Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả những thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học của Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, những người đã đi cùng em từ lúc em còn non nớt bước vào trường cho đế
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss)
1.1.1 Giới thiệu loài & nguồn gốc
Cây xà cừ, hay còn gọi là cây sọ khỉ (Khaya senegalensis), thuộc họ Xoan, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Phi và Madagascar Loài cây này phân bố rộng rãi từ Mauritania, qua rừng sa mạc Sahara, đến đông bắc Uganda và các quốc gia như Cameroon, Cộng hòa Trung Phi, Chad.
Sến/Lim thường xanh (Khaya senegalensis) là loài cây bản địa ở các nước Tây Phi như Bờ Biển Ngà, Guinea Xích Đạo, Gambia, Ghana, Guinea, Guinea-Bissau Mali, Niger, Nigeria, Senegal, Sierra Leone, Sudan, Togo, Uganda Ngoài ra, loài cây này còn có mặt tại các quốc gia khác như Úc, Cuba, Ấn Độ, Indonesia, Puerto Rico, Singapore, Nam Phi và Việt Nam Riêng tại Việt Nam, cây xà cừ có thể được tìm thấy ở nhiều vùng miền, đặc biệt phổ biến ở phía Nam và Tây Nguyên, thường xuất hiện tại các đô thị, trạm y tế, bệnh viện, trường học, ven đường và thậm chí trong cả khuôn viên nhà dân.
Chi: Xà cừ, Sọ khỉ (Khaya)
Loài: Gỗ gụ Senegal (Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss)
Xà cừ (Khaya senegalensis): Đại mộc cao 15-30 m, đường kính khoảng 1,0-2,5 m
Vỏ non có màu xám, nhẵn, bong vẩy tròn Vỏ khi nứt có nhưng khoanh tròn như cái sọ nên cây còn có tên gọi khác là sọ khỉ Các lá mọc so le, lá non có màu tím nhạt, lá chét mọc đối hoặc gần giống, hình elip đến thuôn dài 5-12 cm x 2,5-5 cm, mép toàn bộ, mỏng như da, sáng bóng, gân lá nhọn với 8-10 cặp gân bên
Hoa xếp thành chùm ở nách hoặc dường như ở cuối dài tới 20 cm, hoa nhỏ có màu trắng xếp thành cụm Hoa đơn tính, hoa đực và hoa cái, hình dáng rất giống nhau, cuống dài 1-2 mm, đài hoa chia thùy gần như tận gốc, có thùy tròn dài 1,5 mm, nhị hoa hợp thành ống hình bầu dài 5 mm, thường có 8 bao phấn ở gần đỉnh, xen kẽ với
5 các thùy tròn, đầu nhụy hình đĩa Hoa đực có bầu noãn thô, hoa cái có bao phấn nhỏ hơn, không phân nhánh
Quả mọc thẳng, gần hình cầu, quả nang hóa gỗ, đường kính 4–6 cm, màu xám nhạt đến nâu xám, phân thành 4 van, nhiều hạt Hạt hình đĩa hoặc hình tứ giác, dẹt mạnh, có cánh hẹp quanh mép, màu nâu Cây con có khả năng nảy mầm dưới lá mầm, các lá mầm còn lại nằm trong vỏ hạt, trụ trên lá mầm dài 5-6 cm, hai lá đầu mọc đối, đơn giản [1]
Hiện nay, với đặc tính dẻo dai và các thớ gỗ liên kết chặc chẽ rất ít bị giãn nỡ ra nên gỗ xà cừ dễ uốn nắn, thiết kế tạo hình dạng và mang giá trị kinh tế rất cao Trong trang trí nội thất, gỗ xà cừ không chỉ mang những ý nghĩa về phong thủy nhất định mà còn mang lại cho nhưng căn phòng sau khi trang trí sẽ thêm phần trang trọng hơn Gỗ xà cừ được sử dụng để chế tạo những đồ, vật dụng gia dụng khác nhau có tuổi thọ cao Đối với cảnh quan môi trường, rễ cây xà cừ có thể bám chặt trên đất, chống chịu mưa bão, xói mòn đất Thân cây lớn, nhiều cành, tán lá nhiều, xum xuê nên thường được trồng nhiều ở các khu đô thị để tạo nên không gian xanh và làm bóng râm che mát
Hình 1 1 Cây xà cừ (Khaya senegalensis A.Juss)
6 Đối với y học, có tác dụng đáng ngạc nhiên trong chữa các bênh như bệnh ho, ghẻ, các triệu chứng đau nhức, sưng tấy, sốt rét, tiêu chảy và các bệnh về da liễu Ngoài ra, cây xà cừ có thể phát triển ngay trên những vùng đất khô cằn, ít bị sâu bệnh gây hại nên rất dễ trồng và mang lại giá trị kinh tế rất cao.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học
Ngày nay, cấu trúc limonoid của cây xà cừ đã được xác định là phong phú và đa dạng Một số công trình khoa học đã nghiên cứu thành phần hóa học của loại cây này.
