KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY PHÈN PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR. HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE). KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA TRẦN THỊ KIM LIÊN KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY PHÈN PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Ánh Tuyết Thành phố Hồ Chí Minh 2013 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực phịng hóa hữu cơ, thuộc khoa Hóa, trường đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, người ln hết lịng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt khóa luận Cơ khơng truyền đạt cho em tri thức khoa học, kinh nghiệm nghiên cứu quý báu, mà lòng nghiên cứu khoa học giúp cho em có hành trang cần thiết bước đường nghiên cứu học tập Em xin cảm ơn q thầy mơn hóa, khoa hóa – đại học sư phạm tp.HCM, thầy hết lịng hướng dẫn, giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu suốt thời gian em học trường Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn phịng thí nghiệm hóa hữu trường đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh đại học Khoa Học Tự Nhiên tận tình truyền đạt kinh nghiệm quý báu, quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, anh chị, người bên khích lệ, ủng hộ mặt vật chất tinh thần để n tâm hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến đến tất bạn bè tôi, bên giúp đỡ động viên tơi hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn gửi lời chúc tốt đẹp đến tất người! MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [6] 1.1.1 Mô tả chung [6] 1.1.2 Vùng phân bố, thu hái [6] 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền [4,6] 1.2.2 Các nghiên cứu dược tính số lồi thuộc chi Phyllanthus 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 1.3.1 Phyllanthus acidus 1.3.2 Phyllanthus acuminatus 1.3.3 Phyllanthus amarus L 11 1.3.4 Phyllanthus discoides 12 1.3.5 Phyllanthus emblica L 13 1.3.6 Phyllanthus flexuosus 15 1.3.7 Phyllanthus fratermus 16 1.3.8 Phyllanthus myrtifolius 17 1.3.9 Phyllanthus niruroides 18 1.3.10 Phyllanthus niruri L 18 1.3.11 Phyllanthus oxyphyllus 20 1.3.12 Phyllanthus polyanthus 20 1.3.13 Phyllanthus sellowianus 21 1.3.14 Phyllanthus simplex 21 1.3.15 Phyllanthus tenellus 21 1.3.16 Phyllanthus urinaria 22 1.3.17 Phyllanthus watsonii 24 CHƯƠNG 26 THỰC NGHIỆM 26 2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 27 2.1.1 Hoá chất 27 2.1.2 Thiết bị 27 2.1.3 Phương pháp tiến hành 27 2.2 NGUYÊN LIỆU 28 2.2.1 Thu hái nguyên liệu 28 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 28 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 28 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR 30 2.4.1 Sắc kí cột silica gel cao ether dầu hoả 30 2.4.2 Cô lập hợp chất hữu cao ethyl acetate 32 CHƯƠNG 35 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất S3 36 3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất L1 39 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 4.1 KẾT LUẬN 44 4.2 ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1) 13 C-NMR DEPT Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance carbon (13) Distortionless Enhancement by Polarization Transfer COSY HSQC HMBC Correlation Spectroscopy Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua Correlation liên kết Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết S Singlet Mũi đơn D Doublet Mũi đôi T Triplet Mũi ba Dd Double of doublet Mũi đôi đôi M Multiplet Mũi đa δ Chemical shift Độ dịch chuyển hoá học J Coupling constant Hằng số ghép