Nghiên cứu trong nướcTình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Cam thảo nam trongnước vẫn còn là một đề tài khá mới, chưa được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều.Năm 2006, nhóm nhà k
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CAM THẢO NAM
Danh pháp và phân loại
Cam thảo nam còn có tên là cam thảo đất, dã cam thảo (Trung Quốc), giả cam thảo, có tên khoa học là Scoparia dulcis L., thuộc họ hoa mõm chó (Scrophulariaceae)
Phân loại thực vật (Đỗ Tất Lợi et al, 2004) :
Phân bố: Chi Scoparia có khoảng 10 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới Việt Nam duy nhất có một loài là cây cam thảo nam Hiện nay cây mọc hoang dại ở nhiều nơi, nhất là vùng nhiệt đới Đông Nam Á và mọc cả ở miền Nam Trung Quốc, đặc biệt vùng Quảng Tây, nhân dân cũng dùng cây này với tên dã cam thảo Tại Ấn Độ, Malaisia, Thái Lan, châu Mỹ đều có
Đặc điểm hình thái
Cam thảo nam là một loài cỏ thẳng đứng, cao 30 - 80cm, thân nhẵn, rễ to hình trụ Lá đơn, mọc đối hoặc vòng 3 lá một Phiến lá hình mác hay hình trứng ngược, dài 1,5 - 3cm, rộng 8 - 12mm, phía cuống hẹp lại thành cuống ngắn, mép lá nửa phía trên răng cưa to, phía dưới nguyên Mùa hạ ra hoa nhỏ màu trắng ở kẽ lá, mọc riêng lẻ hoặc thành đôi Quả nhỏ hình cầu, trong chứa nhiều hạt nhỏ, nhăn nheo (Đỗ Tất Lợi et al, 2004) Mùa hoa quả: tháng 5 - 7
Thành phần hoá học
Toàn cây cam thảo nam chứa diterpenoid, flavonoid và acid hữu cơ Các chất diterpenoid bao gồm scoparinol, dulanol, scopadulin, acid scoparic A, B, C,acid scopadulcic A, B Các flavonoid là hymenoxin, apigenin, luteolin, scutelarein,scutelarin methyl ester, linarin, vitexin, isovitexin, vicenin – II Các acid hữu cơ bao gồm acid betulinic, acid dulcisic, acid ifflaionie Ngoài ra, còn có friedelin,glutinol, dulcitol amellin, β – sitosterol, tanin, alcaloid (Trung thảo dược học III,1997).
Tác dụng dược lý
Nhân dân nhiều vùng ở Việt Nam cũng như nhân dân vùng Quảng Tây (Trung Quốc) dùng thay vị Cam thảo bắc để chữa sốt, chữa say sắn độc và giải độc cơ thể Tại Malaysia, Cam thảo nam được dân gian dùng làm thuốc chữa ho. Người dân trên đảo Angti dùng rễ Cam thảo nam làm thuốc để chữa bệnh lậu,rong kinh (Đỗ Tất Lợi et al, 2004).
Amellin là một hợp chất có khả năng làm giảm đường huyết và các triệu chứng của bệnh đái tháo đường, tăng hồng cầu Cũng giống như insulin, amellin không làm hạ đường huyết dưới mức bình thường, mà sự giảm lượng đường trong máu và nước tiểu diễn ra dần dần Nó làm tăng lượng, kiềm dự trữ bị hạ thấp ở người bệnh đái tháo đường và làm giảm hàm lượng sắt trong huyết thanh và các chất tạo cetone trong máu Nó ngăn cản sự tiêu hao mô, tích tụ protein tốt hơn trong chế độ ăn, làm giảm mỡ trong mô mỡ, thúc đẩy quá trình làm lành các vết thương.
Theo Đông y, Cam thảo nam vị ngọt, hơi đắng, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt, giảm ngứa, cầm tiêu chảy, chữa cảm sốt, ho Nó thường được dùng chữa một số bệnh như dị ứng mề đay, rôm sảy, eczema, lở ngứa, cảm mạo, ho hen Ngoài ra cam thảo nam còn có tác dụng bổ tỳ, nhuận phế, thanh nhiệt, giải độc và lợi tiểu
Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước
Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Cam thảo nam trong nước vẫn còn là một đề tài khá mới, chưa được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều.
