UI w Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DICHLOROMETHANE VÀ HOẠT TÍNH SIN[.]
UI w Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DICHLOROMETHANE VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NGÃI ĐEN (Kaempferia parviflora) Sinh viên thực Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 Ì1 — : Phạm Tiến Lộc : Cơng nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẢN HĨA HỌC CAO DICHLOROMETHANE VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NGÃI ĐEN (Kaempferia parviflora) Sinh viên thực : Phạm Tiến Lộc Mã số sinh viên :1411513790 Lớp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dần : PGS.TS Mai Đình Trị TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường lời cảm ơn chân thành tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt luận văn Đặt biệt em xin gửi đến thầy PGS.TS Mai Đinh Trị, người tận tình hướng dần quan tâm dạy để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp với lời cảm ơn sâu sắc Trong trình thực tập, trình làm luận văn thực tập, kinh nghiệm em hạn chế nên cịn nhiều sai sót Em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến quý thầy, để hồn thiện có thêm nhiều kinh nghiệm để hoàn thành đạt kết tốt Cuối cùng, em xin kính chúc q thầy, ln dôi sức khỏe, hạnh phúc thành công cơng việc Phạm Tiến Lộc Khoa Cơng nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyền Tất Thành ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Mục lục iii Tóm tắt V Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục hình ix Danh mục bảng X ĐẶT VÁN ĐỀ CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Ngãi đen .3 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Phân bố Thời gian sinh trưởng 1.2 Công dụng cùa Ngãi đen 1.2.1 Công dụng Ngài đen theo y học đại 1.2.2 Công dụng Ngãi đen theo y học cố truyền 1.3 Thành phần hóa học Ngãi đen 1.4 Hoạt tính sinh học Ngãi đen 11 1.4.1 Hoạt tính bảo vệ gan 11 1.4.2 Hoạt tính kháng viêm 12 1.4.3 Hoạt tính chống dị ứng 12 1.4.4 Hoạt tính tim mạch 12 1.4.5 Hoạt tính chống lỗng xương chống oxy hóa 13 1.4.6 Hoạt tính tình dục 13 1.4.7 Hoạt tính ức chế epoxide hydrolase tự nhiên (sEH) .13 CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 14 2.1 Thời gian địa điểm 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Hóa chất dung cụ thiết bị 14 iii 2.3.1 Hóa chất 14 2.3.2 Dụng cụ 14 2.3.3 Thiết bị phân tích 15 2.4 Nguyên liệu 15 2.5 Phuơng pháp nghiên cứu 15 2.5.1 Phương pháp phân lập hợp chất .15 2.5.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 16 2.5.3 Phương pháp thừ nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào SRB 16 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Xử lý mẫu 18 3.2 Điều chế loại cao 18 3.2.1 Điều che cao ethanol 18 3.2.2 Điều chế loại cao từ cao ethanol .18 3.3 Phân lập hợp chất cao dichlomethane 19 3.4 Khảo sát cấu trúc họp chất 22 3.4.1 Khảo sát cấu trúc họp chất 22 3.4.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất 24 3.5 Ket thử hoạt tính gây độc tế bào 27 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 31 iv TÓM TẮT Ngãi đen (Kaempferia parviflorci) thân thảo, có truyền thống sử dụng y học dân gian Đe tài được thực với mục tiêu “Khảo sát thành phân hóa học cao dichloromethane hoạt tính sinh học từ Ngãi đen (Kaempferia parviflora)” Được thưc từ tháng 02/2018 đến tháng 8/2018 phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học: Viện Cơng nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học Cơng nghệ Việt Nam, số 01 Mạc Đĩnh Chi, quận 1, phường Ben Nghé, TP Hồ Chí Minh Đe tài có nội dung: Từ bột thân rễ khô tiến hành ngâm thu dịch chiết ethanol, từ dịch chiết ethanol điều chế cao có độ phân cực tăng dần kỳ thuật chiết lỏng-lỏng Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cao chiết Các hợp chất hóa học cao phân đoạn dichlomethane phân lập tinh chế phương pháp sắc ký cột (SKC) kết họp với sắc ký lóp mỏng (SKLM), sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đe xác định cấu trúc hóa học họp chất Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: - Từ kg bột thân rễ khô Ngãi đen chiết với ethanol lần (3 lần X 30 lít, tong cộng 90 lít) nhiệt độ phịng thu ethanol tống (360 g) Từ cao ethanol sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng thu cao chiết là: cao /7-hexane (25 g), cao dichlomethane (126 g), cao ethyl acetate (95 g), cao nước (54 g) Cao dichlomethane (126 g) tiến hành sắc ký cột với dung môi (/7-hexane-ethyl acetate) thu phân đoạn Tại phân đoạn D.III lọc cách sử dụng sắc ký cột silica gel với dung môi (/7-hexane-ethyl acetate, /7-hexane-chloroform) thu đem xác định cấu trúc hóa học 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone 5-hydroxy,7- methoxyílavone - Cặn chiết ethanol