Nguyễn Thị Lệ Thủy Sinh viên thực hiện: Phạm Anh Thư Lớp DH16YD01 Tên đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ CAO CHIẾT n-HEXANE CỦA LÁ VẸT TRỤ BRUGUIERA CYLINDRICA Ý kiến của giáo viên h
TỔNG QUAN
Mô tả tổng quan về chi Bruguiera
Chi Vẹt (Brugueira) thuộc họ Đước (Rhizophoraceae), theo Phạm Hoàng Hồ [3] tại Việt Nam gồm có 4 loài: Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica), Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza), Vẹt tách (Bruguiera parviflora), Vẹt đen (Bruguiera sexangul)
1.1.1 Cây Vẹt đen (Bruguiera sexangul) [4]
Cây cao khoảng 20m, vỏ cây có màu nâu nhạt đén xám Lá có hình elip hoặc thuôn dài, nhọn; phiến lá dài 8-16 cm, rộng 3-6 cm, phẳng; cuống lá dài 1.5-5 cm; lá kèm dài 3.5-4 cm, có màu xanh lá hoặc màu vàng-xanh Hoa đơn dộc, dài 3 cm từ phần gốc; đài hoa dài 10-12 mm, có màu vàng đến màu nâu gỉ Cánh hoa dài 1.5 cm, 2 thùy, có lông ở gốc và thường mọc theo mép Bao phấn dài 4-5 mm, không niêm mạc Trụ dưới lá mần dài 6-12 cm, rộng 1.5-2 cm, hơi có góc cạnh, thu hẹp ở hai đầu
Hình 1 1 Vẹt đen (Bruguiera sexangula)
1.1.2 Cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza) [4]
Cây cao khoảng 20 m, vỏ cây màu xám đến đen; nhiều rễ đầu gối Lá hình elip, nhọn; phiến lá dài 8-20 cm, rộng 3-9 cm; cuống lá dài 2-4 cm; lá kèm thường có màu đỏ Hoa đơn độc, dài 3.5 cm từ phần gốc, cuống nhỏ dài 1-2.5 cm, được thu lại, ít nhất một bên có màu đỏ Có khoảng 10-16 đài hoa, màu từ hồng nhạt đến đỏ tươi Cánh hoa dài 1.5 cm, 2 thùy, màu từ tráng chuyển sang vàng nâu; lề và đáy cánh hoa có lông tơ; có 2 đến
3 lồng mền kết thúc mỗi thùy 1 trong lõm gian thùy Bao phấn dài 4 mm, có chất nhầy Trụ dưới lá mần dài 10-25 cm, rộng 1.5 cm, thẳng, hơi có gân và trong ở đỉnh
Hình 1 2 Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
1.1.3 Cây Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica) [4]
Cây cao khoảng 20 m với rễ cây nhở ở gốc; rất nhiều rễ đầu gối; vỏ cây có màu xám
Lá có hình elip, nhọn, không có lông; phiến lá daì 5-17 cm, rộng 2.5-8 cm; cuống lá dài
1-4.5 cm; lá kèm dài 2.5-3.5 cm Cụm hoa có 3 hoa; cuống hoa dài 5 mm; cuống nhỏ dài
2 mm; hoa có màu kem đến xanh Cánh hoa dài 3-4 mm, có lông dọc theo mép cánh Bao phấn dài 0.5 mm, ngắn hơn sợi tơ, thon dần lên Quả dài 10-12 cm Trụ dưới lá mần dài 8-15 cm, rộng 5 mm, thường cong và không có gân
Hình 1 3 Vẹt trụ (Bruguiera cylindrical)
1.1.4 Cây Vẹt tách (Bruguiera parviflora) [4]
Cây cao khoảng 20 m; nhiều rễ đầu gối; vỏ cây nhăn, có màu xám Lá hình elip, nhọn; phiến lá dài 4-13 cm rộng 2.5-4 cm; cuống lá dài 1.5-2 cm; lá kèm dài 4.5 cm Cụm hoa có 3-10 hoa; cuống hoa dài 2 cm; cuống nhỏ dài 6-13 mm; hoa có màu vàng- xanh Có khoảng 8 đài hoa, dài 2 mm, đài cương lên bên trong quả Cánh hoa dài 1.5-2 mm, có lông ngoài gần đáy cánh hoa; thùy dài 0.5 mm; có 3 lông ở đầu mỗi thùy và 1 lông ở lõm gian thùy Bao phấn thuôn dài, riêng biệt ngắn hơn sợi tơ Qủa dài 1-2 cm
Trụ dưới lá mỏng, dài 7-20 cm, rộng 5 mm, không có gân Mùa lá rụng cũng là thời kỳ rụng quả Tuy nhiên, thành quả không rụng mà vẫn còn lưu lại như chiếc cổ áo trên cây con Các cánh quả hướng xuống dưới.
