiên cứu khoa học.

Em xin cam ơn Ban giám hiệu nhà trường Phông Đào tạo Đại học, Phòng Công tác chinh trị & Học sinh sinh viên, bộ món Y sinh học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội cùng như các khoa, bộ môn em từng theo học đà tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và thực hiện tốt khóa luận cua minh.

Em xin cam ơn các thầy cô anh chị nội trú và các anh chị kỳ thuật viên tại Bộ món Y sinh học - Di truyền trường Dại học Y Hà Nội dà hướng dần tận tinh, giúp đờ em từ bước đầu thu thập số liệu trong nghiên cửu khoa học cùng như làm luận ván tốt nghiệp.

Hà Nội ngày tháng năm

NGUYỀN MẠNH HIẾU

LỜI CAM ĐOAN

Tói là Nguyễn Mạnh Hiếu, sinh viên khóa 2017 - 2023 chuyên ngành Bác sỹ đa khoa Trường Dại học Y Hà Nội xin cam đoan:

I Dây là luận vãn do bán thân (ôi trực liếp thực hiện dưới sự hướng dần cua PGS.TS Nguyễn Thị Trang và ThS.BS Nguyễn Hữu Đức Anh.

2 Còng trinh này không (rủng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác dà dược công bồ tại Việt Nam.

3 Các sổ liệu và thông tin trong nghiên cửu lã trung thực và khách quan, dược xác nhận và chấp nhận cua cơ sớ nơi nghiên cửu cho phép lẩy số

KHÁO SÁT CẤC TUÝP PHÉ CÀU KHUÂN (Streptococcuspneumoniae} Ờ TRÊ EM BANG KỸ THUẬT GIÁI TRÌNH TỤ SANGER

Tóm tắt:

Bổi cành: Ớ trê em viêm phối do phế cầu (Streptococcus pneumoniae) thường xay ra đột ngột và rầm rộ Ngày nay tiến trinh vả hiệu qua diều trị gặp nhiều khó khán do việc lụm dụng khàng sinh lãm xuắt hiện vã lan truyền gcn kháng thuốc Do đó kỳ thuật giái trinh tự Sangcr xác định các tuýp phế cầu khuan s

pneumoniae đà dược thict lập và sứ dụng.

Mục tiêu: Xác định tý lệ các tuýp phe cầu khuân (Streptococcus pneumoniae) ớ trỏ em dưới 5 tuôi tại Nghệ An bang kỳ thuật giải trinh tự Sanger.

Dổi tượng và phương pháp: Dổi tượng nghiên cứu là 193 tre em lừ I tháng dền 5 tuổi được chân doãn viêm phôi do phe cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae bằng kỹ thuật vi sinh khám và theo dõi diều trị lại một số Bệnh viện ờ Nghệ An Sứ dụng kỳ thuật giái trinh tự Sanger dế xác định các tuýp huyết thành phe cẩu khuân vã khao sát hiệu qua cua vaccine PCV10 và PCV13 Nghiên cứu mô ta cất ngang, hồi cứu và tiến cứu dừ liệu.

Kct quá: Trong số 193 mầu thu dược, định danh dược 172 mầu thuộc 12 tuýp phế cầu bủng phương pháp giai trinh tự Sanger Khu vực thành thị xác dưực 2 tuýp (n = 6) trong khi đó khu vực nông thôn xác định dược 12 tuýp (n = 165) So sánh với hai loại vaccine viêm phôi lưu hãnh, cho thay vaccine PCV10 có mức độ che phu chiêm 82.56% còn PCV13 cỏ mức dộ che phu cao hơn (92.44%) Kết luận: Kei quá khao sát cho thẳy việc định danh các chung phế cầu khuân và định tuýp huyết thanh có vai trò quan trọng, cung cấp thông tin sơ bộ về các chung phế cầu lưu hãnh tại khư vực Nghệ An dồng thời đảnh giả dược hiệu qua cùa vaccine PCV13 vã PCV10 ớ irc bị viêm phối trong nhỏm nghiên cứu

Từ khóa: Phế cẩu khuẩn (Streptococcus pneumoniae), định lỉanh sanger, (ré

em Nghị' An

A STUDY ON DIFFERENT STRAINS OF Streptococcus pneumoniae IN CHILDREN UTILISING SANGER SEQUENCING

Introduction: In children, pneumococcal infections caused by Streptococcus pneumoniae usually happen very sudden, and at an alarming rate Nowadays, the

effectiveness of different treatments have been greatly reduced due to the overuse of antibiotics lead to the formation and widespread of drug resistance genes Therefore, we utilise Sanger sequencing as an effective method of characterising different strains of s pneumoniae.

Objective: Analyse the compositions of different strains of Streptococcus pneumoniae in children under five years old in Nghe An province using Sanger sequencing.

Subjects and methods: We conducted the study on 193 children, the age ranging from one month-old to five year-old who has been diagnosed with streptococcal infection using different microbial techniques and has been treated at hospitals around Nghe An province We then use Sanger sequencing to analyse the collected samples, which give results on the type of strains that can be use to evaluate the effectiveness of PCV10 and PCV13 vaccine.

Results: Of the 193 coillected samples 172 has been identified using Sanger sequencing, belonging to 12 strains Two strains are found in the city area (n 6) while in the countryside 12 strains were determined (11 = 165) Evaluate the coverage of the two most commonly used vaccines for pneumonia PCV10 and PCV13 showed effectiveness of 82.65% and 92.44% respectively.

Conclusion: Streptococcal typing is extremely important, and this study has give primilinary information on the different types of pncumonococcal strains circulating the Nghe An region The study have also evaluated the effectiveness of the pneumonia vaccines PCV10 and PCV13.

Keywords: Streptococcus pneumoniae pneumonia Sanger sequencing, children Nghe An

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU 3

LLTongquan phe cầu khuẩn (Streptococcuspneumoniae) - — 3

I I I Định nghĩa và phản loại phế cầu khuân•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1.1.2 Các tuýp huyết thanh cùa Phe cầu khuân s pneumoniae, 3

1.1.3 Dồ kháng cua cơ thể đối với tác nhân Phế cầu s pneumoniae 4

1.1.4 Cơ che lan truyền gcn kháng kháng sinh —— — 5

1.2 Mồt sổ nghiên cửu về ứng dụng cùa kỹ thuật giai trình tự Sanger xác định các tuýp phế cầu khuẩn tại Việt Nam và trên thế giói 9

LILTrcn the giới - 9

1.2.2 Ớ Việt Nam -11

13 Kỹ thuật nuôi cay và sinh học phân tử úng dụng dinh tuýp phe cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

CHƯƠNG 2 ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHẤP NGHIÊN cứt 2.1 Đoi tượng nghiên cứu••••••••••••••••••••••••••••••••••••♦•••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 2.1.1 Tiêu chuàn lựa cliọn.——.—————————.— 2.2 Thòi gian và dịa diêm nghiên cứu.————.—.— —.———.—— 14