Năm 2006, nhóm nhà khoa học Phan Minh Giang và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính những diterpenoids loại scopadulan từ Cam thảo nam ở Việt Nam (Phan Minh Giang et al, 2006).
Các hợp chất methoxyflavonoid và coixol được phân lập từ cây Cam thảo nam (Scoparia dulcisLinn.) (Tôn Nữ Liên Hương et al, 2006).
Qua các tài liệu, cho thấy trong nước chỉ nghiên cứu về tác dụng và hoạt tính sinh học của Cam thảo nam dựa vào các bài thuốc dân gian Những nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học của cây Cam thảo nam trong nước còn rất hạn chế.
Từ những năm 1966 đến 1969 các hợp chất thông thường như sitosterol, hexacosanol, D-mannitol, đã được tìm thấy trong cây,sau đó là các hợp chất đặc trưng của loài như dulciol, scropanol, dulciolone cũng đã được phân lập (Chen et al, 1976).
Năm 1976, Chen, C.M và Chen, M.T đã công bố về hợp chất 6- methoxybenzoxazolinone và một loại triterpene là ifflaionic acid từ rễ cây Cam thảo nam, bài viết được đăng trên tạp chíPhytochemistrysố 15 (Chen et al, 1976).
Năm 1988, Kawasaki, M và cộng sự đã phân lập 11 hợp chất flavonoid như apigenin, scutellarein, luteolin, linarin, scutellarin, và một số dẫn xuất của chúng từ dịch chiết ethanol 70% của cây Cam thảo nam (Kawasaki et al,1988).
Còn nhiều nghiên cứu từ nhiều quốc gia khác về thành phần hóa học của loài cây này đã được công bố ở các nước như Bangladesh, Thái Lan, HànQuốc, cho thấy tầm quan trọng của việc tìm hiểu thông tin hóa học về một loại cây có nhiều hoạt tính sinh học và dược học như cây Cam thảo nam.
Một số thành phần hóa học đã được công bố
Bảng 1.1 Chi tiết các hợp chất Benzoxazinoid trong cây Cam thảo nam.
(2R)-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3(2H)-one 2-O-β- glucopyranoside:R1 = β-D-Glc; R2 = H
(2R)-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one 2-O-β- galactopyranoside:R1 = β-D-Gal; R2 = H
7 (2R)-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one 2-O-β- galactopyranoside:R1 = β-D-Gal; R2 = H
Bảng 1.2 Chi tiết các hợp chất Flavonoid trong cây Cam thảo nam ( S dulcis ).
KH Tên chất CTPT và M (amu)
Bảng 1.3 Chi tiết các hợp chất Diterpenoid trong cây Cam thảo nam.
KH Tên chất CTPT và M (amu)
Bảng 1.4 Chi tiết các hợp chất Triterpenoid trong cây Cam thảo nam.
KH Tên chất CTPT và M (amu)
Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu
- Sắc ký lớp mỏng (TLC):
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp sắc ký dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển qua pha tĩnh là chất hấp thụ trơ như silica gel, alumina Pha tĩnh được tráng đều và giữ trên mặt phẳng của tấm thuỷ tinh, plastic hay nhôm Lớp mỏng pha tĩnh thường có chiều dày khoảng 0.25 – 0.5 mm (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Đối với chất hấp thu silica gel thì chất nào có tính phân cực kém hơn sẽ di chuyển nhanh hơn so với chất có tính phân cực mạnh.
Mẫu phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1μl dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, dùng ống vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình giải ly.
Pha động: Là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi, di chuyển chậm dọc theo tấm bảnmỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào lực mao quản.
Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.
Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích.
Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel 60 F254 trên tấm nhôm 20x 20 cm, Merck Để biết được vị trí của vết trên bản mỏng có thể áp dụng các phương pháp sau: soi bản với đèn UV ở bước sóng 365 - 254 nm (ưu điểm của phương pháp này là nhanh, tiện lợi, nhìn được vết mà không bị hao hụt mẫu chất Nhược điểm là vết có thể ở vị trí x trên bản, nhưng mắt lại nhìn thấy vết ở vị trí khác), hoặc nhúng bản vào dung dịch H 2 SO 4 5 - 10% trong ethanol, sấy khô rồi nướng trên bếp điện đến khi hiện màu.
Sắc ký cột thường được tiến hành tại điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh là loại hạt có kích thước tương đối lớn (50 ÷ 150 μm) được nạp trong cột thủy tinh.
Có 2 loại là silica gel pha thường và silica gel pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 ÷ 0,063 mm (240 ÷ 430 mesh), silica gel pha đảo có cỡ hạt từ 30 ÷ 50 μm Mẫu chất cần phân tích được nạp ở đầu cột, trên pha tĩnh Sau đó dung môi giải ly sẽ ra khỏi cột ở bên dưới cột và được hứng vào hủ bi hoặc ống nghiệm Đối với loại cột thường, hợp chất ít phân cực hơn được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn sẽ bị pha tĩnh giữ lại và ra khỏi cột chậm hơn, còn cột đảo thì hợp chất phân cực hơn ra khỏi cột trước và cơ chế bị giữ lại cũng tương tự cột thường.
Nguyên tắc: Những phân tử có kích thước lớn không thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì bị giữ trong lỗ rỗng của gel lâu hơn Như vậy, hỗn hợp mẫu khi đi qua cột sắc ký lọc gel sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự trọng lượng phân tử lớn ra khỏi cột trước, trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi cột sau.
Nhồi gel vào cột: cho các hạt gel đã trương nở ở dạng huyền phù vào cột Cân bằng cột bằng cách cho dung môi giải ly chảy qua cột vài lần.
Đặt mẫu lên đầu cột gel: Dung dịch mẫu đặt lên đầu cột giống như sắc ký cột.
Triển khai sắc ký gel: sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ (nghĩa là sử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp dung môi, khi bắt đầu cho tới khi kết thúc quá trình giải ly chỉ sử dụng một loại dung môi đó) Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần.
1.7.2 Các bước thực hiện quá trình sắc ký
1.7.2.1 Lựa chọn dung môi tiến hành sắc ký
Trước khi triển khai sắc ký cột cần dùng sắc ký bản mỏng để dò hệ giải ly phù hợp theo các bước sau:
- Bước 1: Hòa tan mẫu trong dung môi phù hợp (dung dịch A).
- Bước 2: Chuẩn bị những tấm bản mỏng có kích thước 4x10cm Chấm lên những bản này dung dịch A với nồng độ dung dịch khoảng 2 - 5%.
- Bước 3: Giải ly bản mỏng với những hệ dung môi khác nhau.
- Bước 4: Hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc thuốc thử Từ đó nhận định hệ dung môi phù hợp cho quá trình giải ly cột sắc ký dựa vào giá trị R f
- Trong đó: a: là khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (đơn vị: cm). b: là khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi trên cùng đường đi của vết (đơn vị: cm).
R f chỉ có giá trị từ 0 đến l (vào khoảng 0.2 ÷ 0.3 là được) Đối với mẫu cao thô ban đầu, dung môi giải ly đầu tiên là dung môi đẩy vết ít phân cực nhất lên vị trí có R f = 0,5 và dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí có R f = 0,2 (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
1.7.2.2 Chọn chất hấp phụ cho cột sắc ký.
Thường sử dụng silicagel pha thường cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chất cần tách có độ phân cực thấp đến trung bình, silicagel pha đảo thường được dùng khi cần cô lập các hợp chất phân cực lớn Trong silica gel pha thường thì hợp chất ít phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn được giải ly sau và ngược lại đối với silica gel pha đảo Thông thường để tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25 – 50 lần so với trọng lượng của mẫu chất Chiều cao chất hấp thụ và đường kính trong của cột thường là theo tỉ lệ khoảng 10:1. b a