Hình 1 4 Vẹt tách (Bruguiera parviflora)
Các nghiên cứu thành phần hóa học trên chi Bruguiera
Có nhiều nghiên cứu hóa học về các bộ phần khác nhau (lá, thân, vỏ, trái, hoa, rễ và nhánh) của chi Bruguiera đã phân lập được các alkaloids, diterpenoids, triterpenoids, steroids, lignans, flavonoids, phenolics, sulphur…
1.2.1.1 Vỏ cây Vẹt đen (Bruguiera sexangula)
Năm 1969, Loder và cộng sự [5] đã cô lập được một alkaloid mới, đó là brugine (1) và các alkaloids được biết đến ở vùng nhiệt đới (2), tropine acetate (3), tropine benzoate
(4), tropine isobutyrate (5), tropine isovalerate (6), tropine n-butyrate (7) and tropine propionate (8) từ vỏ cây Vẹt đen (Bruguiera sexangula)
1.2.1.2 Thân cây Vẹt đen (Bruguiera sexangula)
Năm 2005, Shuyun Bao và cộng sự [6] đã cô lập và đặt tên cho một dithiobenzoquinone mới (-)-3,4-dihydro-3-hydroxy-7-methoxy-2H-1,5-benzodithiepine-6,9-dione (9); ba diterpenes mới, cụ thể là 17-hydroxy-16-oxobeyer-9(11)-ene-19-al (10), 16,17- dihydroxy-19-nor- ent -9(11)-kaurene-3-one (11), (16 R )-13,17-epoxy-16-hydroxy- ent - 9(11)-kaurene-19-al (12); sáu diterpenes đã được biết đến là 17-hydroxy-16- oxobeyerane-19-al (13), 16,17-dihydroxy- ent -9(11)-kaurene-19-al (14), methyl 16,17- dihydroxy- ent -9(11)-kaurene-19-oate (15), methyl (16 R )-13,17-epoxy-16-hydroxy- ent - 9(11)-kaurene-19-oate (16), ceriopsin F (17), ent -8(14)-pimarene-1β,15R,16-triol (18); hai cyclic disulfide là brugierol (19), isobrugierol (20); và 2,6-dimethoxy-1,4- benzoquinone (21) từ thân cây Vẹt đen (Bruguiera sexangula), được thu thập từ Haikou, đảo Haiman, Trung Quốc
Năm 2007, Shuyun Bao và cộng sự [7] cũng cô lập được bốn phenolic glycosides mới, được đặt tên là rhyncoside A–D (22–25) và hai dẫn xuất mới của lignan, được đặt tên là rhyncoside E—F (26-27) cùng với mười hai thành phần phenolic đã được biết dến bao gồm hai phenolic glycoside là 3,4,5-trimethoxyphenyl-β-D-glucopyranoside (28), 1-(α- L-rhamnopyranosyl-(1–6)-β-D-glucopyranosyloxy)-3,4,5-trimethoxybenzene (29); bốn flavonoids là tricin (30), rutin (31), nicotiflorin (32) và myricetin 3-O-rutinoside (33); và sáu lignans gồm lyoniside (34), (+)-lyoniresinol 3α-O-α-L-rhamnopyranoside (35), (+)- 5′-methoxyisolariciresinol 9′-β-D-xylopyranoside (36) và hedyotisols A–C (37–39) từ thân cây Vẹt đen (Bruguiera sexangula), được thu thập từ đường bờ biển gần Xiamen, Fujian province, Trung Quốc
Năm 2010, Liang Li và cộng sự [8] đã cô lập được triterpenoid mới thuộc khung lanostane, đặt tên là sexangulic acid (40) từ thân cây Vẹt đen (Bruguiera sexangula)