1.2.1 Các nghiên cứu trong nước
Năm 2016, Vũ Thị Hiền và cộng sự, thành phần hóa học của quả Khaya senegalensis có bốn limonoid, seneganolide A (1), khayanone (2), khayanolide B (3),
6-acetoxy-methyl angolensate (4), và hai flavonoid, (-)-epicatechin (5) và quercitrin (6) được phân lập từ chiết xuất etyl acetat của quả Khaya senegalensis [1]
1.2.2 Các nghiên cứu từ nước ngoài
Năm 1982, Ulubelen và cộng sự đã phân lập được hợp chất aesculetin (85) từ cây xà cừ (Khaya senegalensis) [6]
Năm 1996, Olmo và cộng sự đã phân lập được ba hợp chất limonoid mới được gọi tên là methyl-1α,6,8α,14β,30β-pentahydroxy-3-oxo-[3.3.110,2.11,4]-tricyclomeliac- 7-oate (79); metyl-1α,2β,3α,6,8α,14β-hexahydroxy-[4.2.1.110,30.11,4]- tricyclomeliac-7-oate (80) và metyl-1α-acetoxy-2β,3α,6,8α,14β-pentahydroxy- [4.2.1.110,30.11,4]-tricyclomeliac-7-oate (81); từ thân cây xà cừ (Khaya senegalensis) [7]
Năm 1998, Khalid và cộng sự đã phân lập được một limonoid mới là 2,6- dihydroxyfissinolide (40); từ vỏ cây Khaya senegalensis [8]
Năm 2000, Samir và cộng sự; đã phân lập được hợp chất khayalactol (15) từ vỏ thân cây Khaya senegalensis [9]
Vào năm 2001, Abdelgaleil và cộng sự đã chiết xuất ba limonoid chống côn trùng từ vỏ thân cây Khaya senegalensis: khayanolide A, B và C cùng bốn hợp chất vòng B, D-seco: seneganolide (11), methyl angolensate (12) và các dẫn xuất 6- hydroxy (10) và 6-acetoxy (4) của nó.