23 Thiết ké nghiên cứu !•••■■•••••••••••••••••■•■••••••••••••••••••■••••••••••••••••••■••■••••• 15

2.4 Cữ mau và phương pháp chọn mầu 15

2.5 Biển số và chi số nghiên cứu 17

2.5.1 Các ch) sổ nghiên cúu và tiêu chuân đánh giá ch) so 17

2.6 Kỹ thuật định type huyết thanh phe cầu hằng phương pháp giãi trình tự 2.6.1 Nguyên vật liệu và trang thiết bị - 20

2.6.2 Các bước tiến hãnh - - - - - -25

2.7 Phương pháp xử lý số liệu - - -28

2.8 Dao dưc nghiên cuu ••* ••••.•••••• *••••.••.•••••••• *••• ••••.••••••••••••.•••.••• ••• •••••••••••••••• •••• 28

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ NGHIÊN cứu _ 30 3.1 Thông tin chung về bệnh nhân 30

3.2 Dặc diểm cùa nhiễm phế cầu khuẩn.— —— — 32

3.2.1 Đặc diem cúa loại phe cầu khuân 32

3.2.2 Dặc diem cùa tuýp huyết thanh 33

s

(.IỈV iJNO IV* Bl'W I • I' ’V ^v•••«■•■■••••••••••••••««•■■•••••••••••••••■•■■••••••••••••.••■■••■■•••.•••••••••••••■■••••••••■ 37

4.1 Một sổ đặc diem cúa dối tượng nghiên cứu-— - - -— — 37

4.1.1 Thông tin chung cua dối tượng nghiên cứu 37

4.1.2 Viêm phôi và tuổi cùa bệnh nhân 38

4.2 Sự phân hổ các type huyết thanh của các chúng phế cầu gây viêm phổi - 38

4.2.1 Phân bỗ các type huyết thanh phế cầu ừ đối tượng nghiên cứu 39

4.2.2 Phân bo các type huyết thanh vã độ Ixio phu bói vaccine phế câu PCV13 theo khu vục dịa lý tại Nghệ An

4.2.3 Ty lộ các type huyết thanh phế cầu được bao phu bời vaccin

DANH MỤC HÌNH

Các ycu tổ độc lực cũa phế cầu (Kadioglu, 2008) 12 Các cư chề truyền gcn ngang: Tiếp hợp (A) Biến nạp (B), Tái nạp (C) và thông qua các

DANH MỤC BÁNG

rinh nhạy cam đối với kháng sinh cua các chung s pneumoniae phân lập từ 1997-2000 17

ĐẠT VÂN ĐÈ

Viêm phôi là một trong những bệnh lý phó biến nhất ờ tre dưới 5 tuồi Tý lộ mac bệnh và tư vong cao không nhùng ớ các nước đang phát triẽn mã ngay cá ờ các nước đã phát tricn Theo ước tinh cứa Tố chức Y tế The giới, hãng năm có den 15 triệu tre cm dưới 5 tuổi tư vong, trong đó nguyên nhân hàng đầu lã viêm phôi 35%, kc den lả tiêu cháy 22% [1J Ỡ Việt Nam viêm phôi vần là nguyên nhàn gây tư vong hàng dầu Theo Nguyền Dinh Hường, ờ nước ta ty lệ tư vong do viêm phôi là 0.2% chiếm 33% lý lộ tư vong do mọi nguyên nhân Nguyên nhân thay dôi tuỳ theo lứa tuổi [2 3 Ị Ớ trc cm viêm phôi do phe cầu

(Streptococcus pneumoniae) thưởng xay ra đột ngột và ram rộ với biêu hiện sốt

rẩt cao dung nạp kém, biên dôi toàn trạng Bệnh thường khó chân doán và diều trị do tôn thương trên X-quang phôi xuất hiện muộn Neu không dược chấn đoán sớm và diều trị kịp thời, bệnh có thé diễn biến nặng, xuẩt hiện các biến chứng như viêm mũ màng phôi, áp xe phôi, tràn khi mãng phôi, trân khi-tràn dịch màng phôi, nhicm khuẩn huyết Phe cầu (S pneumoniae) có kip vo polysaccharide riêng biệt vã cư trú tại vùng mùi họng cùa người(4| Kháng nguyên vo là kháng nguyên quan trọng dê phân loại s pneumoniae, dong thời kháng nguyên này dóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bộnh và lan truyền bệnh trong cộng đong Hiện tại dựa trên phan ứng với kháng huyết thanh dặc hiệu, người ta phân loạt vi khuân s

pneumoniae thành 98 tuýp huyết thanh phế cầu khác nhau [4].

Nhiễm trùng do s pneumoniae có the dự phông vác xin và diều trị bang kháng sinh thích hợp vắc xin phe cẩu dang sư dụng là vac xin cộng hợp, bao gồm một số loại kháng nguyên vó polysaccharide cua vi khuân s pneumoniae Tuy nhiên, khi điều trị việc lạm dụng kháng sinh dà làm xuất hiện vã lan truyền gen kháng thuốc gây can trờ tiến trinh và hiệu qua diều trị Mặc dừ tinh hình khàng kháng sinh có thê thay dối theo từng khu vực hay từng quốc gia nhưng châu Á là một lâm diêm cua kháng kháng sinh Trong khi đó nguồn lực củng như cơ sờ hạ tàng cho giám sát y tê cộng dông còn ràt nghèo nàn.

Dè chân đoản tuýp huyết thanh cua vi khuân s pneumoniae, phương pháp kinh dien là phán ứng phồng vò Quelling Tuy nhiên, phương pháp này thường rất tồn kém mất nhiều thời gian, dẻ gây dương linh giá do phan ứng chéo giừa các kháng huyếl thanh, lại không phái hiện các trường hợp dồng nhiễm nhiều tuýp Trong vài nám gan dây, nhiều nước trên the giới dã phát triển kĩ thuật PCR dê

1

định tuýp huyẽt thanh với ưu diêm lã nhanh, nhạy ít tòn kém có ty lộ phát hiện cao và tý lộ đồng nhiễm các tuýp huyết thanh nhiều hơn so với phương pháp thòng thường Tuy nhiên, cãc kỳ thuật PCR dà dược cóng bô thường chi phù hợp cho từng khu vực nghiên cứu và còn hạn che ve so lượng các tuýp huyết thanh dược phát hiện Việc tim ra một quy trinh xét nghiệm không dựa trên nuôi cay có dộ nhạy và độ đặc hiệu cao cho chân đoán phần lớn các tuýp huyết thanh lưu hành cua phe cầu ơ mỗi khu vực mồi quốc gia là vân de het sức can thiết.