1.7.3 Nạp chất hấp thu vào cột.
Có hai cách nạp chất hấp thu là: nạp dạng lỏng dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương nở như silica gel, sephadex…và nạp dạng khô dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al 2 O 3 , CaCO 3
Nạp chất hấp thụ dạng lỏng vào cột:
Giữ cột thẳng đứng, cho bông gòn vào phần dưới cột để giữ cho chất hấp thu không bị theo dung môi ra khỏi cột Ổn định cột bằng cách rót dung môi khởi đầu giải ly vào nhiều lần Cho silica gel vào cốc chứa dung môi, khuấy đều và ngâm ít nhất 2 tiếng để silica gel trương nở Lượng dung môi dùng vừa đủ không sệt quá khiến bọt khí bị giữ trong cột và không được quá lỏng Sau đó dùng phễu rót từ từ silica gel vào cột và mở khóa để cho dung môi chảy ra Sau khi nạp xong tiến hành cho lượng dung môi đã chảy ra rót vào cột trở lại vài lần để chặt cột, lưu ý mặt thoáng của silica gel phía đầu cột phải nằm ngang.
Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
- Nguyên liệu: Mẫu nguyên liệu là phần trên mặt đất cây Cam thảo
- Thời gian, địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại PTN Sinh Hoá Dược- Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 10/2019 đến tháng 12/2019.
2.1.2 Hóa chất và dung môi
• Hạt silica gel cỡ hạt 40-60 àm dựng cho pha thường và hạt silica gel pha đảo cỡ hạt 30-50àm, và hạt gel Sephadex LH-20.
• Acetone (VN Chemsol Co., Việt Nam)
• Chloroform (VN Chemsol Co., Việt Nam)
• Ethanol 99,7% (VN Chemsol Co., Việt Nam)
• n-Hexane (Xilong chemical Co., Trung Quốc)
• Ethyl acetate (Xilong chemical Co., Trung Quốc)
• Methanol (VN Chemsol Co., Việt Nam)
• Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: Dùng
H 2 SO 4 /EtOH và soi đèn UV.
Trang thiết bị
• Bộ máy cô quay chân không EYELA CCA-1111.
• Bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck).
• Tủ sấy Memmert ALM400, bể ổn nhiệt Memmert WB7.
• Cân kỹ thuật SHINKO GS 3000g, cân phân tích SHIMADZU ATX224.
• Đèn UV Vilber Lourmat VL - 6LC.
• Cột sắc kí: sử dụng cột cổ điển loại có đường kính 2 cm - độ dài
60 cm và cột có đường kính 2.5 cm - độ dài 80 cm Cột dùng chạy Sephadex có đường kính 2.5 cm - độ dài 80 cm.Cột đảo dùng để chạy có đường kính là 2 cm- độ dài là 35 cm.
Các thiết bị ghi phổ: phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1 H-NMR và 125 MHz cho phổ 13 C-NMR.
Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Cộng hưởng từ - Viện Hóa học, Học việnKhoa học và Công nghệ Việt Nam; địa chỉ: Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận CầuGiấy, thành phố Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
Mua nguyên liệu 22 kg Cam thảo đất (rễ, thân, lá, hoa, quả, ) được thu hái. Sau đó tiến hành rửa sạch, loại bỏ phần hư, đem phơi gió đến khô.Tiếp theo xay nhuyễn thành bột nguyên liệu với khối lượng bằng 6 kg.
Mẫu bột được cho ngâm trong các bình thủy tinh lớn có nắp đậy Rót methanol vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của bột.Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất Sau 24 giờ, dung dịch chiết được lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi.Lặp đi lặp lại quá trình nhiều lần cho đến khi chiết kiệt hết các chất trong nguyên liệu bột ta thu được cao MeOH dạng sệt khối lượng m 1 = 750g Phương pháp điều chế các loại cao được tóm tắt trong sơ đồ.