spin Ppm Par per million Một phần triệu Rp-18 Reversed Phase-18 Pha đảo C-18 SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Sắc ký cột silica gel cao ether dầu hỏa 30 Bảng Sắc ký cột silica gel phân đoạn EA3 bảng 31 Bảng Sắc kí cột silica gel cao ethyl acetate 32 Bảng 4.Sắc ký cột silica gel phân đoạn EA2 bảng 32 Bảng Sắc ký cột silica gel phân đoạn EA23 bảng 33 Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất S3 38 Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất L1 42 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Qui trình điều chế cao ether dầu hoả (ED) ethyl acetate (EA) 29 Sơ đồ Sơ đồ cô lập hợp chất hữu S3 cao ether dầu hỏa 31 Sơ đồ Sơ đồ cô lập hợp chất hữu L1 cao ethyl acetate 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trái phèn đen Hình Thân, phèn đen Hình 3.Tương quan HMBC hợp chất L1 41 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất S3 Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất S3 Phụ lục Phổ 13C-NMR giản rộng hợp chất S3 Phụ lục Phổ DEPT-NMR hợp chất S3 Phụ lục 5.Phổ 1H-NMR hợp chất L1 Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất L1 Phụ lục Phổ HR-MS-ESI hợp chất L1 Phụ lục Phổ DEPT-NMR hợp chất L1 Phụ lục Phổ COSY hợp chất L1 Phụ lục 10 Phổ HSQC hợp chất L1 Phụ lục 11 Phổ HMBC hợp chất L1 LỜI MỞ ĐẦU Xu hướng giới nước ta quay sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên đóng góp thành tựu quý báo cho ngành hóa học ngành sinh học y dược học Sự kết hợp chứng khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học góp phần cố phát triển y học cổ truyền Từ lâu, Y học dân gian phát khoảng 20 loại cỏ có khả chữa trị viêm gan, đáng ý loài thuộc chi Phyllanthus (họThầu dầu, Euphorbiaceae) [2] Cây phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) thực vật thuộc chi Phyllanthus dùng Y học cổ truyền Việt Nam nhiều nước giới Các phận sử dụng làm thuốc: rễ phèn đen thường dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận… Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, phù thũng, ứ huyết đòn ngã, huyết nhiệt sinh đinh nhọt.Vỏ thân dùng để chữa lên đậu có mủ tiểu tiện khó khăn Chính lồi thuộc chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học Phyllanthus reticulatus Poir.chỉ nghiên cứu sơ thành phần hóa học nên định chọn Phyllanthus reticulatus Poir để khảo sát thành phần hóa học CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY PHÈN ĐEN [6] Tên thông thường: Phèn đen Tên gọi khác: Nỗ, Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, Diệp hạ châu mạng Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir Hình 1: Trái phèn đen Hình 2: Thân, phèn đen 1.1.1 Mô tả chung [6] Phèn đen bụi mọc tự nhiên bờ bụi, ven đường, ven rừng, cao 2-4m, cành gầy mảnh đen nhạt, họp từ đến cành đốt dài 10-20 cm Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn, hay tù hai đầu, phiến mỏng, dài 1,5 - 3cm, rộng - 12mm, mặt có màu sẫm mặt dưới, kèm hình tam giác hẹp Cụm hoa hình chùm, mọc nách lá, riêng lẻ hay xếp 2-3 Quả hình cầu, chín màu đen, dài mm, rộng 3mm Hạt hình cạnh, màu nâu, có đốm nhỏ Cây hoa kết từ tháng -10 hàng năm 1.1.2 Vùng phân bố, thu hái [6] Phèn đen lồi nhiệt đới nên có phân bố rộng, vùng Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Tây Nam Phi Ở nước ta, phèn đen mọc thành bụi tự nhiên, tìm dễ dàng bờ bụi, ven đường, ven rừng 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Các lồi thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) sử dụng rộng rãi y học dân tộc nhiều nước chữa bệnh thận, tiểu đường, viêm gan B,…[8] Trong đó, lồi dùng làm