ơ Việt Nam chương trinh giám sát về ty lệ mắc sự lưu hành các tuýp huyết thanh vã các kỳ thuật giai trinh tự Sanger xác định cảc tuýp phế cầu khuẩn s

pneumoniae dà dược thiết lập và lưu hãnh ơ nhiều nơi nhưng còn hạn chế Xuắt

phát từ nhu cầu thực tiền cùng như sự lan truyền gen kháng thuốc ngày càng lớn gây cán trơ tiên trinh diều trị chúng lõi thực hiện dề tài: Nghiên cứu xác định các tuýp phể cầu khuân (Streptococcus pneumoniae) ờ trê em bàng kỹ thuật giãi trình tự Sanger với 2 mục tiêu:

I Xác định ty lệ các tuýp phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) ờ tré em dưới 5 tuổi tại Nghệ An bằng kỳ thuật giai trinh tự Sanger.

2 Bước dầu mó tá sự bao phu cùa vaccine PCV10 và PCVI3 ơ tre em viêm phối do phế cầu khuẩn s pneumoniae tại Nghệ An.

CHƯƠNG I TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan phế cầu khuấn (Streptococcuspneumoniae)

1.1.1 Dinh nghĩa và phân loại phe cầu khuân

về phân loại khoa học s pneumoniae (còn gọi là phế cẩu khuân) là một loài vi khuân Gram dương thuộc ngành Hrmicutcs lớp Bacilli, bộ Lactobacillales họ Streptococcaceac giống Streptococcus vã loài s pneumoniae (Klein 1884; Chester 1901) [5] 5 pneumoniae là vi khuân kỵ khi tuỳ tiện, tan huyết alpha, cỏ kha nâng tan trong muôi mật vã không sinh cnzym catalase Phc câu cỏ lớp vo polysaccharide riêng biệt phân chia chúng thành 98 tuýp huyết thanh khác nhau [4] ('hung mang các tuýp huyết thanh khác nhau ve độc lực tỳ lộ lưu hành theo từng vũng địa lý và tinh kháng kháng sinh.

Phế cầu là vi khuẩn gây bệnh cư trủ tại vùng mùi họng cua người Sự cư trú này thường không có biêu hiện nhưng có thê dần dền phát sinh những tinh trạng nhiễm khuân, dien hình như là viêm phôi cộng dồng (Community-Acquired Pneumonia - CAP) vã nhiễm khuân ờ những vị trí vô trùng (dịch màng phôi, dịch nào túy và máu) gây nhiều cản bệnh xâm lẩn khác như: viêm mãng nào nhiễm khuân huyết, viêm xương, viêm tai giừa viêm phế quan, viêm xoang cấp viêm nội mạc tư cung, viêm màng ngoài lim viêm màng nào và áp xe não dược gọi chung là bệnh phế cầu xâm lẩn (Invasive Pneumococcal disease - IPD) Viêm phổi cộng đồng và bệnh phế cầu xâm lẩn là những căn nguyên chính cùa tý lệ mắc bệnh và từ vong, tạo ra một gánh nặng bệnh tụt đãng kê cho hộ thong y te toàn cầu [6] Tất cá cãc bệnh do phế cầu gây ra dều bắt dầu từ sự cư trú cùa vi khuần

s pneumoniae trong mùi họng, sự cư trú không gây bệnh này tạo ra trạng thái

người lành mang vi khuân không triệu chứng.

1.1.2 Các tuýp huyết thanh cùa Phế cầu khuẩn s pneumoniae

Các kháng nguyên võ cua vi khuân s pneumoniae được săn xuất bới tố hợp gcn nầm trên cùng một vị tri cps cua nhiêm sẳc the xen kè giừa hai gcn dcxB và aliA Bòn gcn dâu tiên là báo tôn và gióng nhau ờ tất cã các tuýp huyết thanh, trong khi phần trung tâm cua locus chứa các gcn dặc hiệu tuýp Trinh tự nucleotide cua cps locus tương ửng với hơn 90 tuýp huyết thanh cua vi khuân phê cảu dà dược xác định và là cơ sơ cho việc phân loại vi khuân s pneumoniae dựa trên kỹ

3

thuật sinh hục phân tư Tại châu Á có 7 kiều tuýp huyết thanh I 5 6A 6B 14 i9F và 23F là phố biển nhất chiếm 58%-66% các bệnh phế cầu khuân xâm lấn ờ các quốc gia.

Tiêm chung cho tre từ sớm sẽ giúp giâm thiêu lác hại cua các cản bệnh do phe cầu gây ra vắc xin phòng ngừa bệnh này san xuất dựa trên vó polysaccharide Vắc xin liên hợp PCV7 (Prevnar 7) PCV10 và PCV13 (Wyeth Phannacauticals, Inc.) dà lần lượt dưa vào triển khai áp dụng ở các nưóc/lành thô khu vực châu À nhưng chưa dược áp dụng lại Việt Nam I liệu qua bao vệ tụi các khu vực này chưa công bố nhưng dược ước linh dựa trẽn dộ bao phu các tuýp huyết thanh.

1.1.3 hề kháng của co- thế dổi vói tác nhâu Phế cầu s pneumoniae

Điều kiện mòi trường ngoài việc liên quan dền type huyết thanh vó dược biêu hiện, còn anh hướng đến kha năng gảy ra bệnh xâm lấn ờ người cua phe cầu dã dưực chứng minh qua những phân lích dịch lễ phân lư Các chung phe cầu có liềm năng xâm lấn cao ờ người khi dược lây nhiễm cho chuột BALB/c và C57BL/6 dà biếu hiện sự khác biệt dáng kê trong dộc lực vã động học cua bệnh giữa 2 dòng chuột, diều này cho thấy vai trò quan trọng cua các yếu tố trong co thế vật chu dối với type huyết thanh và liềm nâng gày bệnh cua phe cầu.

Hơn 30 năm trước, sự quan trọng cũa các protein trong độc lực cua s

pneumoniae dã dược lãm rò Và sự hicu rò về các protein nãy mơ ra một liềm

năng cho sự phát triển vaccine phòng tất ca các tuýp phe cầu số lượng lớn các yeu lo độc lực tiềm năng vaccine được biểt đến tảng một cách đáng kẽ gan đây Trong đó có những yếu tố quan trọng và hứa hẹn cho việc sứ dụng lãm khàng nguyên vac xin bao gôm: vó, thành lè bão protein gan choline, protein bê mặt phe cầu A và c (Pneumococcal surface protein - PspA và PspC), protein cùa neuraminidase dược gan với motif LPXTG, enzyme hyalyronatc lyase (Hyl), ycu tố dộc lực vã bám dinh phế cầu A (PavA), enzyme enolase (Eno), pncumoiysin, enzyme lự ly giai auiolysin A (LytA), nhóm protein gan metal lã kháng nguyên bề mặt phe cầu A (PsaA): yếu tó thu nhận sải A (PiaA) vã yếu tố hấp thụ sắt A (PiuA) [6].