Sơ đồ 2.1 Phương pháp điều chế các loại cao từ cây Cam thảo nam
(0,78 kg) Bã bột còn lại
- Cô quay thu hồi dung môi
Cao EA (70,0 gam) Dịch sau chiết
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Phân lập và tinh chế các hợp chất có trong cam thảo nam
3.1.1 Khảo sát phân đoạn cao chiết MeOH
Phân đoạn cao MeOH được tiến hành hấp phụ với 40 gam silica gel, sấy khô và nghiền mịn, sau đó tiến hành sắc ký cột với các thông số cột như sau:
- Đường kính cột sắc ký: d = 15 cm.
- Chiều dài cột sắc ký: l = 80 cm.
- Khối lượng silica gel nhồi cột: 400 gam.
- Khối lượng cao MeOH: 60 gam.
Hình 3.1 Săc ký cột nhanh khô cao MeOH của Cam thảo nam.
Hệ dung môi giải ly EA:Me:H2O (v/v/v) với các tỉ lệ thay đổi theo hướng tăng dần độ phân cực (25:1:1, 20:1:1, 10:1:1, 8:1:1, 5:1:1) và cuối cùng là MeOH100% Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằngSKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H 2 SO 4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau (về màu sắc vết và Rf) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên cao MeOH thu được 3 phân đoạn chính (SDM1-SDM3), trong đó các phân đoạn SDM2 cho vết chính rõ, đẹp nên được chọn để khảo sát tiếp.
Sơ đồ 3.1 Tách phân đoạn từ cao Methanol của cây Cam thảo
Bảng 3.1 Kết quả sắc ký bản mỏng cao SDM:
3.1.2 Khảo sát phân đoạn SDM2
Phân đoạn SDM2 tiếp tục thực hiện sắc ký cột nhanh với lượng mẫu m 21,905g, hệ dung môi tăng dần độ phân cực từ EA:MeOH (25:1, 10:1), đến CHCl3:MeOH (30:1, 25:1, 10:1, 8:1) và cuối cùng là MeOH 100% Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau (về màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn SDM2 thu được 8 phân đoạn chính (SDM2.1– SDM2.8).
Phân đoạn Hệ dung môi giải ly Khối lượng
Mô tả bản sắc ký
SDM1 EA:MeOH(20:1) 17,29g Nhiều vết
SDM2 EA:MeOH(8:1) 21,905g Nhiều vết ( bốn vết rõ, đẹp)
SDM3 EA:MeOH(5:1) 20,7g Nhiều vết
Hình 3.2 Kết quả TLC gom phân đoạn của cao SDM2.1 đến 2.8
Bảng 3.2 Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2:
3.1.3 Khảo sát phân đoạn SDM2.7
Phân đoạn SDM2.7 tiếp tục thực hiện sắc ký cột nhanh, hệ dung môi tăng dần độ phân cực CHCl3: MeOH (8:1, 5:1) và cuối cùng là MeOH 100% Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM
Phân đoạn Hệ dung môi giải ly (v/v) Mô tả
SDM2.1 EA:Me (20:1) Nhiều vết
SDM2.2 EA:Me (10:1) Nhiều vết
SDM2.3 CHCl3:MeOH (25:1) Nhiều vết
SDM2.4 CHCl3:MeOH (20:1) Nhiều vết
SDM2.5 CHCl3:MeOH (8:1) Nhiều vết (vết rõ, đẹp)
SDM2.6 CHCl3:MeOH (8:1) Nhiều vết (vết rõ, đẹp)
SDM2.7 CHCl3:MeOH (5:1) Nhiều vết (vết rõ, đẹp)
SDM2.8 CHCl3:MeOH (5:1) Nhiều vết giống nhau (về màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn SDM2.7 thu được 7 phân đoạn chính (SDM2.7.1– SDM2.7.7).
Hình 3.3 Kết quả TLC gom phân đoạn của cao SDM 2.7.
Bảng 3.3 Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2.7.