thuốc nhiều Phyllanthus urinaria L., Phyllanthus reticulatus Poir.VàPhyllanthus amarusSchum et Thonn [3] 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền [4,6] Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng làm se, giảm đau, sát khuẩn, giải độc Chủ trị làm thuốc cầm máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cầu thận, chữa lỵ, tiêu chảy Trong rễ phèn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, tả Lá phèn đen có tác dụng nhiệt giải độc, sát trùng, lợi tiểu… Chữa kiết lỵ: dùng rễ phèn đen, dây mơ lông, cỏ seo gà, cỏ tranh nhau, vị 20g, gừng lát 2g - sắc uống (Nam dược thần hiệu) Chữa bị đòn máu ứ nguy cấp: phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào vắt lấy nước uống (Bách gia trân tàng), dùng 40g sắc chế thêm chén rượu - uống Chữa nhọt độc phát: phèn đen bèo ván giã nát đắp (Bách gia trân tàng) Chữa nhiệt tả lỵ: phèn đen cành lá, đậu đen sao, thứ 40g, đổ bát nước sắc lấy bát, chia uống làm lần (Hoạt nhân tốt yếu Hồng Đơn Hịa) Chữa đại tiện máu: phèn đen cành lá, thái nhỏ bát, sắc đặc uống (Bách gia trân tàng) Chữa chảy máu nướu răng: phèn đen phối hợp với long não xuyên tiêu phơi khô, chế thành viên ngậm Trị rắn cắn: phèn đen tươi nhai nát nuốt lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn 1.2.2 Các nghiên cứu dược tính số loài thuộc chi Phyllanthus Ở Quảng Tây Trung Quốc, Phyllanthus reticulatus Poir.(Euphorbiaceae) loại thuốc sử dụng để chống viêm khớp điều trị bệnh thấp khớp [48] Năm 1997, E Omulokoki cộng [14] sử dụng dịch chiết từ loàiPhyllanthusreticulatusPoir.để khảo sát khả chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum nồng độ thử nghiệm cho kết IC 50 < 10µg/ml Năm 2010, số báo cáo chứng minh chất chiết xuất Phyllanthus reticulatus Poir.(Euphorbiaceae) có tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn độc tế bào bảo vệ gan [49] • Dược tính số khác chi: Năm 1961, Phịng Đơng Y - Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn chó đẻ cưa (Phyllanthus urinaria L.) cho thấy kết tác dụng kháng khuẩn sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Salmonella typhi (0,9 cm), Shigella flexneri(1,1cm), Shigella sonnei(0 cm), Shigella shigae (1cm), Bacillus subtilis (0,4 cm), Escherichia coli(0 cm) [1] Năm 1988, Blunberg cộng [5] nghiên cứu tác dụng hai lồi chó đẻ cưa, Phyllanthus amarus Phyllanthus niruri bệnh nhân viêm gan siêu vi B Kết cho thấy có 22/37 bệnh nhân âm tính sau 30 ngày điều trị hai lồi chó đẻ cưa Các tác giả cịn chứng minhcây Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men pelymerase DNA virus viêm gan siêu vi B Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh cộng [7] công bố kết nghiên cứu lâm sàng bệnh nhân viêm gan mãn tính Chế phẩm LIV/94 sản xuất từ loại thảo dược: chó đẻ cưa (Phyllanthus urinaria L.), chua ngút (Embelia ribes Burn) cỏ nhọ nồi (Ecliptaprostrata L.) dùng để điều trị cho bệnh nhân viêm gan mãn tính năm (2001-2002) Kết nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng làm giảm HBsAg bệnh nhân Bên cạnh đó, năm 2007các nhà khoa học Ấn độ khảo sát khả chống oxi hóa từ dịch chiết methanol lồiPhyllanthus là:Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus Kết cho thấy dịch chiết thể tính kháng oxi hóa [21] 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC ChiPhyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có 700 loài gồm từ thân thảo đến bụi hay gỗ nhỏ Ở Việt Nam có 44 loài, loài đáng ý nhiều Phyllanthus urinaria L (cây chó đẻ cưa), Phyllanthus reticulatus Poir (cây phèn đen) Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây