Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGVYENTAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẢN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO ETHYLACETATE[.]
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGVYENTAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẢN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO ETHYLACETATE TỪ CÂY NGÃI ĐEN (Kaempferia parviflora) Sinh viên thực :Phạm Mai Như Quỳnh Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 :Công nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGƯYẺN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO ETHYLACETATE TỪ CÂY NGÃI ĐEN (Kaempferia parviflora) Sinh viên thực hiện: Phạm MaiNhư Quỳnh Mã số sinh viên: 1411514117 Lóp: 14DSH02 Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Giáo viên hướng dần: PGS.TS Mai Đình Trị TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ON Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp (Chun ngành Cơng nghệ sinh học), em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Mai Đình Trị tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho em suốt thời gian thực tập vừa qua Mặc dù thầy bận công tác vần định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho em để em hoàn thành tốt nhiệm vụ làm luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nguyền Tất Thành, Khoa Công nghệ sinh học, quý thầy cô phụ trách chuyên ngành Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp em hồn thành tốt báo cáo Trong q trình làm báo cáo, kiến thức chuyên môn kinh nghiệm thực tiền cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp từ q thầy để em có thêm nhiều kinh nghiệm hoàn thành tốt hon báo cáo tốt nghiệp tới Sau khơng thể nói để tỏ lịng biết ơn chân thành em, em xin kính chúc sức khỏe đến thầy, đặc biệt thầy Mai Đình Trị, chúc thầy, cô dồi sức khoẻ để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau ngày có thêm nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học thật bổ ích Một lần nữa, em xin chân thành cám ơn! Phạm Mai Như Ọuỳnh Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành 11 MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Tóm tắt V Danh mục chừ viết tắt vii Danh mục hình viii Danh mục bàng ix ĐẶT VÁN ĐỀ CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Nguồn gốc đặc điểm hình thái Ngãi đen 1.1.1 Nguồn gốc .2 1.1.2 Phân bố - Thời gian sinh trường 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.2 Công dụng Ngài đen 1.2.1 Công dụng Ngãi đen theo y họccổ truyền 1.2.2 Công dụng Ngãi đen theo y họchiệnđại 1.3 Thành phần hóa học Ngãi đen 1.4 Hoạt tính sinh học ngãi đen 12 1.4.1 Hoạt tính kháng viêm 12 1.4.2 Hoạt tính kháng kháng sinh 12 1.4.3 Hoạt tính kháng vi rút 13 1.4.4 Hoạt tính kháng enzym cholinestrase 13 1.4.5 Hoạt tính chống dị ứng .13 1.4.6 Các hoạt tính chổng lỗng xương chống oxy hóa 14 1.4.7 Hoạt động tim mạch 14 CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 2.1 Nơi thực hiện, thời gian, đối tượng nghiên cửu 15 2.2 Dung mơi - Hóa chất 15 iii 2.3 Thiết bị - máy móc - dụng cụ 15 2.4 Nội dung nghiên cứu 15 2.5 Thu hái nguyên liệu 15 2.6 Phương pháp nghiên cứu 16 2.6.1 Phương phap chiết xuất, phân lập họp chất 16 2.6.2 Phương pháp xác định cấu trúc họp chất 16 2.7 Chuẩn bị sắc ký cột 16 2.7.1 Cho silica gel vào cột 16 2.7.2 Cho cao vào cột 16 2.6.1 Nhồi cột 20 2.6.2 Cho cao vào cột 20 2.6.3 Phân lập họp chất từ cao EtOAc 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Xử lý mẫu 17 3.2 Điều chế loại cao 17 3.2.1 Điều chế cao tổng 17 3.2.2 Điều chế cao phân đoạn 17 3.3 Phân lập họp chất từ cao EtOAc 19 3.4 Khảo sát cấu trúc hợp chất KP01 .21 3.5 Khảo sát cấu trúc họp chất KP02 .24 3.6 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 27 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 Kết luận 28 Đề nghị .28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 31 IV TÓM TẮT Ngãi đen (Kaempferia parviflora) thân thảo lâu năm , phân bố chủ yếu vùng Đông Nam Á Cây Ngãi đen thảo dược quý, có nhiều cơng dụng chừa bệnh sử dụng y học dân gian Đề tài thực từ tháng 2/2018 - 8/2018 phịng Cơng nghệ chất có hoạt tính sinh học: Viện Cơng nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, số Mạc Đĩnh Chi, Phường Bến Nghé, Quận 1, TPHCM Nội dung: Từ 4,0 kg thân rễ Ngài đen thu hái An Giang, điều chế 360 g cao Ethanol 96%, sau chiết phân bố với dung môi /7-hexane, dichloromethane, ethyl acetate nước thu cao tương ứng /7-hexane(25 g), dichloromethane(126 g), Ethyl acetate(95 g) nước(54 g) Ờ nồng độ thử nghiệm 100 pg/mL cao chiết /7-hexane, dichloromethane, ethyl acetate Ethanol cho thấy phần trăm ức chế phát triển tế bào tương ứng 30,49, 40,41, 56,90 52,32% dòng tế bào ung thư vú MCF-7, phần trăm ức chế với tế bào ung thư gan HepG2 25,86, 30,12,59,95 50,38 % Các hợp chất hóa học cao phân đoạn dichloromethane phân lập tinh chế phương pháp sắc ký cột (SKC) kết họp với sắc ký lóp mỏng (SKLM), sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc hóa học họp chất Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Từ cao Ethyl acetate phân lập xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết KP01 (acid oleanolic), KP02 (acid ursolic) ) Đây lần đầu công bổ họp chất loài Kaempferia parviflora Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cao chiết phương pháp SRB Xác định cấu trúc hóa học họp chất tinh khiết V SUMMARY Kaempferia parviflora is a perennial herb, mainly distributed in Southeast Asia Kaempferia parviflora is a precious herbal plant, has many healing properties used in folk medicine The subject executed from February 2018 to August2018 at Bioactive compounds laboratory: Institute of Chemistry, Viet Nam Academy of Science and Technology, 01 Mac Dinh Chi Street, Ben Nghe Ward, District 1, Ho Chi Minh city Content: Powdered rhizomesof Kaempferia parvifloraịẠ.Ồ kg) were extracted with 96% EtOH for three times(3x30 L, total amount 90 L) at room temperature, fltered residue, removed solvents underlow pressure, obtained crude extract (360 g) Then, crude extract was added water andsuccessively partitioned into /7-hexane (25 g), CHCh (126 g), EtOAc (95 g) and the aqueousportion (54 g) At the concentration of 100 pg/mL the n-hexane, dichlomethane, ethyl acetate andethanolextracts exhibited inhibitory activity againsttwo human cancer cell lines MCF-7, HepG2 cytotoxic activity with values 30,49, 40,41, 56,90, 52,32 % (MCF-7) and 25,86, 30,12, 59,95, 50,38 % (HepG 2)respectivery The chemical components from dichlometathane extract were isolated and purifield by column chromatography (CC) coupled with thin layer chromatography (TLC) method Structures of these compounds have been elucidated by spectroscopic method: NMR (Nuclear Magnetic Resonance) The results obtain after months to study : Further separation and purification of dichloromethane extract, we isolatedandidentified the structure of two compounds This is the first report of compounds KP01 (acid oleanolic) KP02 (acid ursolic) from the species Kaempferia parviflora These were examined for cytotoxic activity using SRB methods Determination of chemical structure of pure compounds vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT 13C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proon (13c Proton Nuclear MagneticResonance) 1D/2D-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (One/ Two- Dimensiona Nuclear Magnetic Resonance) 'H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ('H Proton Nuclear MagneticResonance) CC: Sắc ký cột (Column chromatography) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarrization Transfer DMF: Dimethoxyflavon EA: Ethyl acetate ESI-MS: Đo phổ khối lượng ( Electrospray Ionization Mass Spectrometer) HMBC: Tương quan H-C qua nhiều nối(Heteronuclear Multiple Bondcoherence) HSQC: Tương quan H-C qua nối (Heteronuclear SingleQuantumCorrelation) IR: Phổ hồng ngoại (Infra red ) MS: Khối phổ ( Mass spectroscopy) NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic Resonance ) PMF: Pentamethoxyflavon SKBM: Sắc ký mỏng SKLM: Sắc ký lóp mỏng SKC: Sắc ký cột TLC: Sắc ký lóp mỏng ( Thin layer chromatography) TMF: T rimethoxy flavone ƯV-VIS: Phổ tử ngoại khả biến ( Ultra violet Visible) V11 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng Ngãi đen (Kaempferia parviflora) Hình 1.2 Hình dạng Ngãi đen (Kaetnpferia parviflora) Hình 1.3 Hình dạng hoa Ngãi đen (Kaempferia parviflora) Hình 1.4 Hình dạng thân rề Ngãi đen (Kaempferiaparviflora) Hình 3.4 Cấu trúc tương quan HMBC họp chất KP01 Hình 3.5 Cấu trúc tương quan HMBC họp chất KP02 Sơ đồ 3.2 Quy trình điều chế cô lập họp chất cao ethyl acetate từ thân rề Ngãi đen (Kaempferia parviflora ) Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập họp chất phân đoạn K.III K.IV viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.3 Thành phần hóa học Ngãi đen Kaempferia parviflora Bảng 3.3 Kết SKC silica gel cao ethylacatate Bảng 3.4 Dừ liệu phổ NMR của họp chất KP01 Bảng 3.5 Dừ liệu phổ NMR của họp chất KP02 Bảng 3.6 Kết thừ hoạt tính gây độc tế bào ix ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGƯYẺN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO ETHYLACETATE TỪ CÂY NGÃI ĐEN (Kaempferia. .. Ngãi đen theo y họccổ truyền 1.2.2 Công dụng Ngãi đen theo y họchiệnđại 1.3 Thành phần hóa học Ngãi đen 1.4 Hoạt tính sinh học ngãi đen 12 1.4.1 Hoạt tính kháng viêm... khảo sát thành phần hóa học hoạt tính sính học cao ethylacetate thân rễ Ngãi đen (Kaempferia parviflora) nguồn dược liệu phù hop, dề tìm Việt Nam so sánh với nghiên cứu trước nước nước Ngãi đen