3.1.4 Khảo sát phân đoạn SDM2.7.7
Phân đoạn SDM2.7.7 tiếp tục thực hiện sắc ký cột Sephadex có khối lượng mẫu 892 mg, hệ dung môi MeOH 100% Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H 2 SO 4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau (về màu vết và R f )
Phân đoạn Hệ dung môi giải ly Khối
SDM2.7.1 CHCl 3 :MeOH (5:1) 92mg Nhiều vết
SDM2.7.2 CHCl 3 :MeOH (5:1) 702mg Nhiều vết
SDM2.7.3 CHCl 3 :MeOH (3:1) 1033mg Nhiều vết
SDM2.7.4 CHCl3:MeOH (3:1) 2071mg Nhiều vết
SDM2.7.5 CHCl 3 :MeOH (3:1) 3576mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.6 CHCl 3 :MeOH (2:1) 3709mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7 CHCl 3 :MeOH (2:1) 892mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn SDM2.7.7 thu được 5 phân đoạn chính (SDM2.7.7.1- SDM2.7.7.5).
Hình 3.4 Kết quả TLC gom các phân đoạn của cao SDM2.7.7.
Từ kết quả trên, đã gom các phân đoạn 1 đến 3 (SDM2.7.7.1), 4 đến 6(SDM2.7.7.2), 7 đến 12 (SDM2.7.7.3), 13 đến 16 (SDM2.7.7.4) và 17 đến 21(SDM2.7.7.5).
Bảng 3.4 Kết quả sắc ký bảng mỏng phân đoạn SDM2.7.7.
Phân đoạn Hệ dung môi giải ly
SDM2.7.7.1 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 15mg Nhiều vếtSDM2.7.7.2 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 144mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7.3 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 435mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7.4 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 162mg Nhiều vếtSDM2.7.7.5 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 245mg Nhiều vết
Sơ đồ 3.2 Sắc ký cột trên cao SDM2 của cây Cam thảo nam.
3.1.5 Khảo sát phân đoạn SDM 2.7.7.2
Phân đoạn SDM2.7.7.2 tiếp tục thực hiện sắc ký cột Sephadex có khối lượng mẫu 144mg, hệ dung môi MeOH 100% Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủy tinh vàđược theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H 2 SO4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau (về màu vết và R f ) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn SDM2.7.7.2 thu được 3 phân đoạn chính (SDM2.7.7.2.1 -SDM2.7.7.2.3).
Hình 3.5 Chấm bản mỏng và giải ly với các hệ Cột saphadex SDM 2.7.7.2.
Bảng 3.5 Kết quả sắc ký bảng mỏng phân đoạn SDM2.7.7.2.
Hệ dung môi giải ly
SDM2.7.7.2.1 20CHCl 3 :6MeOH:1 H 2 O 28mg Nhiều vết
SDM2.7.7.2.2 20CHCl 3 :6MeOH:1 H 2 O 139mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7.2.3 20CHCl 3 :6MeOH:1 H 2 O 38mg Nhiều vết
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ sắc ký cột trên cao phân đoạn SDM2.7.7.2 của cây Cam thảo.
3.1.6 Khảo sát phân đoạn SDM2.7.7.2.2 (kí hiệu B)
Phân đoạn B tiếp tục thực hiện sắc ký cột đảo có khối lượng mẫu
139 mg, hệ dung môi MeOH : H 2 O (1:1) Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H 2 SO 4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM giống
Cột đảo: MeOH:H2O ( 1:3; 1:2; 1:1) nhau (về màu vết và R f ) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn B thu được 3 phân đoạn chính (B1-B3).
Hình 3.6 Kết quả SKCĐ gom phân đoạn của cao B Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột đảo phân đoạn B.
Phân đoạn Hệ dung môi gải ly (v/v)
B1 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 109mg Ít vết (vết rõ, đẹp)
B2 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 20mg Ít vết (vết rõ, đẹp) B3 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O
Không đáng kể Không có vết rõ
Phân đoạn B1 tiếp tục thực hiện sắc ký cột đảo có khối lượng mẫu 109 mg, hệ dung môi MeOH:H 2 O (1:3, 1:2, 1:1) Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử
H 2 SO 4 10% và hơ nóng trên bếp điện Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau (về màu vết và R f ) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn B1 thu được 3 phân đoạn chính (B1.1-B1.3).
Hình 3.7 Kết quả TLC gom phân đoạn của cao B1 thu được 3 phân đoạn chính B1.1,B1.2 và B1.3.
Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột đảo phân đoạn B1.