Năm 2001, Kayser và cộng sự đã phân lập được hai proanthocyanidin dimeric, catechin-(4a,6)-catechin (83) và catechin-(4a,8)-catechin (84), từ vỏ cây Khaya senegalensis [11]
Năm 2002, Nakatani và cộng sự đã phân lập được hai có tên khayanolide D (16) và E (17) và một limonoid glucoside có tên khayanoside (18) đã được phân lập làm thuốc chống côn trùng từ vỏ thân cây Khaya senegalensis của Ai Cập [12]
Năm 2004, El-Aswad và cộng sự đã phân lập được ba limonoid loại phragmalin, khayanolide A (13), khayanolide B (3) và 1‐O‐acetyl-khayanolide B (14) và một limonoid loại mexicanolide là khayalactol (15) từ vỏ thân cây Khaya senegalensis (Desr) A.Juss [13]
Năm 2007, Zhang và cộng sự đã phân lập được D-seco limonoid, được đặt tên là 1,3,7- trideacetylkhivorin (65) từ vỏ thân của cây gỗ gụ Châu Phi Khaya senegalensis (Meliaceae) [14]
Năm 2007, Zhang và cộng sự tách được các hợp chất deacetylkhayanolide E (88),
6 S-hydroxykhayalactone (89), grandifolide (90), 1-O-deacetylkhayanolide (91) từ chiết xuất methanol của vỏ thân cây Khaya senegalensis [15]
Năm 2009, Zhang và cộng sự đã phân lập được năm loại khayanolide là 1-O- acetylkhayanolide B (14), khayanolide B (3), khayanolide E (17), 1-O-7- deacetylkhayanolide E (26), 6- dehydroxylkhayanolide E (27) từ vỏ thân cây gỗ gụ Châu phi Khaya senegalensis [16]
Năm 2010, Yuan và cộng sự tách được bảy limonoid mới (1-7), được đặt tên là khayalenoid C-I (41-47), ba triterpenoid mới (8-10), được đặt tên là senegalenes A-
C (48-50) từ thân cây Khaya senegalensis [17]
Năm 2014, Kankia và cộng sự đã phân lập được ba triterpenoid mới của loại mexicanolide là 2- hydroxymexicanolide (38), 6-deoxydestigloylswietenine (39) và
2,6-dihydroxy-3-mexicanolide (76), từ chiết xuất ethanol của vỏ cây Khaya senegalensis [18]
Năm 2015, Li và cộng sự đã tách được sáu limonoid mới có vòng furan đã được sửa đổi, khaysenelide A–F (1-6) (59-64) từ vỏ thân của Khaya senegalensis [19] Năm 2020, Bu và cộng sự đã phân lập được một limonoid loại andirobin mới với vòng furan đã biến đổi, khaysenelide K (82) từ vỏ thân cây Khaya senegalensis [20] 1.2.2.2 Từ quả & hạt xà cừ:
Năm 1998, Govindachari và cộng sự tách được ba hợp chất mới là 2α- hydroxymexicanolide (23), 6-deoxydestigloylswietenine (24) và 2,3-dihydroxy-3- deoxymexicanolide (25) từ hạt của Khaya senegalensis bằng phương pháp HPLC [21] Năm 1999, Govindachari và cộng sự đã phân lập được mexicanolide (66), 3β- acetoxy-mexicanolide (67), 3β-hydroxymexicanolide (68), 2α,3β- dihydroxymexicanolide (69) bốn limonoid từ hạt Khaya senegalensis [22]
Năm 2000, Bickii và cộng sự tách được bảy limonoid, methylangolensate (12), 6- methylhydroxyangolensate (10), gedunin (70), 7-deacetylkhivorine (71), 1- deacetylkhivorine (72), swietenolide (73), 6-acetylswietenolide (74) và một flavonoid, catechin (75), từ vỏ và hạt của cây Khaya grandifoliola [23]
Năm 2004, Abdelgaleil và cộng sự đã phân lập được ba limonoid mexicanolide mới có chứa hệ thống diene lactone liên hợp hiếm có tên là seneganolide A (1), 2- hydroxyseneganolide A (7) và 2-acetoxyseneganolide A (8) Hai limonoid đã biết, 3- deacetyl-7-deacetoxy-7-oxokhivorin (9) và methyl 6- hydroxyangolensate (10) từ quả cây Khaya senegalensis [24]
Năm 2006, Michel và cộng sự đã phân lập được hợp chất 3,7-dideacetyl-6α- hydroxykhivorin (86), 6S,8α-dihydroxy-14,15-dihydrocarapin (87) từ hạt của Khaya senegalensis [25]
Năm 2016, Tian và cộng sự đã phân lập được 12 limonoid mới (khasenegasin O-Z) từ hạt của Khaya senegalensis Các limonoid này có ba loại khung sườn khác nhau, bao gồm 8 mexicanolide, 2 gedunin và 2 andirobin.