diệp hạ châu đắng) Thành phần hoá học chi phong phú đa dạng [10] Năm 1976, Wai-Haan Hui cộng [40] cô lập 21-α-hydroxyfriedel4(23)-en-3-one (1), β-sitosterol (2), friedelin-1β,22β-diol(3) glochidonol (4) nghiên cứu loài Phyllanthus reticulatus Poir H3C CH3 CH3 OH CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH3 O CH3 H HO β-Sitosterol(2) 21-α-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (1) H3C CH3 CH3 H2C H CH3 OH OH H H H H H CH3 CH2 OH CH3 H3C CH3 CH3 H CH3 H H CH3 CH3 O O CH3 CH3 H3C H CH3 Glochidonol (4) Friedelin-1β,22β-diol (3) CH3 Năm 1981, Joshi cộng [47], cô lập hợp chất phân cực friedelin (5), betulin (6) β-stitosterol (2) từ rễ thân Phyllanthus reticulatus Poir H3C CH3 CH3 CH3 H2C H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH2OH CH3 O CH CH3 CH3 HO H3C Friedelin (5) CH3 Betulin (6) Năm 2009, Phan Văn Dân [1] khảo sát thành phần hoá học Phyllanthus reticulatus Poir Kết cho thấy Phyllanthus reticulatus Poir có chứa hợp chất β-sitosterol(2), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid(7), 2-acetamido-3phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate(8) CH3 H3C H3C CH3 CH2OH HO H CH3 H H O CH3 H O HO OH β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (7) O O HN HN CH3 O O 2-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (8) Năm 2012, J Xiong Ma cộng [50] phân lập hai arylnaphthalene lignan glycoside từ dịch chiết methanol Phyllanthus reticulatus Poir., reticulatusides A (9) reticulatusidesB(10) Ngồi ra, tác giả đề cập tới diện syringaresinol (11) HOH2C O OH OH O O CH2OH OH O HO HO O O HO O HO O OH HO OH O OH H3CO H3CO O O H3CO O O O O O Reticulatusides A (9) Reticulatusides B (10) OCH3 OH O H H OCH3 H3CO O HO H3CO Syringaresinol (11) Do chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) nên chúng tơi trình bày thêm thành phần hoá học số khác chi 1.3.1 Phyllanthus acidus Năm 1966, Sengupta cộng [32] tách hai pentacyclic triterpenoid, là: phyllanthol (12) olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) (13) CH3 CH3 H3C H3C H H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 HO HO CH3 CH3 H H3C CH3 β-Amyrin (13) Phyllanthol (12) 1.3.2 Phyllanthus acuminatus Năm 1984-1985, Pettit cộng [27,28] tách phyllanthostatin (14), phyllanthostatin (15), phyllanthostatin (16), phyllanthostatin (17) phyllanthostatin (18) O O CH3 CH3 O HO O HO OH O OH O CH3 OH O O CH3 O O CH3 O O O OH O O O O O CH3 CH2OH O O CH3 O O O O O O CH3 CH3 Phyllanthostatin 1(14) Phyllanthostatin 2(15) O OH HO CH3 CH3 O HO O O O OH CH3 O O CH3 O O CH3 O O CH3 O O CH3 O OH O O OH O O CH3 O O CH2OH O OH O O O CH3 O CH3 Phyllanthostatin (16) Phyllanthostatin (17) Năm 1990, Pettit cộng [26] cô lập phyllanthostatin (19) OH HO OH HO CH3 O O O OH O O CH3 OH O CH3 OH CH3 O O O O O O OH O O CH3 CH2OH O O O O O O O O CH3 CH3 Phyllanthostatin (18) Phyllanthostatin (19) 10 1.3.3 Phyllanthus amarus L Năm 1995, Yeap Foo [22] phân lập acid amariinic (20) Năm 1996, Peter J Houghton cộng [25] tách alkaloid isobubbialine (21) epibubbialine (22) với alkaloid biết phyllanthine (23), securinine (24) nor-securinine (25) Cấu trúc chúng xác định dựa vào liệu phổ UV, IR, MS NMR Năm 2005 2007, Herbert Kolodziej Farah Naaz [15,17] cô lập acid shikimic (26), epigallocatechin gallate (27) Năm 2008, Thales R.Cipriani cộng [38] phân lập acid thiobarbituric (28) acid ascorbic (29) OH HO HO OH OH HO O OH O O O O O OH O O H O H OH O CH3 O N O OH O HO HO O O O OH OH Acid amariinic (20) Isobubbialine (21) O O O O H H3CO HO N N H Epibubbialine (22) Phyllanthine (23) 11