1.2.2.1 Từ rễ cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
Năm 1999, Chitti Subrahmanyam và cộng sự [9] đã cô lập được steviol (41) và năm diterpene là 13-hydroxy-16-ent-kaurene-19-al (42), 16-ent-kaurene-13,19-diol (43), isopimar-7-ene-15S,16-diol (44), methyl (16R)-13,17-epoxy-16-hydroxy-ent-9(11)- kaurene-19-oate (45) and ent-8(14)-pimarene-1β,15R,16-triol (46) từ rễ cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
1.2.2.2 Từ thân và lá cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
In 2004, Li Han et al isolated three ent-kaurane diterpenoids: 13,16α,17-trihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-oic acid (47), 16α,17-dihydroxy-ent-9(11)-kaurene 19-al (14), and 17-chloro-13,16β-dihydroxy-ent-kaurane-19-al (48), along with one ent-beyerane diterpenoid: (4R,5S,8R,9R,10S,13S)-ent-17-hydroxy-16-oxobeyerane-19-al (13) Additionally, nine known ent-kaurane diterpenoids were identified: methyl 16α,17-dihydroxy-ent-kaurane-19-oate (49), 16α,17-dihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-oic acid (50), methyl 16α,17-dihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-oate (15), 16α,17-dihydroxy-ent-kaurane-19-al (51), 16αH-17-hydroxy-ent-kaurane-19-oic acid (52), 16αH-17,19-ent-kauranediol (53), 13-hydroxy-16-ent-kaurene-19-al (42), 16-ent-kaurene-13,19-diol (43), and 16-ent-kaurene-19-ol (54) from the stem bark of Bruguiera gymnorrhiza.
Cũng trong năm này, Yan-Qiu Sun and Yue-Wei Guo [11] đã cô lập được một hợp chất mới đặt tên là gymnorrhizol (55) từ những phân thân cây bị bong ra và lá cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
Năm 2005, Li Han và cộng sự [12] đã cô lập được năm hợp chất aromatic, đặt tên là bruguierol A–C (56–58), 1-(3-hydroxyphenyl)hexane-2,5-diol (59) và 3-(3- hydroxybutyl)-1,1-dimethylisochroman-6,8-diol (60); ba pimaren diterpenoids tên là ent-8(14)-pimarene-15R,16-diol (61), ent-8(14)-pimarene-1a,15R,16-triol (62) và
(5R,9S,10R,13S,15S)-ent-8(14)-pimarene-1-oxo-15R,16-diol (63); tiếp đến là ba diterpenoids đã biết, đó là ent-8(14)-pimarene-1β,15R,16-triol (46), isopimar-7-ene-
15S,16-diol (44) và isopimar-7-ene-1β,15 S ,16-triol (64) từ thân cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza) sống trong rừng ngập mặn
In 2007, Li Han et al isolated two new compounds, brugunin A (65) and bruguierol D (66), as well as the known compound 2,3-dimethoxy-5-propylphenol (67) Subsequently, in 2008, Suisheng Shang and Shengjing Long isolated brugnanin (72), a neolignan dioate, from the stem of Bruguiera gymnorrhiza.