Hình 1.1 Phố cầu khuân (steptococcus pneumoniae)

Đặc tinh kháng khàng sinh cua vi khuân có thê là đề kháng tự nhiên hoặc đề kháng thu được.

Dề kháng tự nhiên là đặc diêm sinh hục cua một loài, thường cỏ dược do

yểu tố di truyền với mục đích báo vệ vi khuân khói tác động cùa kháng sinh Đặc diêm nãy xuất hiện ớ lất ca các cã thê cua loài một cách tự nhiên thay vi lã kết qua cua áp lực chọn lọc tù môi trường hoặc hiện tượng truyền gcn ngang (Horizontal gene tranfer - HGT) Ngoài ra các lồ mãng cùng hạn chế sự xâm nhập cua kháng sinh thông qua sự sàng lọc về kích cờ tinh chất kỵ nước.

Dể khủng thu được lã dề kháng có được nhờ đột biến gcn nhận dược gcn

đề kháng từ bên ngoài thông qua HGT hoặc kểt hợp ca 2 cơ chề này Đồ kháng thu được không xáy ra ớ tầt cá các cá the cua loài mà chi giới hạn ờ một sổ dòng vi khuấn chịu áp lực chọn lọc kháng sinh Thông thường dột biến xáy ra do lỏi trong quá trinh sao chép ADN và với tần suất rất thấp Các đột biền này có thê xay ra ơ một diêm hoặc nhiều diêm khác nhau trên gen cấu trúc hoặc gen diều hòa Trong khi dó cơ chẽ kháng thông qua việc tâng cường biêu hiện cua bơm dây lại do dột biến ư promoter gây ra Các đột biển này cũng dóng vai trò quan trọng trong các cơ chc de kháng khác thay dõi đích tác động, hay thay dôi kha nâng xâm nhập cua kháng sinh qua màng le bão.

1.1.4 Co- chế lau truyền gen kháng kháng sinh

Trong lự nhiên, làn suất dột biển dược duy tri ơ mức rat thâp là nhờ cơ che bao vệ và sứa chửa ADN cũng như cơ chể sưa chừa lồi sai trong quá trinh sao

5

chép ADN cua vi khuân Tuy nhiên, cùng có những loài có ti lệ đột biên rắt cao được cho là do lồi xáy ra trong chính hệ thống sứa chừa lỏi này Chúng đóng một vai trô rất quan trụng trong sự tiền hóa cua tinh de khàng khủng sinh.

Ngoài ra sự xuất hiện cùa các yểu lổ chọn lọc nhưng không liêu diệt vi khuân trong mỏi trường cùng góp phần san sinh ra các “đột biển thích nghi" Loại đột biến này là một trong những nguyên nhân chinh dần den tinh trạng kháng kháng sinh cua vi khuẩn trong diều kiện tự nhiên và dược chửng minh có liên quan den enzyme sửa lỗi ADN polymerases V (umuCD) and IV (dinB).

Cơ chế chú yếu lan truyền gcn kháng kháng sinh lã thông qua việc “truyền ngang" các vật liệu di truyền từ một vi khuân này sang một vi khuân khác theo bốn phương thức: tiếp hợp, biển nạp tai nạp và thông qua các yếu tố truyền gen (Hinh 1.) Các gen khang kháng sinh có the di vào tế bào vi khuân ư dạng ca plasmid mang gen kháng kháng sinh hoặc chi có đoạn gen kháng kháng sinh dể ròi sau đõ ton lại như 1 plasmid dộc lập hoặc lích hợp vảo plasmid nhiễm sằc thê cùa tế bào vi khuẩn nhận.

Hình J.2 Các cơ chế truyền gcn ngang: Ticp hợp (A), Biển nạp (B> Tãi nạp (C) vả

thông qua các yểu tố truyền gcn (D) [14].

Tiếp hợp là quá trinh truyền ADN lừ le bào cho den tc bào nhận thõng qua liêm mao trên bề mật tế bão hoặc yếu lố bám Quá irinh này dược hỗ trợ nhờ các gen trên các plasmid tự nhàn lên hoặc cãc yếu lố liếp hợp lich hợp vào nhiễm sắc thê qua đó cho phép truyền plasmid giừa các cá thê.

6

Bien nạp là quá trinh vi khuân hấp thụ tích hợp và biêu hiện các đoạn ADN trần ngoại bào Dây cùng là cách nhiều gcn kháng kháng sinh đi vào tề bào vi khuân Mật khác, thực khuân thê cũng dõng vai trò quan trọng trong cơ chè tái nạp giúp cho tề bão vụt chủ cũng như chinh bán thán chúng có thế song sót và nhân lên Trong quã trinh nhân lên cua phage, câc lieu the bao gồm ADN cua tể bâo vật chu có thê dược tích hợp vào bộ gen cùa phage, do dó sẽ dược truyền từ tể bâo vật chu này sang tế bào vật chu khác Ó một sổ it loài vi khuân (ví dụ:

Desulfovibno desnifuncans} ADN còn dược truyền thông qua các yếu tố truyền

gcn (gene transfer agcnts-GTA) GTA mang một đoạn ADN ngầu nhiên cùa tế bảo vật chu nhưng không mang ADN mã hóa cho các protein cần thiết cho việc tự nhân lên cua nỏ hay nói cách khác là nó không truyền trọn vẹn toàn bộ các gen cẩu trúc cua nỏ sang te bào mới Dây củng là diem khác biệt chu yếu giữa truyền gcn qua GTA và thực khuẩn the Trong số các cơ che truyền gcn ngang thi tiếp hợp lã cơ che được nghiên cứu nhiều nhất.

Các yếu tố di truyền di dộng (mobile genetic elements) đóng vai trò thiết yếu trong các cơ che truyền gcn ngang nói trên Ớ vi khuẩn Gram âm các yếu tổ di truyền di dộng liên quan trực tiếp đến việc phát tán gcn kháng kháng sinh bao gom: insertion sequence (IS), gene cassettes.'integron vâ transposon.

Trong nhiều trường hợp một cặp IS cỏ thê di chuyên cùng nhau kèm theo một hoặc một vài gcn (vi dụ gcn kháng kháng sinh) nàm ơ giừa sè tạo thành một transposon (composit transposon), thường ký hiệu là Tn Ớ 2 dầu cua transposon cùng sè có trinh lự lặp DR.

IS Transposon

IRl IRr

|0R1ị^,0R| (t>R)|^^:i^|(OR)

Hỉnh 1.3 Cấu trúc cơ ban cua IS transposon [15].

Gene cassette là yếu lổ di dộng nho nhẩt có kích thước dao dộng lừ 500 - 1000 bp vừa đu dê mang một gcn thường là gcn kháng khảng sinh, một vị tri gắn

7

ribosome (nhưng không kèm vái promoter) và một vị tri tái tô hợp attC Mặc dù gen cassette có the tồn tại ờ dụng phân lư mạch vòng nhưng nó lại không the tự di chuyên vã do vậy thường chèn vâo các integron.

