KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY PHÈN ĐEN PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR. HỌ THẦU DẦU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA HÓA HỌC  KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HĨA HỌC Chun ngành: HÓA HỮU CƠ ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY PHÈN ĐEN PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) GVHD:Nguyễn Thị Ánh Tuyết SVTH :Liêu Diệp Hân Lớp :Hố 4C MSSV :K35 106 009 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 LỜI CẢM ƠN  Hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này: Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quí báu tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực khố luận Cám ơn dìu dắt em em chập chững bước vào làm đề tài tốt nghiệp động viên em lúc khó khăn Cơ ln gương để em phấn đấu noi theo trình học tập nghiên cứu sau Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Dương Thúc Huy cô Lê Thị Thu Hương, động viên, giúp đỡ cho em suốt thời gian thực khoá luận Em xin cảm ơn đến thầy mơn Hố, khoa Hố trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM giảng dạy truyền thụ kiến thức cho em suốt năm học trường Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ, chị hai, người ln bên cạnh khích lệ, ủng hộ vật chất lẫn tinh thần để n tâm hồn thành khố luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến cám bạn Hoá 4C, người bạn bên cạnh động viên, chia sẻ niềm vui, nỗi buồn cho nghị lực lúc khó khăn Xin chân thành cảm ơn! Tp.HCM, tháng 5, năm 2013 Liêu Diệp Hân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC KÝ TỰ DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [2] 1.1.1 Mô tả chung [2] .3 1.1.2 Vùng phân bố, thu hái [2] 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền [2,6] .4 1.2.2 Các nghiên cứu dược tính số lồi thuộc chi Phyllanthus .4 1.3.1 Phyllanthus acidus 1.3.2 Phyllanthus acuminatus 1.3.3 Phyllanthus amarus L 11 1.3.4 Phyllanthus discoides 12 1.3.5 Phyllanthus emblica L 13 1.3.6 Phyllanthus flexuosus 15 1.3.7 Phyllanthus fratermus 17 1.3.8 Phyllanthus myrtifolius 17 1.3.9 Phyllanthus niruroides 17 1.3.10 Phyllanthus niruri L 18 1.3.11 Phyllanthus oxyphyllus 19 1.3.12 Phyllanthus polyanthus 20 1.3.13 Phyllanthus sellowianus 21 1.3.14 Phyllanthus simplex 21 1.3.15 Phyllanthus tenellus 22 1.3.16 Phyllanthus urinaria 22 1.3.17 Phyllanthus watsonii 24 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 25 2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 26 2.1.1 Hoá chất 26 2.1.2 Thiết bị 26 2.1.3 Phương pháp tiến hành 26 2.2 NGUYÊN LIỆU 26 2.2.1 Thu hái nguyên liệu 26 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 27 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 27 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHER DẦU HOẢ 29 2.4.1 Sắc kí cột silica gel cao ether dầu hoả 29 2.4.2 Sắc kí cột silica gel phân đoạn ED2 bảng 29 2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 30 2.5.1 Sắc kí cột silica gel cao ethyl acetate 30 2.5.2 Sắc kí cột silica gel phân đoạn EA2 bảng 31 2.5.3 Sắc kí cột silica gel phân đoạn EA22 bảng 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA HỢP CHẤT H4 36 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA HỢP CHẤT H2 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 4.1 KẾT LUẬN 44 4.2 ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1) 13 C-NMR DEPT Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) Distortionless Enhancement by Polarization Transfer COSY Correlation Spectroscopy HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence s Singlet Mũi đơn d Doublet Mũi đôi t Triplet Mũi ba dd Double of doublet Mũi đôi đôi M Multiplet Mũi đa δ Chemical shift Độ dịch chuyển hoá học J Coupling constant Hằng số ghép spin ppm Par per million Một phần triệu Rp-18 Reversed Phase-18 Pha đảo C-18 Rf Retention factor UV Ultra Violet Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết DANH MỤC CÁC KÝ TỰ ED Ether Petroleum EA Ethyl Acetate C Chloroform Me Methanol Ether