Năm 2009, Xiao-Ying Huang và cộng sự [15] đã cô lập được hai novel polydisulfides là trans-3,3′-dihydroxy-1,5,1′,5′-tetrathiacyclodecane (73), cis-3,3′-dihydroxy-1,5,1′,5′- tetrathiacyclodecane (74), tiếp đến là năm cyclic disulfides đã được biết đến, gymnorrhizol (55), neogymnorrhizol (75), bruguiesulfurol (71), brugierol (19) and isobrugierol (20) từ thân và lá cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
Năm 2011, You-Sheng Cai và cộng sự [16] đã cô lập được bảy hợp chất mới, đặt tên là palmarumycins BG1–BG7 (76–82) cũng như một dẫn xuất mới của preussomerin BG1 là preussomerin BG1 (83) từ các bộ phần trên không của cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
1.2.2.3 Từ hoa của cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
Năm 2006, Sudarat Homhual và cộng sự [17,18] đã cô lập được ba dammarane triterpenes, là bruguierins A–C (68–70); a new cyclic 4-hydroxydithiosulfonate, đặt tên là bruguiesulfurol (71) cũng như hai hợp chất đã biết là 4-hydroxydithiolane 1-oxide, brugierol (19) và isobrugierol (20) từ hoa của cây Vẹt dù (Bruguiera gymnorrhiza)
1.2.3.1 Từ quả Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica)
Năm 2004, Surat Laphookhieo và cộng sự [19] đã cô lập được sáu pentacyclic triterpenoid esters, đặt tên là 3α-(E)-feruloyltaraxerol (84), 3α-(Z)-feruloyltaraxerol (85), 3β-(E)-feruloyltaraxerol (86), 3β-(Z)-feruloyltaraxerol (87), 3α-(E)-coumaroyltaraxerol (88) and 3α-(Z)-coumaroyltaraxerol (89) together with two known compounds such as 3α-taraxerol (90) và 3β-taraxerol (91) từ quả cây Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica)
Năm 2005, Chatchanok Karalai và Surat Laphookhieo [20] đã cô lập được ba pentacyclic triterpenoid esters mới, đã đặt tên là 3α-(E)-coumaroyllupeol (92), 3α-(Z)- coumaroyllupeol (93) và 3α-(E)-caffeoyltaraxerol (94), cùng với sáu lupane-type triterpenoids đã biết bao gồm 3β-(E)-coumaroyllupeol (95), 3β-(Z)-coumaroyllupeol (96), 3β-(E)-caffeoyllupeol (97), 3β-lupeol (98), 3α- lupeol (99) và lupenone (100) từ quả Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica)
1.2.3.2 Từ rễ và lá Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica)
Năm 2007, từ rễ cây Vẹt trụ (Bruguiera cylindrical), Suchada Chantrapromma và cộng sự [21] đã cô lập được hợp chất ent-kaurane diterpene đó là 16-ent-kaurene-19-al
(101); Abdul Wahab Salae và cộng sự [22] cũng đã cô lập được một hợp chất diterpenoid, as 16-ent-kaurene-13,19-diol (43)
Năm 2018, Nithyamol và cộng sự [23] đã cô lập astaraxerol (90), 3β-(E)- coumaroyltaraxerol (102), 3β-(Z)-coumaroyltaraxerol (103), β-sitosterol (104) và eicosanol (105) từ lá Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica)
Năm 2005, Parinuch Chumkaew và cộng sự [24] đã cô lập được lupane caffeoyl ester, đó là 3β-(Z)-caffeoyllupeol (106), cùng lúc đó cũng cô lập được năm triterpenoids đã biết, lupeol caffeate (107), 3α-(Z)-coumaroyllupeol (93), dioslupecin A (96), lupeol (99) and lupenone (100) từ quả Vẹt tách (Bruguiera parviflora)
MỘT SỐ HỢP CHÁT ĐƯỢC CÔ LẬP TỪ CHI BRUGUIERA
Sulphur và các hợp chất khác
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Bruguiera
Theo dân gian, trái cây của Brugueira gymnorrhiza được sử dụng rộng rãi như một nguồn carbohydrate cho gạo cũng như các loại thuốc điều trị bệnh về mắt và mụn [25] Rễ và lá được sử dụng để điều trị bỏng Vỏ cây được sử dụng như một phương pháp để điều trị tiêu chảy cảu bệnh tiêu chảy và sốt rét [26]
Chi Bruguiera đặc trưng số lượng lớn sự hiện diện của các chất, nhiều trong số đó cho thấy hoạt tính sinh học mạnh Chúng bao gồm thuốc chống côn trùng [27] , chất kháng oxy hóa [28] , thuốc kháng nấm, gây độc tế bào, hoạt tính chống sốt rét và kháng khuẩn [25,29] Cho đến nay, hơn 200 chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học được phân lập từ rừng ngập mặn của các quần thể nhiệt đới và cận nhiệt đới và một số lượng lớn chúng thuộc về chi Bruguiera
Hoạt tính kháng ung thư
Cây Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica) thể hiện hoạt tính chống ung thư đáng chú ý Nghiên cứu đã phân lập được sáu hợp chất ester triterpenoid pentacyclic từ quả của cây, trong đó hai hợp chất, 3α-(Z)-feruloyltaraxerol (84), cho thấy hoạt tính gây độc tế bào yếu trên dòng tế bào ung thư NCI H77.