cao phân đoạn thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào phương pháp SRB nồng độ 100 pg/mL, thí nghiệm ống nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cao chiết /7-hexane, dichloromethane, ethyl acetate EtOH cho thấy phần trăm ức chế phát triến tế bào tương ứng 30,49%, 40,41%, 56,90% 52,32% dòng tế bào ung thư vú MCF-7, phần trăm ức chế với tế bào ung thư gan HepG2 25,86%, 30,12%, 59,95% 50,38 % V SUMMARY Kaempferia parviflora is herbaceous plant Its rhizome has been used in folk medicine This research with the objective “Study on chemical components of dichlomethane extract and the bioactivities from Kaempferia parviflora” Executed from February 2018 to August 2018 at Bioactive compounds laboratory: Institute of Chemistry, Viet Nam Academy of Science and Technology, 01 Mac Dinh Chi Street, Ben Nghe Ward, District 1, Ho Chi Minh city The topic has content: Dried rhizomes of Kaetnpferia parviflora was extracted by ethanol Then, ethanol extract was under went further separation by liquid-liquid extraction method to fractionize to total ethanol extract with the increasing of polarity Test of activity cytotoxic from extracts The chemical components from dichlometathane extract were isolated and purifield by column chromatography (CC) coupled with thin layer chromatography (TLC) method Structures of these compounds have been elucidated by spectroscopic method: NMR (Nuclear Magnetic Resonance) The results obtain after months to study: - Dried rhizomes (4 kg) of Kaempferia parviflora were extracted with ethanol for three times (3 X 30 L, total amount 90 L) at room temperature to obtain 360 g) From ethanol extract using liquid-liquid extraction method was extracts: 77-hexane (12 g), dichlomethane extract (126 g), ethyl acetate extract (95 g) and H2O extract (54 g) The dichlomethane extract (126 g) was subjected to silica gel cc (/7-hexan-ethyl acetate) to give fractions At Fractions D.III were purified by using silica gel cc (/7hexan-ethyl acetate, 77-hexane-chloroform) to yield 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone and 5-hydroxy,7-methoxyflavone - Test of activity cytotoxic from ethanol extract and fractions with SBR method At the concentration of 100 pg/mL, in vitro cytotoxic activity of 77-hexane, dichlomethane, ethyl acetate and ethanol extracts of rhizomes of Kaempferia parviflora were evaluated against human breast carcinoma (MCF-7) and human hepato cellular carcinoma (HepG2), with values 30%, 49%, 40%, 41%, 56,90%, 52,32 % (MCF-7) and 25%, 86%, 30%, 12%, 59,95%, 50,38 % (HepG2) respectively VI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẤT 'H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ('H Proton Nuclear Magnetic Resonance) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarrization Transfer ESI-MS: Đo khối lượng (Electrospray Ionization-Mass spectrometry) H: /7-Hexane EA: Ethyl acetate CC: Sac ký cột (Column chromatography) TLC: Sac ký lóp mỏng (Thin layer chromatography) C: Chloroform CH2CI2: Dichlomethane IC50: Half maximal inhibitory concentration ppm: Part per million (Một phần triệu) L: Lít (Litre) ơ: Chemical shift (Độ chuyến dịch hóa học) MCF-7: Ưng thư vú (Human breast adenocarcinoma) Hep G2: Ưng thư gan (Human hepatocyte carcinoma) t: Mũi ba (Tripet) s: Mũi đon (Singlet) d: Mũi đôi (Dubblet) m: Multiplet (Mũi đa) J: Hằng số ghép spin Hz: Hertz TT: Thứ tự SRB: Sulforhodamine B FBS: Huyết thai bò (Fetal bovine serum) HMBC: Tưong quan H-C qua nhiều nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC: Tưong quan H-C qua nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) MS: Khôi phô (Mass spectroscopy) NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) 13C-NMR: Phô cộng hưởng từ hạt nhân proton (13c Proton Nuclear Magnetic Resonance) vii SKC: Sắc Ký Cột SKLM: Sắc Ký Lớp Mỏng Vlll DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Ngãi đen Hình 1.2 Lá hoa Ngãi đen Hình 1.3 Thân rề Ngãi đen Hình 3.1 Cấu trúc hóa học tương quan HMBC họp chất Hình 3.2 Cấu trúc hóa học tương quan HMBC họp chất Sơ đồ 3.1 Sơ đồ điều che cao tống cao phân đoạn Sơ đồ 3.2 Sơ đồ cô lập họp chất từ phân đoạn D.III IX ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẢN HÓA HỌC CAO DICHLOROMETHANE VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NGÃI ĐEN (Kaempferia. .. ethanol cao phân đoạn thử hoạt tính sinh học Nhận thấy cơng dụng đặc biệt thân rễ Ngãi đen chọn đề tài: ? ?Khảo sát thành phần hóa học cao dichloromethane hoạt tính sinh học Ngãi đen (Kaetnpferia parviflora)? ??... dụng Ngài đen theo y học đại 1.2.2 Công dụng Ngãi đen theo y học cố truyền 1.3 Thành phần hóa học Ngãi đen 1.4 Hoạt tính sinh học Ngãi đen 11 1.4.1 Hoạt tính bảo vệ