dầu hoả SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng g Gam mg Miligam MHz Mega Hertz Hz Hertz DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Trái phèn đen Hình Thân, phèn đen Hình SKLM pha thường hợp chất H2 32 Hình SKLM pha đảo hợp chất H2 32 Hình Tương quan HMBC hợp chất H4 37 Hình Tương quan HMBC 6’-O-benzoyl arbutin 41 DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Danh mục sơ đồ Sơ đồ Qui trình điều chế cao ether dầu hoả ethyl acetate 28 Sơ đồ Sơ đồ cô lập hợp chất hữu H4 cao ether dầu hoả 33 Sơ đồ Sơ đồ cô lập hợp chất hữu H2 cao ethyl acetate 34 Danh mục bảng Bảng Sắc kí cột silica gel cao ether dầu hoả (52,00 g) 29 Bảng Sắc kí cột silica gel phân đoạn ED2 (0,60 g) bảng .30 Bảng Sắc kí cột silica gel cao ethyl acetate (118,00 g) 31 Bảng Sắc kí cột silica gel phân đoạn EA2 (7,90 g) bảng .31 Bảng Sắc kí cột silica gel phân đoạn EA22 (1,88 g) bảng 32 Bảng Số liệu phổ NMR H4 .38 Bảng Số liệu phổ NMR H2 .42 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất H4 Phụ lục 1a Phổ 1H-NMR hợp chất H4 Phụ lục 1b Phổ 1H-NMR hợp chất H4 Phụ lục 2a Phổ 13C-NMR hợp chất H4 Phụ lục 2b Phổ 13C-NMR hợp chất H4 Phụ lục Phổ DEPT hợp chất H4 Phụ lục Phổ HSQC hợp chất H4 Phụ lục 4a Phổ HSQC hợp chất H4 Phụ lục 4b Phổ HSQC hợp chất H4 Phụ lục 5a Phổ HMBC hợp chất H4 Phụ lục 5b Phổ HMBC hợp chất H4 Phụ lục 6a Phổ COSY hợp chất H4 Phụ lục 6b Phổ COSY hợp chất H4 Phụ lục 7a Phổ 1H-NMR hợp chất H2 Phụ lục 7b Phổ 1H-NMR hợp chất H2 Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất H2 Phụ lục Phổ DEPT hợp chất H2 Phụ lục 10 Phổ COSY hợp chất H2 Phụ lục 11 Phổ HSQC hợp chất H2 Phụ lục 12 Phổ HMBC hợp chất H2 Phụ lục 12a Phổ HMBC hợp chất H2 Phụ lục 12b Phổ HMBC hợp chất H2 LỜI MỞ ĐẦU  Nước ta nằm vùng nhiệt đới, gió mùa – với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên hệ thực vật đa dạng phong phú Chính đa dạng phong phú mà ngành hóa học hợp chất thiên nhiên phát triển mạnh mẽ, góp phần lớn vào phát triển y học, chăm sóc sức khỏe cho người dân Từ xa xưa, người sử dụng nhiều loại cỏ hợp chất trích ly từ cỏ để làm thuốc chữa bệnh Với ưu điểm chứa nhiều loại biệt dược q khơng gây tác dụng phụ, dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ngày phát triển Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) nguồn dược lược quí, thuộc chi Phyllanthus 20 loại cỏ có khả chữa trị viêm gan dùng y học cổ truyền Việt Nam nhiều nước giới [4] Các phận sử dụng làm thuốc: rễ Phèn đen dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận trẻ em cam tích Lá thường dùng để chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết đòn ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt dùng làm thuốc chữa rắn cắn Vỏ thân dùng chữa lên đậu có mủ tiểu tiện khó khăn Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng dân gian lồi thuộc chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học, nên chọn Phyllanthus reticulatus Poir để nghiên cứu thành phần hoá học Cây Phyllanthus reticulatus Poir nghiên cứu sơ thành phần hóa học nên chúng tơi định tiếp tục nghiên cứu theo hướng khảo sát thành phần hóa học CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [2] Tên thông thường: Phèn đen Tên gọi khác: Nỗ, Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, Diệp hạ châu mạng Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir Hình Trái phèn đen Hình Thân, phèn đen 1.1.1 Mô tả chung [2] Phèn đen bụi mọc tự nhiên bờ bụi, ven đường, ven rừng, cao 2-4 m, cành gầy mảnh đen nhạt, họp từ đến cành đốt dài 10-20 cm Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn, hay tù hai đầu, phiến mỏng, dài 1,5-3 cm, rộng 6-12 mm, mặt có màu sẫm mặt dưới, kèm hình tam giác hẹp Cụm hoa hình chùm, mọc nách lá, riêng lẻ hay xếp 2-3 Quả hình cầu, chín màu đen, dài mm, rộng mm Hạt hình cạnh, màu nâu, có đốm nhỏ Cây hoa kết từ tháng 8-10 hàng năm 1.1.2 Vùng phân bố, thu hái [2] Phèn đen lồi nhiệt đới nên có phân bố rộng, vùng Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Tây Nam Phi Ở nước ta, Phèn đen mọc thành bụi