1.2.2.3 Từ lá & cành xà cừ:
Năm 1997, Olmo và cộng sự đã trích xuất được hai limonoid mới methyl-1α- axetoxy-3β,6,8α-trihydroxy-2α-methoxy-2β,14β-epoxy-tricyclomeliac-7-oate (19) và metyl-1α-acetoxy-6,8α,14β,30β-tetrahydroxy-3-oxo-tricyclomeliac-7-oate (20) Scopoletin (21), quercitrin (6) và rutin (22) từ lá của cây Khaya senegalensis [27] Năm 2012, Yuan và cộng sự đã phân lập được tám limonoid mới gọi tên khayseneganin A–H (1-8) (51-58) từ lá và cành của cây Khaya senegalensis [28] Năm 2012, Yuan và cộng sự đã phân lập được các hợp chất senegalension A-C (92-94) từ lá và cành của cây Khaya senegalensis [29]
Năm 2013, Yuan và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất mới là khayseneganin
I (77) và 2α,3α,16β-trihydroxy-20-acetoxy20(R)-pregnane (78) từ lá và cành cây
1.2.3 Các hợp chất được cô lập từ khaya senegalensis
R3 CH3OCH3 ;R 4 = CH3 OCH3 khasenegasin p (29) Rj = OH ;R 2 = p-OAc ;
R 3 - OH ;R 4 - H khascncgasin w (36) khasenegasin R (31) R[ = OH ;R2 = OAc ;R 3 = H khasenegasin s (32) Rj = OAc ;R2 = H ;R 3 = OH khasenegasin X (37) khasenegasin T (33) R[ =H ;R2 = H khasenegasin u (34) R| = OAc ;R 2 = H
11 khayseneganin A (51) khayalenoid G (45) R| = OAc ;R2 = H ;R3 = a-OH khayalenoid H (46) R| = OAc ;R2 = H;Rj= H khayalenoid I (47) Rt = H ;R2 = a-OAc ;R3 = H khayseneganin B (52) R = OH khayseneganin c (53) R = OAc khayscncganin D (54)
VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Cành cây xà cừ (Khaya senegalensis) được thu hái tại khoa Công nghệ Sinh học thuộc Cơ sở 3 tỉnh Bình Dương Mẫu được giám định tên khoa học là Khaya senegalensis (Desv.) A.Juss bởi TS Đặng Lệ Anh Tuấn (trường Đại học Khoa học
Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh)
Thực nghiệm được tiến hành trong khoảng thời gian từ tháng 04/2022 đến tháng 08/2022, tại Phòng thí nghiệm Sinh hóa, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
Các loại dung môi ethanol (Việt Nam), n-hexane (Việt Nam), ethyl acetat (Việt
Nam), methanol (Việt Nam), chloroform: Chemsol (Việt Nam)
Các hóa chất sử dụng trong chạy phổ DMSO, CDCl3 (Mesk)
Silicagel (Indian), silicagel 200-400 (Merck), bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck)
Thuốc thử Folin-ciocalteu (Merck), acid gallic, Na2CO3, quercetin, AlCl3, NaOH, NaNO2, DPPH•
Hóa chất sử dụng đạt độ tinh khiết phân tích
Cân phân tích điện tử (AA – 200), cân kĩ thuật (Sartorius TE 412) Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC
Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM
Máy đo quang phổ BioTeK
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp thu thập & xử lý mẫu
Cành xà cừ được thu thập tại khoa Công nghệ Sinh học thuộc Cơ sở 3 tỉnh Bình Dương Thu hái những cành dài có đường kính từ 1.5-3cm, không lấy những cành đã bị hư hại hoặc mục nát Mẫu được rửa sạch, phơi khô, xay mịn và ngâm với ethanol 96° ở nhiệt độ phòng
Kỹ thuật chiết ngâm (maceration) [4] , ngâm bột cây trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình phải có nắp đậy (tránh sử dụng bằng bình nhựa) Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến khi sấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên nhiệt độ phòng trong 1 đêm hoặc 1 ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây
2.2.3 Phương pháp điều chiết cao phân đoạn
Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân tách các hợp chất tự nhiên có độ phân cực khác nhau thành các phân đoạn cao chiết có độ phân cực tương ứng Đây là phương pháp thường quy nhất được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực cô lập hợp chất tự nhiên
2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp sử dụng thuốc thử Folin- ciocalteu được mô tả bởi Aiyegoro và Okoh [33]
Phương pháp này dựa trên phản ứng các hợp chất polyphenol trong dung dịch mẫu với thuốc thử Folin-Ciocalteu, tạo phức màu có cường độ tỷ lệ thuận với hàm lượng polyphenol Dựa vào cường độ màu đo được tại bước sóng 760 nm và đồ thị đường chuẩn của acid gallic, có thể xác định được hàm lượng polyphenol trong mẫu.