Cẩu trúc cùa intcgron bao gồm một vị tri tái tổ hợp attl một gcn intl (mã hóa cho enzyme integrase Intl xúc tác quá trinh tái tổ hợp đặc hiệu giừa vị tri altl I vả vị tri attC trcn gen cassette hoặc giữa 2 vị tri attC đe chèn thêm hoặc loại bo gen cassette) vả một promoter Khi một gen cassette chèn vào một intcgron tại vị tri attl vị tri tái tó hợp này sẽ được lái lạo de cassette thứ hai thứ ba cô thê liếp lục chèn vào Các cassette này sè tách biệt nhau bỡi vị tri attC và tạo thành gen array dỏng vai trò như các operon.

Intl xúc tác tái tồ hợp

Hình 1.4 Cấu trúc cơ ban cua intcgron [16].

Vi khuân phe cầu ton tụi và phát triển dược ơ niêm mạc dường hò hap nhờ cỏ enzym phàn huy IgA cúa biêu mó đường hô hấp Nhờ các protein bề mặt má phe cầu bám dinh độc hiệu vào tể bão biếu mò Tại dãy phan ứng viêm được hình thành nhờ tập trung các tế bào có tham quyền mien dịch, giãi phóng các hóa chất trung gian vã chất hỏa ứng động có nguồn gốc te bào thê dịch, dặc biệt bò thê có vai trò quan trọng trong mien dịch lự nhiên và mắc phái cùa vụt chu chổng lại sự nhiễm phế cầu Phe cầu nhờ vảo vo có kha nâng chống thực bào do đó tránh dược sự thực bào san xuất ra các chất phả huy các lể bào nội mó phá huy khung xương giừa các tế bào cua tó chức, tiép lục bám dính, lan tràn vào tò chức và gây bệnh.

Viêm phôi do phe cầu chiếm 25% ờ những nước phát triên ti lộ này thay dôi tùy theo nghiên cửu: Trong nghiên cứu viêm phôi do phe cầu dựa vào cay máu 11 lộ này chi chiêm 15-20%, nhưng trong nghiên cứu dựa vào xét nghiệm huyết

s

thanh thi tý lệ viêm phôi do phê cầu chiếm 35-40% còn các nghiên cửu dựa vào xét nghiệm dịch tỵ hầu thì ti lộ viêm phôi do phe cầu chiếm tir 18- 47.1%.

1.2 Dịch tề hoe phân bổ các chung phe cầu khuẩn ớ Mệt Nam và (ren the giói:

1.2.1 Trên thể giói

s pneumoniae là một nguyên nhãn hãng đau gãy các bệnh nhiễm trũng cộng

đồng mắc phài như viêm xoang, viêm rai giữa, viêm phổi, viêm màng não nhiễm khuân huyết và đợt cắp cua viêm phế quan mạn tinh (Clinical Microbiology Infection 2001) Một nghiên cửu cat ngang dược tiến hành trên tre em tử tháng 2 den tháng 5 năm 2012 công bố trên tạp chi Nhi khoa toàn cầu 2013 Trong so 234 trê dược sàng lọc 41.03% mang s pneumoniae Xu hướng giam liên quan đen tuổi cùa các chủng s pneumoniae (50.9% ờ tre <3 tuối 40,7% ờ tre từ 3-5 tuổi, 40% ớ nhóm 5 - <8 tuổi và 33.3% ờ nhóm 8- 10 tuồi dà dược quan sát cho thấy 33.2% s pneumoniae de kháng với erythromycin và tetracycline; 29,2% kháng dổi với cotrimoxazol 14.6% kháng dối với chloramphenicol và ciprofloxacin và

10.4% đối vói penicillin.

Tại Anh s pneumoniae là cân nguyên vi khuân gây bệnh dường hô hấp phỏ biền nhất, và là cân nguyên thường gặp gây viêm phổi cộng đồng, với tý lệ tư vong đền lum 20% ơ những người đồng nhiễm nhiễm khuân huyết phe cầu Tại Mỳ sổ liệu ước tinh hàng năm về câc bệnh phế cầu bao gồm: khoang 0.5 triệu ca viêm phôi cộng đông 50.000 ca nhiễm khuân huyết 5.000 6.000 ca viêm màng não vã có den 6 triệu ca viêm tai giữa Trẽn toàn cầu nhiễm khuẩn huyết do phế câu là nguyên nhãn chính gây tứ vong ờ tre sơ sinh tại các nước dang phát trièn chiêm khoáng 25% sỗ ca tư vong có thê phông ngừa ớ tre dưới 5 tuồi và 1.2 triệu ca tư vong sơ sinh hàng năm (8] Tại các quốc gia có tý lộ nhiễm HIV-I cao ty lộ viêm phôi phế cầu và nhièm khuân huyết phế cầu lảng một cách đãng ke và sự táng này tập trung chủ yều ớ nhóm tuôi thanh niên.

Nghiên cứu da trung tâm SOAK cua Hội Vi sinh lảm sảng thực hiện trong năm 2010-2011 cho thấy ti lộ vi khuân s pneumoniae dề kháng penicillin theo tiêu chuẩn mới là 1% nhưng MlCạo cùa penicillin dổi với vi khuân là 3pg ml cao lum so với ghi nhận trước dây là 2pg ml trong nghiên cứu đa trung tâm vào nám

9

2007 Ngoài ra kết quá nghiên cứu SOAR cùng ghi nhận ti lộ đề kháng cao đối với các kháng sinh macrolide (96-97%) clindamycin (85%) cefuroxime (71%), cefaclor (88%) cotrimoxazol (91%) tetracycline (79%) và chloramphenicol (68%) Ti lệ vi khuân kháng amox/clav lã rất thấp, chi 0,3%; tuy nhiên MIC90 của Amox/Clav lã 3pgml cao hơn so vói kết quá nghiên cửu nám 2007 (2ụg/ml) Nghiên cửu cùng ghi nhộn đã có 5% vi khuân kháng dược ofloxacin, so với nám 2007 chưa có vi khuân khàng fluoroquinolones dược ghi nhận.