Phân Hệ dung môi giải ly Khối lượng
B1.1 20CHCl 3 :6MeOH:1H 2 O 36mg Vết hiện rõ, đẹp
20CHCl 3 :6MeOH:1 H 2 O Vết hiện rõ, đẹp
B1.2 8CHCl 3 :2MeOH:0,2H 2 O 19mg →Thu được chất sạch SDM-
B1.3 20CHCl3:6MeOH:1 H 2 O 13mg Vết hiện rõ, đẹp
Xác định cấu trúc định danh hợp pháp
3.2.1.1 Các đặc tính của SDM III
Hợp chất SDM III thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng nhạt.
3.2.1.2 Nhận danh cấu trúc SDM III
Phổ 1 H NMR (MeOD, 500 MHz) xuất hiện tín hiệu của 2 vòng benzene 3 lần thế kiểu ABX tại [δ H 6.75 (1H, s, H-2), 6.72 (1H, d, 7.5 Hz, H-6) và 6.86 (1H, d, 7.5 Hz, H-5)] và [δH 7.21 (1H, s, H-2’), 7.11 (1H, d, 8.0 Hz, H-6’) và 6.84 (1H, d, 8.0 Hz, H-5’)], một nối đôi cấu hình trans tại [δH 6.41 (1H, d, 16.0 Hz, H-β’) và 7.70 (1H, d, 16.0 Hz, H-α’), một nhóm ethyloxyl tại [δ H 2.85 (2H, m, H-β), 3.78 (1H, m, H-α a ) và 4.03 (1H, m, H-α b ), 2 nhóm methoxyl tại [δ H 3.81 (3H, s, 4- OCH 3 ) và 3.91 (3H, s, 3’-OCH 3 )] Ngoài ra, phổ 1 H NMR còn cho thấy tín hiệu của 3 phân tử đường gồm 3 proton anomer tại [δ H 4.40 (1H, d, 8.0 Hz, H-1’’), 5.21 (1H, s, H- 1’’’) và 4.65 (1H, s, H-1’’’’), các nhóm oxymethine trong vùng 3.29 – 4.03 ppm, 2 nhóm methyl bậc ba tại [δ H 1.11 (3H, d, 6.0 Hz, H-6’’’) và 1.22 (3H, d, 6.5 Hz, H- 6’’’’)] và 1 nhóm oxymethylen tại [δ H 3.51 (1H, m, H a -6’’) và 3.578 (1H, m, H b - 6’’)]
Phổ 13 C NMR (MeOD, 125 MHz) kết hợp với kỹ thuật DEPT cho biết SDM III có 37 carbon bao gồm 12 carbon của 2 vòng benzen [δ C 132.8 (C-1), 117.0 (C-2), 147.3 (C-3), 147.5 (C-4), 112.9 (C-5), 121.1 (C-6), 127.6 (C-1’), 111.8 (C-2’), 149.4 (C-3’), 150.8 (C-4’), 112.9 (C-5’) và 124.3 (C-6’)], 2 carbon nối đôi [δC115.1 (C-α’) và 147.9 (C-β’)], 2 carbon nhóm ethyloxyl tại [δC 72.2 (C-α) và 36.6 (C-β)],
1 carbon carbonyl δC 167.9 và 18 carbon của 3 phân tử đường trong cấu trúc củaSDM III gồm 1 glucose tại [δ C 104.5 (C-1’’), 76.1 (C-2’’), 81.5 (C-3’’), 70.4 (C-4’’), 74.6 (C-5’’) và 67.6 (C-6’’)], 2 rhamnose tại [δ C 103.0 (C-1’’’), 72.3 (C-2’’’),72.3 (C-3’’’), 73.7 (C-4’’’), 70.4 (C-5’’’), 18.0 (C-6’’’) và 102.2 (C-1’’’’), 72.0 (C-2’’’’), 71.9 (C-3’’’’), 73.9 (C-4’’’’), 69.8 (C-5’’’’) và 18.3 (C-6’’’’)].