Bruguierin A (67), được phân lập từ hoa của cây Vẹt dù, hoạt tính ức chế luciferase do phorbol ester NFB (cú nhõn -B) gõy ra với giỏ trị IC50 là 1.4 àM và ức chế cú chọn lọc cyclooxygenase-2 (COX-2) với giỏ trj IC50 là 0.37 àM [17]
Sexangulic acid (40), được phân lập từ thân của cây Vẹt đen, cho thấy gây đọc tế bào trong ống nghiệm kháng lại tế bào ưng thư phổi A-459 ở người và các dòng tế bào ưng thư bạch cầu ở người với nồng độ 5 g/mL [8]
Các hợp chất ent-8(14)-pimarene-1-oxo-15R,16-diol (62) and isopimar-7-ene-
Hợp chất 15S,16-diol (44) chiết xuất từ cây Vẹt dù đã chứng minh hoạt tính kháng ung thư mạnh mẽ đối với tế bào L-929 (nguyên bào sợi chuột) và K562 (bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính ở người) với giá trị IC50 lần lượt là 9,8 và 7,0 μg/mL [12].
Hoạt tính kháng sốt rét
Ester lupane caffeoyl, 3β-(Z)-caffeoyllupeol (106), được phân lập từ trái của cây Vẹt tách cho thấy hoạt tính kháng sốt rét với giá trị EC50 là 8.6 g/mL [24]
Hoạt tính kháng đái tháo đường của enzyme PTP1B đóng vai trò quan trọng cả về mặt sinh lý và điều trị bệnh lý của tín hiệu thụ thể insulin và các nghiên cứu cho thấy thiếu PTP1B làm cho sự nhạy cảm với insulin tăng cường và kháng lại bệnh béo phì do chế độ ăn kiêng Do đó, PTP1B có thể là mục tiêu đầy hứa hẹn trong việc điều trị bệnh tiểu đường loại II và béo phì Các hợp chất gymnorrhizol (54) và bruguiesulfurol (70) từ cây Vẹt dù cho thấy hoạt tính kháng lại PTP1B đầy hứa hẹn với giá trị IC50 lần lượt là 14.9 và 17.5 àM [15]
Dựa trên xét nghiệm kháng khuẩn trong ống nghiệm, cao chiết methanol của cây Vẹt trụ đã thể hiện hoạt tính kìm khuẩn nhẹ Chiết xuất này đã kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Vibrio alcaligenes ở nồng độ 7 mM và Vibrio alginolyticus ở nồng độ 10 mM [30].
Chiết xuất từ lá Vẹt trụ đã được chứng minh có tác dụng hạ lipid, nhờ vào khả năng ức chế tổng hợp cholesterol ở gan Đồng thời, nó thúc đẩy bài tiết acid mật trong phân và kích thích hoạt động chuyển hóa cholesterol thành acytransferase trong huyết tương.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu và phương tiện nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh hóa, khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Địa chỉ: 68 Lê Thị Trung, Phú Lợi, Thủ Dầu Một, Bình Dương
Lá cây Vẹt trụ thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ thuộc huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh
Mẫu được định danh bởi TS Phạm Văn Ngọt, khoa Sinh trường Đại học Sư phạm TPHCM
Lá Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica) được hái là lá trưởng thành có màu xanh, lá dài khoảng 10-17 cm Sau khi thu hái về tiến hành loại bỏ những lá hư, làm sạch bằng nước,
Hình 2 1 lá Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica)
18 đem phơi khô Lá Vẹt trụ sau khi khô tiến hành xay nhuyễn thành bột để làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu
2.1.3 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500III (500 MHz cho 1 H-NMR và 125 MHz cho 13 C-NMR)
Dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol, acetic acid dùng trong sắc ký bản mỏng và sắc ký cột : Chemsol – Việt Nam
Dung môi DMSO và CDCl3 : Sigma – Aldrich
Silica gel dùng trong sắc ký cột : Merck
Phương pháp nghiên cứu