Theo Am J Trop Med Hyg (2017) nghiên cứu quan sát dược tiền hành tại năm bệnh viện, tử An Độ (Lucknow, Vadu), Madagascar (Antananarivo), Mali (Bamako), và Paraguay (San Lorenzo) ớ tre em trong dộ tuồi từ 2 đến 60 tháng được chân doán viêm phôi Bệnh phàm là dịch dường hô hấp và máu xác định vi rút và vi khuân bằng PCR Các lác nhân vi sinh liên quan đến giam oxy máu khi nhập viện (độ bão hòa oxy < 90%) dược phân tích bang hổi quy logistic đa biển, vã các yêu to liên quan đển tư vong trong bệnh viện 14 ngày dược đánh giá bang hổi quy Cox hai lần Nhìn chung 405 trường hợp viêm phổi (3.338 ngày nằm viện) dà được phân tích; 13 bệnh nhãn tư vong trong vỏng 14 ngày nhập viện Ti lệ thiếu oxy là 17.3 và s pneumoniae trong máu có liên quan den tăng nguy cơ lư vong ớ tre em nhập viện do viêm phôi ờ các nước dang phát triên

Theo Michelow IC và cộng sự (2001) nghiên cứu 154 bệnh nhi nhập viện do viêm phôi tử 2 tháng den 17 tuổi từ 1999 2000 ỡ Mỳ có 44% viêm phôi do

phế cầu 14% do M pneumoniae 9% do Chlamydia pneumoniae 21% do vi nit

phối hợp với phế cầu 19% do vi rút.

Tại Lào một nghiên cứu tương tự dược thực hiện bỡi Moore và cộng sự (2010) dà được tiến hành dê nghiên cứu các ca bệnh phế cầu xâm lấn (invasive pneumococcal disease IPD) và các chung phê cầu khuân lưu hành tại Lào sư dụng phương pháp RT-PCR Trong sổ 10.799 mầu máu 353 mầu dịch tuý sống, chi có 33 mầu bệnh phàm dương tinh với 5 pneumoniae vã trong sỗ dó chung có dộ lưu hành cao nhất tại Lào là chúng I sau đó lần lượt là cãc chúng 5.6A/B/C 14 vả cuổi cùng lã 23F Nghiên cứu mặc dù dà cho thấy sổ liệu sơ bộ ve sự phàn bố cùa các chúng phế cầu khuẩn lại Lào, tuy nhiên, cờ mầu vần cỏn rất nhó nên chưa the mang linh khái quái cho việc ứng dụng vaccine viêm phôi tại Lào.

10

1.2.2 Ờ Việt Nam

ơ Việt Nam củng với suy dinh dường và tiêu chay, nhiễm khuẩn hô hấp cap tinh, đậc biệt lã viêm phôi không chi chiếm ty lệ mac bệnh cao mà còn là nguyên nhân gây tứ vong chú VCU ờ trc dưới 5 tuồi [5J Mặc dù tý lệ mác và tư vong do các bệnh nhiễm khuẩn dà giam so vói những thập ký trước, nhưng viêm phôi vần duy tri tý lệ mẳc và tư vong cao ớ trc em Năm 2008, số ca ARI mới ờ tre em là 623/100.000 dân cư, trong dó bao gồm viêm phôi, viêm xoang, viêm mũi vã viêm phế quàn hoặc viêm tiêu phế quan, số ca tư vong do viêm phôi là 1.02/100.000 ca Tý lộ ca bệnh và lư vong ờ nông thôn cao hon nhicu so với khu vực thành thị và lập trung chu yếu ờ bộ phận dàn số nghèo Tý lệ tư vong cùa tre dưới 5 tuổi ớ nhóm dân số nghèo nhất cao gấp hai lần so với nhóm dàn số giàu nhất Trong những năm gần dây đà cô nhiều nghiên cứu ve cản nguyên gây ARI ờ nhiều vùng trên cá nước.

Nghiên cứu cua Đoàn Thị Hong Hạnh vã cộng sự về tinh nhạy cám khảng sinh cua các vi khuân gày ARI ơ tre em dưới 5 tuổi tại Ưông Bi Quang Ninh cho thấyS pneumoniae chiếm 40% và H influenzae chiếm 32% cân nguyên gãy ARI Nghiên cứu này đà chi ra răng đây là 2 cản nguyên vi khuân gày bệnh AR1 quan trụng nhất Cúng với nhiêu nghiên cứu khác cùng cho thay s pneumoniae là nguyên nhân hàng dầu gãy ARI lụi Việt Nam Tuy nhiên tý lộ nhiễm vi khuân không đổng đcu ớ các khu vực dao động từ 15,5% đen 78.7% Một sổ nghiên cứu dà dược thực hiện ớ nhóm tre dưới 5 tuổi dê tim cán nguyên viêm màng não vi khuân cùng cho thầy cản nguyên chu yếu là H influenzae type b (74.8%) và s

pneumoniae (14.1 %).

Theo Lê Hoàng Son nghiên cữu một số dặc điềm dịch tẻ nguyên nhàn, diêu trị viêm phôi cấp tinh tre em từ 0-3 tuôi lại Can Tho cho thay viêm phôi là bệnh nhiễm khuân hô hấp thường gặp nhát dặc biệt ờ trè dưới 1 tuỏi tre trai bị nhiều hon trò gái bệnh thưởng xay ra trong các mùa mưa Phế cầu là nguyên nhân gây viêm phổi dửng thứ 2 sau H influenzae, chiếm 18.9%,

Theo Quách Ngọc Ngân và cộng sự nghiên cứu đặc điềm lâm sàng và vi sinh cũa viêm phối cộng đồng ờ tre từ 2 tháng đến 5 tuồi tại Bệnh viện nhi dồng Cần Tho thầy, vi khuẩn thường gặp nhất trong cấy dâm là 5 pneumoniae (47.1%) kc đen lã s aureus (20.6%); M caỉan halts (14.7%) H influenzae (8.8%) K.

II

pneumoniae (5.9%) và p aeruginosa (2.9%).

Nghiên cứu cua BMC Infect Dis ơ huyện Ba Vi 818 tre en) lừ 6 đến 60 tháng được chọn tham gia 258 (32%) bị nhiêm trùng đường hó hap lien tục 421 (52%) mang s pneumoniae, và 477 (58%) đà sư dụng kháng sinh trong vòng ba tuần trước đõ Trong sổ 421 chúng phân lập 95% kháng với ít nhất một kháng sinh (401/421) Kháng với co-trimoxazole tetracycline, phenoxymethyl penicillin, erythromycin và ciprotloxacin lần lượt là 78% 75% 75% 70% và 28% Kháng thuốc thấp được ghi nhận dối với amoxicillin (4%) benzyl penicillin (4%) và cefotaxime (2%) Kháng trung gian với amoxicillin là 32% Kha nâng chống da kháng dược nhìn thấy trong 60% Mô hình phó biển nhất lã dồng kháng với co-trimoxazole tetracycline và erythromycin.

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy và sinh học phân tứ úng dụng định tuýp phế cầu

khuan Streptococcus pneumoniae

- Kỳ thuật chân đoản bồng nuôi cầy phàn lập: Khuân lạc vi khuân s pneumoniae trên môi trường thạch máu 5%: Tròn nho dẹt không màu vả cỏ

xu hướng lôm ớ giừa xung quanh khuẩn lạc có quầng lan huyết alpha Vi khuẩn hinh lười mác hay ngọn nến nối dôi gióng hĩnh cập kinh, cũng có thê dứng dơn hay lạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương Nhạy cám optochin (Dường kinh vông vỏ khuân > 14 mm) tan trong muối mật.