Sự hiện diện của nhóm feruloyl trong SDM III được khẳng định dựa vào các tương quan trên phổ HMBC Tương quan HMBC giữa 2 proton nối đôi cấu hình trans cho tương quan qua lại lẫn nhau và cùng tương quan với carbon carbonyl δC
167.9 Proton H-α’ tương quan với C-1’, proton H-β’ tương quan với C-2’ và C-6’.
Cả 3 proton H-2’, H-5’ và H-6’ cùng tương quan HMBC với carbon olefin mang oxi δC 150.8 (C-4’), đồng thời H-5’ và proton nhóm methoxy lại cùng cho tương quan với carbon olefin mang oxi còn lạiδC149.4 (C-3’).
Tương tự, nhóm 3-hydroxy-4-methoxy-phenylethanol cũng được khẳng định trên phổ HMBC Nhóm methylen [δ H 2.85 (2H, m, H-β)] và oxy methylen [δ H 3.78 (1H, m, H-α a ) và 4.03 (1H, m, H-α b )] cho tương quan qua lại với nhau và cùng tương quan HMBC với C-1 (δ C 132.8) Proton H-β lại cho tương quan HMBC với C-2 và C-6 Ba proton H-2, H-5, H-6 và proton nhóm methoxy δH 3.81 (3H, s, 4- OCH 3 ) cùng tương quan với C-4 (δ C 147.5) xác nhận C-4 mang nhóm methoxyl thứ hai Độ dịch chuyển hóa học của C-3 được nhận ra nhờ vào tương quan HMBC giữa H-2 và H-5 với C-3 (δC147.3).
Hình 3.8 Các tương quan HMBC
Dựa vào độ dịch chuyển hóa học trên phổ 13C NMR và phân loại carbon trên phổ DEPT, 3 phân tử đường được xác định là 1 glucose và 2 rhamnose Hằng số ghép spin của đường glucose trên phổ 1H NMR là 8.0 Hz cho biết glucose có cấu hình β Hai phân tử rhamnose có cấu hình α do proton anomer xuất hiện dạng mũi đơn trên phổ 1H NMR.
Phân tích kỹ các tương quan trên phổ HMBC cho thấy, proton H-4’’ của glucose cho tương quan J3 với carbon carbonyl chứng tỏ nhóm feruloyl phải gắn vào nhóm OH trên C-4’’ thông qua liên kết ester Điều này được tái xác nhận dựa vào độ dịch chuyển hóa học của proton H-4’’ bị dịch chuyển về phía trường thấp [δH 5.03 (t, 9.5Hz, H-4’’)] Tương quan qua lại giữa proton H2-α với carbon anomer của glucose cho biết nhóm 3-hydroxy-4-methoxy-phenylethanol phải gắn vào C-1’ của glucose Proton anomer của phân tử rhamnose thứ nhấtδH 4.65 (1H, s, H-1’’’’) cho tương quan với C-6’’ của glucose, proton anomer của rhamnose thứ hai δH 5.21 (1H, s, H-1’’’) lại tương quan với C-3’’ khẳng định hai phân tử rhamnose gắn vào C-6’’ và C-3’’ của glucose thông qua liên kết O-glycoside.
Từ các phân tích phổ nêu trên kết hợp với tài liệu tham khảo, hợp chất SDM III được xác định là: 3-hydroxy-4-methoxy-β-phenylethoxy-3,6-di-O-(α- rhamnopyranosyl)-4-O-E-feruloyl-β-glucopyranoside (Ferruginoside C).
Hình 3.9 Tương quan HMBC của các phân tử đường trong SDM III.
Bảng 3.8 So sánh số liệu phổ của SDM III và Ferruginoside C.
HMBC ppm ppm (J, Hz), (J, Hz)
HMBC ppm ppm (J, Hz), (J, Hz)
HMBC ppm ppm (J, Hz), (J, Hz)
Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất SDM III (3-hydroxy-4- methoxy-β-phenylethoxy-3,6-di-O-(α-rhamnopyranosyl)-4-O-E-feruloyl-β- glucopyranoside (FerruginosideC)).
HMBC (H→C) δ C ppm 125MHz δ H ppm (J, Hz)