Hàm lượng polyphenol được tính theo công thức sau:
P: hàm lượng polyphenol tổng (mg acid gallic/g chiết xuất) a: giá trị x từ đường chuẩn với acid gallic (mg/ml)
V: thể tích dịch chiết (ml) m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid
Hàm lượng flavonoid được định lượng theo phương pháp Aluminium trichloride được mô tả bởi Chang và cộng sự (2002) [32]
Phương pháp này được thực hiện dựa vào đặc tính tạo phức màu của các flavonoid với kim loại Al 3+ thường được sử dụng để khảo sát vì nó là kim loại tạo phức màu mạnh và không độc hại Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với hàm lượng flavonoid Dựa vào cường độ màu đo ở bước sóng λ 425 nm và đồ thị đường chuẩn quercetin có thể xác định được hàm lượng flavonoid
Hàm lượng flavonoid được tính theo công thức sau:
F: hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g chiết xuất) b: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/ml)
V: thể tích dịch chiết (ml) m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)
2.2.6 Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH•
Năm 1922, Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH• (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH• là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH• có cực đại hấp thụ tại bước sóng 517 nm và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam Ngày nay DPPH• được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định
Các chất có khả năng kháng oxy hóa trung hòa gốc tự do DPPH bằng cách cho điện tử hydrogen, làm giảm khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng cực đại của DPPH và làm nhạt màu của dung dịch phản ứng.
DPPH• radicals sẽ phản ứng với các chất chống oxy hóa bằng cách nhận điện tử từ chúng, dẫn đến quá trình khử màu tím đặc trưng của DPPH• thành màu vàng nhạt Phản ứng trung hòa gốc DPPH• này đại diện cho hoạt động chống oxy hóa của các chất, phản ánh khả năng của chúng trong việc dập tắt các gốc tự do gây hại.
% Ức chế gốc tự do = OD C − OD m
ODc: độ hấp thụ quang học của chứng âm
ODm: độ hấp thụ quang học của mẫu thử
Khả năng kháng oxy hóa được đánh giá bằng giá trị IC50 Giá trị IC50 của mỗi mẫu được tính dựa trên phương pháp hồi quy từ đồ thị giữa % ức chế gốc tự do với nồng độ chất ức chế
2.2.7 Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.7.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254
Phát hiện chất trên sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc sử dụng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp từ từ đến khi hiện màu.
Hình 2 2 Cơ chế kháng oxy hóa
Sắc ký cột được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh), silica gel pha đảo, saphadex LH-20 để phân lập chất [4]
2.2.8 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
2.2.8.1 Phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử được đo trên máy Agilent 1260 LC ghép đầu dò khối phổ 6120B single quadrupole MSD của trường Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM Phổ khối lượng phân giải cao ghi trên máy MicroOTOF-Q mass spectrometer, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM
2.2.8.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Đại học Khoa học
2.2.9 Phương pháp phân tích thống kê
Các thí nghiệm được thử nghiệm định lượng hợp chất sinh học và kháng oxy hóa đều được thực hiện với ít nhất 3 lần lặp lại Số liệu phân tích được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và xử lý thống kê phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh sự khác biệt bằng kiểm định Duncan (ở mức ý nghĩa α