- Kỳ thuật sàng lọc phe cầu khuẩn bang PCR (ỉa mồi: Các chung phe cầu phân

lập từ kỳ thuật nuôi cay được sàng lọc bang kỳ thuật PCR Sư dụng cặp gen lytA và cpsA dặc hiệu.

- Kỳ thuật PCR (ỉa mồi phát hiên (tồng thời nhiều tuýp huyết thanh: Áp dụng và

cai lien quy trinh cùa CDC Hoa Kỳ xác định 40 tuýp huyết thanh 8 cùa phế cầu Tỏ hợp các nhóm moi dược thiết lập lại sao cho các tuýp huyết thanh thường gập ờ Việt Nam sẽ dược săp xcp lần lượt theo lân suàt xuàt hiện từ cao xuống Ihẩp, làm giam chi phí khi xét nghiệm mầu.

- Kỹ thuật PCR (ta mồi phát hiện kiêu gen kháng kháng sinh: Áp dụng và cai

tiến quy trinh cùa Nagai (2001) phát hiện các gen đột biển gây kháng kháng sinh: các gen pbplA pbp2X, pbp2B liên quan dèn kháng kháng sinh nhóm

12

beta-lactam: các gen ermB vả mefA gây kháng dồng thời nhiêu dòng kháng sinh cùa macrolides, dindamycine vã tetracycline.

Kỳ thuật Nồng (tộ ửe chi' tồi thiếu (MIC): Nồng dộ kháng sinh tâng dan trong

môi trường nuôi cấy khi dụt đen một nồng độ nhất định nó sẽ ức che dược sự phát triền cua vi khuẩn, và có the quan sât được bằng mất thường.

Kỳ thuật giúi trình tự Sanger: sư dụng các deoxynucleotide dà bị chinh sưa

làm mất nhóm hydroxyl ờ dầu 3’ cùa phân tư dường Nhôm 3’-OH đóng vai trô cho phép gan thèm một nucleotide mới vào chuồi Khi một ddNTP dược thêm vảo chuồi, vi không có nhóm 3‘-OII nén một nucleotide không dược thèm vào phan ứng tỏng hợp sè dừng lại Enzym polymerase xúc tác phán ứng gắn các dNTP vào mạch đơn cua DNA đê kéo dãi mạch ư vị tri 3'-Of I và dừng lại neu gan các ddNTP vào chuỗi.

Hình 1.5 Phương pháp giai trinh tự Sanger

13

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu

2.1 Dổi tượng nghiên cún

Các bệnh nhân nhi (độ tuổi: I tháng - 5 tuổi) đà được chân đoán bệnh viêm phôi do phế cầu (S pneumoniae) diều trị lụi Bệnh viện San nhi Nghệ An Bệnh viện đa khoa Đõ Lương Bệnh viện đa khoa Điền Châu và bệnh viện da khoa Tân Kỳ dược chì định lãm xét nghiệm định tuýp huyết thanh phế cầu khuân tại Viện Công nghệ ADN và Phàn tích Di truyền Hả Nội.

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Bệnh nhân dược chan đoán viêm phôi theo liêu chuẩn TCYTTG và Hướng dần cua Bộ Y 1c với các triệu chứng ho sổt (thân nhiệt > 37.5*0 thơ nhanh X-quang phôi có hình anh nốt mờ phe nang rãi rác hai ben tập trung thành khối mờ đồng nhất chứa đường khi quàn bên trong tương ứng từng thùy phân thủy phôi, có thê có hình anh tràn dịch màng phôi kèm theo.

- Trong bệnh phẩm dịch hô hấp dương tinh với phế cầu s pneumoniae.

- Bố mọ hoặc người giám hộ bệnh nhi dong ý tham gia nghiên cứu.

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Các trường hợp viêm phối do vi khuẩn khác.

- Các trường hợp viêm phôi dồng nhiễm.

- Các trường hợp viêm phôi mắc phai ư bệnh viện dược xếp vào nhóm nhiễm khuân bệnh viện (vào bệnh viện diều trị bệnh khác, sau 48 giờ mac viêm phôi).

2.2 Thời gian và địa điềm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08 2022 đến tháng 05/2023

- Thời gian thu thập số liệu: Từ tháng 08'2022 cho đen khi du cỏ mẫu

14

- Địa diem nghiên cứu: Viện Công nghệ DNA và Phân tích Di truyền Ha Nội.

2.3 Thict kế nghiên cứu

Nghiên cửu được liến hành theo phương pháp mô ta cắt ngang.

2.4 Cỡ mầu và phương pháp chọn màu

• Cờ mẫu: Sứ dụng công thức tinh cờ mẫu nghiên cứu ước tính một tý lộ cùa

Z(1 « 2) : Trị số cua phán phối chuẩn (Z(l - a/2) 1.96) tương ứng với ngưởng tin cậy a 0.05

p : Tý lệ mắc viêm phối do phế cầu theo nghiên cứu tiến cứu VC ti lộ mắc VPPC chọn p 0,471 (p 47.1%) (theo ti lộ mắc VPPC trong nghiên cứu cua Quách Ngọc Ngàn và cộng sự (2013) ơ tre lữ 2 tháng dền 5 tuối lại Bệnh viện Nhi dồng cần Thơ).

q : q = 1-p Ta có q = 1-0.471 = 0.529.

p.í : Độ chinh xác tương đối, chọn £=16% hay £ = 0.16.

Theo công thức, số lượng cờ mầu cần thiết cho nghiên cửu lã n = 169 người, thực te thu dược 193 trường hợp bệnh nhi du tiêu chuẩn lựa chọn.

• Phương pháp chọn mẫu:

Tre từ I tháng tuồi tới 5 tuôi với chân đoản ban dầu là viêm phôi vào diều trị tại Bệnh viện San Nhi Nghệ An Bệnh viện da khoa Dô Lương Bệnh viện da khoa

15

Diễn Châu vã bệnh viện da khoa Tân Kỹ đáp ứng các tiêu chuân lựa chọn vả tiêu chuẩn loại trừ.

16

2.5 Biển sổ và chi sổ nghiên cửu

2 5.1 Các chi số nghiên cứu và tiêu chuẩn đánh giá chi số

Cách thức thu thập sỗ liệu mô tá dặc điềm dịch tễ học - Thông qua hồ sơ phong vấn trực liếp cha mẹ bệnh nhàn.

- Phan hành chinh: Thông tin được thu thập gom tên tuồi (ngày, tháng, nám sinh), giới, địa chi thông tin gia dinh (tên nghề nghiệp, trinh độ vân hóa của bố mọ thu nhập binh quân, nơi sống).

Tuổi cùa tre dược tinh theo quy ước cùa TCYTTG [18]

- Thông tin về các yếu tổ dịch te:

- Địa dư: phân vùng nông thôn, thành thị, mien núi.