tự nhiên, tìm dễ dàng bờ bụi, ven đường, ven rừng 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Các lồi thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) sử dụng rộng rãi y học dân tộc nhiều nước chữa bệnh thận, tiểu đường, viêm gan B,…[8] Trong đó, lồi dùng làm thuốc nhiều Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus reticulatus Poir Phyllanthus amarus Schum et Thonn [5] 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền [2,6] Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng làm se, giảm đau, sát khuẩn, giải độc Chủ trị làm thuốc cầm máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cầu thận, chữa lỵ, tiêu chảy Trong rễ phèn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, tả Lá Phèn đen có tác dụng nhiệt giải độc, sát trùng, lợi tiểu… Chữa kiết lỵ: dùng rễ Phèn đen, dây mơ lông, cỏ seo gà, cỏ tranh nhau, vị 20 g, gừng lát g - sắc uống (Nam dược thần hiệu) Chữa bị đòn máu ứ nguy cấp: Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào vắt lấy nước uống (Bách gia trân tàng), dùng 40 g sắc chế thêm chén rượu uống Chữa nhọt độc phát: Phèn đen Bèo ván giã nát đắp (Bách gia trân tàng) Chữa nhiệt tả lỵ: Phèn đen cành lá, đậu đen sao, thứ 40 g, đổ bát nước sắc lấy bát, chia uống làm lần (Hoạt nhân tốt yếu Hồng Đơn Hịa) Chữa đại tiện máu: Phèn đen cành lá, thái nhỏ bát, sắc đặc uống (Bách gia trân tàng) Chữa chảy máu nướu răng: Phèn đen phối hợp với Long não Xuyên tiêu phơi khô, chế thành viên ngậm Trị rắn cắn: Phèn đen tươi nhai nát nuốt lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn 1.2.2 Các nghiên cứu dược tính số lồi thuộc chi Phyllanthus Ở Quảng Tây Trung Quốc, Phyllanthus reticulatus Poir (Euphorbiaceae) loại thuốc sử dụng để chống viêm khớp điều trị bệnh thấp khớp [43] Năm 1997, E Omulokoki cộng [14] sử dụng dịch chiết từ loài Phyllanthus reticulatus Poir để khảo sát khả chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum nồng độ thử nghiệm cho kết IC 50 < 10µg/ml Năm 2010, số báo cáo chứng minh chất chiết xuất Phyllanthus reticulatus Poir (Euphorbiaceae) có tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn, gây độc tế bào bảo vệ gan [27] • Dược tính số khác chi: Năm 1961, Phịng Đơng Y - Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh chó đẻ cưa (Phyllanthus urinaria L.) cho thấy kết tác dụng kháng sinh sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Salmonella typhi (0,9 cm), Shigella flexneri(1,1cm), Shigella sonnei(0 cm), Shigella shigae (1cm), Bacillus subtilis (0,4 cm), Escherichia coli (0 cm) [7] Năm 1988, Blunberg cộng [1] nghiên cứu tác dụng hai lồi chó đẻ cưa, Phyllanthus amarus Phyllanthus niruri bệnh nhân viêm gan siêu vi B Kết cho thấy có 22/37 bệnh nhân âm tính sau 30 ngày điều trị hai lồi chó đẻ cưa Các tác giả cịn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men pelymerase DNA virus viêm gan siêu vi B Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh cộng [3] công bố kết nghiên cứu lâm sàng bệnh nhân viêm gan mãn tính Chế phẩm LIV/94 sản xuất từ loại thảo dược: chó đẻ cưa (Phyllanthus urinaria L.), chua ngút (Embelia ribes Burn) cỏ nhọ nồi (Ecliptaprostrata L.) dùng để điều trị cho bệnh nhân viêm gan mãn tính năm (2001-2002) Kết nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng làm giảm HBsAg bệnh nhân Bên cạnh đó, năm 2007 nhà khoa học Ấn độ khảo sát khả chống oxi hóa từ dịch chiết methanol loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus Kết cho thấy dịch chiết thể tính kháng oxi hóa [23] 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC Chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có 700 loài gồm từ thân thảo đến bụi hay gỗ nhỏ Ở Việt Nam có 44 loài, loài đáng ý nhiều Phyllanthus urinaria L (cây Chó đẻ cưa), Phyllanthus reticulatus Poir (cây Phèn đen) Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đắng) Thành phần hoá học chi phong phú đa dạng [10] Năm 1976, Wai-Haan Hui cộng [45] cô lập 21-α-hydroxyfriedel4(23)-en-3-one (1), β-sitosterol (2), friedelin-1β,22β-diol (3) glochidonol (4) nghiên cứu loài Phyllanthus reticulatus Poir H3C CH3 CH3 OH CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH3 O CH3 H HO β-Sitosterol(2) 21-α-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (1) H3C CH3 CH3 H2C H OH H H H H H CH3 CH2 OH CH3 H3C CH3 OH CH3 CH3 CH3 H O H H CH3 CH3 O CH3 CH3 H3C H CH3 Glochidonol (4) Friedelin-1β,22β-diol (3) CH3 Năm 1981, Joshi cộng [19], cô lập hợp chất phân cực friedelin (5), betulin (6) β-stitosterol (2) từ rễ thân Phyllanthus reticulatus Poir H3C CH3 CH3 H2C CH3 H CH3 H CH3 CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 HO O CH CH3 H3C CH3 Friedelin (5) Betulin (6) Năm 2009, Phan Văn Dân [7] khảo sát thành phần hoá học Phyllanthus reticulatus Poir Kết cho thấy Phyllanthus reticulatus Poir có chứa hợp chất β-sitosterol (2), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside (7), 2-acetamido-3phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (8) CH3 H3C H3C CH3 CH2OH HO H CH3 H H O CH3 H O HO OH β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside (7) O O HN HN CH3 O O 2-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (8) Năm 2012, J Xiong Ma cộng [21] phân lập hai arylnaphthalene lignan glycoside từ dịch chiết methanol Phyllanthus reticulatus Poir., reticulatusides A (9) reticulatusides B (10) Ngoài ra, tác giả đề cập tới diện syringaresinol (11) HOH2C O OH OH O CH2OH O OH O HO HO O O HO O HO OH HO OH O OH O H3CO H3CO O O H3CO O O O O O Reticulatusides A (9) Reticulatusides B (10) OCH3 OH O H H OCH3 H3CO O HO H3CO Syringaresinol (11) Do chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) nên chúng tơi trình bày thêm thành phần hố học số khác chi 1.3.1 Phyllanthus acidus Năm 1966, Sengupta cộng [36] tách hai pentacyclic triterpenoid, là: phyllanthol (12) olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) (13) CH3 CH3 H3C H3C H H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 HO HO CH3 CH3 H H3C CH3 β-Amyrin (13) Phyllanthol (12) 1.3.2 Phyllanthus acuminatus Năm 1984-1985, Pettit cộng [31,32] tách phyllanthostatin (14), phyllanthostatin (15), phyllanthostatin (16), phyllanthostatin (17) phyllanthostatin (18) O O CH3 CH3 O HO O HO OH OH O O CH3 OH O O CH3 O O CH3 O O O OH O O O CH3 O O CH3 CH2OH O O O O O O O O CH3 CH3 Phyllanthostatin (14) Phyllanthostatin (15) O OH HO CH3 CH3 O HO O O O OH CH3 O O CH3 O O CH3 O OH O O OH O O O CH3 O O CH3 O CH3 O O CH2OH O O OH O O CH3 O CH3 Phyllanthostatin (16) Phyllanthostatin (17) Năm 1990, Pettit cộng [30] cô lập phyllanthostatin (19) OH HO OH HO CH3 O O O OH O O CH3 O OH CH3 OH CH3 O O O O O O OH O O CH3 CH2OH O O O O O O O O CH3 CH3 Phyllanthostatin (18) Phyllanthostatin (19) 10 1.3.3 Phyllanthus amarus L Năm 1995, Yeap Foo [24] phân lập acid amariinic (20) Năm 1996, Peter J Houghton cộng [29] tách alkaloid isobubbialine (21) epibubbialine (22) với alkaloid biết phyllanthine (23), securinine (24) nor-securinine (25) Cấu trúc chúng xác định dựa vào liệu phổ UV, IR, MS NMR Năm 2005 2007, Herbert Kolodziej Farah Naaz [15,17] cô lập acid shikimic (26), epigallocatechin gallate (27) Năm 2008, Thales R.Cipriani cộng [42] phân lập acid thiobarbituric (28) acid ascorbic (29) OH HO HO OH OH HO O OH O O O OH O O O OH O CH3 O O O HO HO O O O OH OH Acid amariinic (20) O O O O O H O H H H3CO HO N N N OH Isobubbialine (21) H Epibubbialine (22) 11 Phyllanthine (23) ... chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học, nên chúng tơi chọn Phyllanthus reticulatus Poir để nghiên cứu thành phần hoá học Cây Phyllanthus reticulatus Poir nghiên cứu sơ thành phần hóa học. .. khảo sát thành phần hóa học CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [2] Tên thông thường: Phèn đen Tên gọi khác: Nỗ, Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, Diệp hạ châu mạng Thuộc họ Thầu. .. THẢO LUẬN 35 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA HỢP CHẤT H4 36 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA HỢP CHẤT H2 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 4.1 KẾT LUẬN