Phân bố theo mùa bao gồm: mùa xuân (tháng 2-4) mùa hè (tháng 5-7) mùa thu (tháng 8 10) mùa dông (II 12 1).

Học vần cua bổ mẹ: tiếu học (từ hết lớp 5 trơ xuống) THCS (từ het lớp 9 trơ xuống) THPT (lừ het lớp 12 trờ xuống), trên TIIPT (từ trung cầp, đại học và sau dại hục).

- Nghề nghiệp cùa bỗ mọ: nông nghiệp, cân bộ lự do buôn bán.

Hoàn cánh gia đinh: thu nhập, mức sống SES

Môi trưởng song (đi học ờ nhà tiếp xúc khôi thuốc lá nguồn nước ản và sinh hoạt, số con trong gia đinh, sổ thế hộ trong một gia dinh, kiều nhà ờ, dùng diều hòa).

- I lòi tiền sữ:

o Tiền sư tiêm chung theo chương trinh tiêm chung Quốc gia phông sáu bệnh: lao, bạch hâu (3 mùi), ho gã (3 mùi), uốn ván (3 mùi), bại liệt (3

17

lần), soi và một số tiêm chung theo yêu khác hiện có trên thị trường tiêm chung Việt Nam.

o Tien sứ phát tricn: tinh thần, vận động Đánh giá chậm phát tricn dựa vào tiền sứ bệnh tật được chẩn đoán bời bác sỷ chuyên khoa trước đó.

o Tiền sử bệnh tật: bệnh bầm sinh (tim phối, co quan khác), bệnh hô hấp (hen dị ứng) Đánh giá dựa vào kết luận cua bác sỳ chuyên khoa trước đó.

o Tiên sư dũng thuốc: trước khi đền viện (nhóm kháng sinh, nhóm thuốc chống viêm non-stcroid sổ ngày dùng).

o Tiền sư gia đình (người sốt ho trong 4 tuần qua, người mac hen dị ứng).

Cách thức thu thập sổ liệu mô tã lâm sàng

- Mỏ ta lâm sàng bệnh viêm phôi thòng qua phóng vấn cha mẹ tré Khám tỏng quát phát hiện các triệu chứng vã dẩu hiệu toàn thân, co nâng, thực thể;

Dấu hiệu toàn thân và sinh tồn: tình trạng ý thức, cân nặng, chiều cao nhịp tho mạch, nhiệt dộ.

- Dấu hiệu co nâng:

o Ho (thòi gian xuất hiện, mức độ tinh chẩt cua ho có dòm hay không dòm diễn biến trong quá trình dieu tri): I lo khan (tiếng ho trong, không có dòm) ho đờm (ho thưởng xuyên cỏ dòm có thể khạc ra đờm có màu trong hoặc trăng dục vãng, xanh);

o sồt (thòi gian xuất hiện, mức độ) duợc định nghĩa là khi thân nhiệt cũa trê > 37,5°€ khi cụp nhiệt độ ờ nách cộng thèm 0.5°C; sốt nhẹ (từ 38°c đến dưới 38®5C) sốt vừa (từ 38°c đến dưới 39°C) sốt cao (từ 39®c tro lên);

o Khàn tiếng;

18

Các dâu hiệu thực thè: Phân độ suy dinh dường theo phân loại TCYTTG 2007, chia theo thang diem z score (19].

Dánh giá theo hướng dẫn cúa TCYTTG 2006 về đánh giá triệu chửng lãm sàng được xác định như sau:

o Tho nhanh, khó thờ (Tho nhanh, đếm nhịp thò trong I phút khi tré nầm yên de xác định thở nhanh khi tần số tho tàng lớn hon tằn sỗ thó sinh lỷ Nhịp thờ > 60 lần/phủt với tre từ 1 thang tói dưới 2 tháng tuổi; nhịp thó > 50 lảu phút với tre từ 2 tháng tới dưới 1 tuồi: nhịp tho > 40 lãn phút với tre từ 1 tới dưới 5 tuổi: nhịp thờ > 30 lần/phút với trê từ 5 phút trò lên.

o Khó thó là tho không binh thường, dược mó ta như: tho nhanh, có tiếng thờ khác thưởng, ngực hay bụng di động khác thường;

o Tho gang sức: phập phồng cánh mũi co kẽo co hô hẩp rút lõm lỏng ngực;

o Ngừng thớ: cơn ngừng thó ngan hoặc không thờ;

o Tiếng ran ờ phối (phôi có ran hay ran âm nô ót ngây) Ran ờ phôi được dành giã ờ tất cã trường phôi (phía trước, sau, trên dưới, rốn phôi cùng như vùng ria phôi hai bẽn); Thay đỗi rung thanh (tâng trong trường hợp viêm phôi có tòn thương dông đặc giam trong trường hợp cỏ trân dịch màng phôi).

o Rút lỏm lồng ngực.' dối với tre dưới 5 tuồi: là dấu hiệu phần dưới lồng ngực lòm vào khi tre hít vảo.

o Các dấu hiệu khác có thê gặp trong viêm phôi do phê cầu

+ Herpes môi dó má

+ Thiều mâu huyct tân: Da xanh, vãng da; xuất huyết giâm tiêu cầu

+ Roi loạn tiêu hóa (nôn liêu chây, đau bụng) Rối loạn tim:

19

o Tim to dược đánh giá trên phim chụp tim phôi thảng, chi số tim/ ngực trẽn 50%.

o Tràn dịch mảng tim: Diện tim to trên phim X-quang tim phôi tháng và siêu âm tim có dịch màng lim.

o Nhịp tim nhanh: nhịp tim nhanh tinh theo lửa tuổi:

+ <2 tháng: trên 160 nhịp phút.

+ 2-12 tháng: trên 140 nhịp/phút

+ >12 tháng: trên 120 nhịp/phủt

+ Biêu hiện về than kinh: Cứng gảy kich thích

2.6 Kỳ thuật dịnh type huyết thanh phế cẩu bang phương pháp giái trinh tự Sanger

2.6.1 Nguyẽu vật lỉệu và trang thiết bị

2.6.1.1 Thìểtbị

Máy ly tâm tốc độ cao

- Máy spin down

Máy giái trình tự sanger ABI 3500

- Giá đê dầu tube

- Gang tay y tế

Khâu trang y tể

Dung dịch côn sát khuân

Dung dịch rứa lay

Hóa chat khử trùng

Kinh bao hộ

2.6.1.3 Sinh phấm hóa ch(if

- Quanta - PerfeCTa® Multiplex SuperMix 200 Reactions - Nước cat tinh sạch

- 21 cập mồi và probe dược chia vào 7 set phan ứng (trinh tự các tố họp mỗi cúa mồi set dưực mỏ ta trong các worksheet di kèm)

Báng 2.1 I cn mỗi đoạn dô vã trinh tự gcn cua các mỗi và đoạn dô Tên mồi và đoạn dò Trình tự