Từ cao chiết tổng ban đầu tiến hành phân bố lại trong các dung môi n-hexan, ethyl acetat và methanol Dùng sắc ký cột để chia cao n-hexan thành nhiều phân đoạn, từ các phân đoạn được đem đi phân lập chất tinh khiết Chất tinh khiết sẽ được phân lập dựa trên các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, HPLC điều chế kết hợp với sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu
Sắc ký cột (CC): được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240-43- merck) Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng sephadex LH-20 để phân lập chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa Học-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Quy trình điều chế cao và cô lập chất
2.3.1 Quy trình chiết cao từ lá cây Vẹt trụ
Lá cây Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica) trưởng thành được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ, sau đó loại bỏ những lá hư hỏng sâu bệnh, rửa sạch loại dất cát, phơi khô xay nhuyễn Bột lá cây Vẹt trụ (8 kg) được ngâm dầm trong 24 giờ với dung môi ethanol theo tỉ lệ 1:12 g/ml tại nhiệt độ phòng Chiết 15 lần thu dịch chiết ethanol đem cô quay trong điều kiện áp suất thấp thu được cao chiết ethanol (900 g) Cao chiết ethanol được chiết pha rắn với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là n-hexan, ethyl acetate và methanol Các dung dịch chiết được cô quay trong điều kiện áp suất thấp thu được cao phân đoạn n-hexan (100 g), ethyl acetate (300 g), methanol (380 g) Cao phân đoạn n-hexan được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm tiếp theo
2.3.2 Quy trình cô lập hợp chất tự nhiên từ cao chiết
3 Xay nhuyễn Bột nguyên liệu thô (8 kg)
2 Đuổi dung môi Cao ethanol (900 g)
1 Điều chế cao phân đoạn
Cao n-hexan (100 g) Cao Ethyl acetate (300 g) Cao Methanol (380 g)
Sắc ký cột Silica gel H:EA (98:2–0:100, v/v) EA:Me (90:10–0:100, v/v)
Sắc ký cột Silica gel H:EA (80:20–0:100, v/v) EA:Me (90:10–0:100, v/v) H:EA (90:10-0:100, v/v)
Sơ đồ 2 1 Quy trình cô lập và tinh sạch hợp chất từ cao chiết n-hexan của lá Vẹt trụ
Từ cao n-hexan bằng phương pháp sắc kí cột silicagel (cột 120*6 cm) qua các hệ dung môi H:EA (100:0-0:100, v/v) và Me thu được năm phân đoạn kí hiệu H1-H5
Từ phân đoạn H2 chạy sắc kí cột với hệ dung môi H:EA (90:10-0:100, v/v) thu được chất gần tinh sạch chạy thêm một lần sephadex LH-20 thu được hợp chất BC03
Từ phân đoạn H3 chạy sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi H:EA (80:20–0:100, v/v) EA:Me (90:10–0:100, v/v) thu được 6 phân đoạn kí hiệu là H31-H36 Phân đoạn H31 chạy sắc kí cột với hệ H:EA (95:5-0:100, v/v) và cột sephadex thu được hợp chất BC01 Phân đoạn H34 chạy sắc kí cột với hệ H:EA (60:40-0:100, v/v) và cột sephadex LH-20 thu được hợp chất BC02
Phân đoạn H33 chạy sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi H:EA (80:22–0:100, v/v) thu được 6 phân đoạn kí hiệu là H33.1-H33.5 Từ phân đoạn H33.1 chạy sắc kí cột với hệ H:EA (90:10-0:100, v/v) và cột sephadex LH-20 thu được hợp chất BC04
Phân đoạn H33.2 chạy sắc kí cột với hệ H:EA (80:20-0:100, v/v) và cột sephadex LH-
20 thu được hợp chất BC05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Biện luận cấu trúc hợp chất BC01
Hợp chất BC01 cô lập từ cao phân đoạn H31 thu được 7.5 mg, chất rắn vô định hình màu trắng, tan trong chloroform (Sơ đồ 2.1)
Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C–NMR (CDCl3) (Phụ lục 1.1, 1.2)
Thảo luận cấu trúc hóa học
Phổ 1 H–NMR cho thấy sự hiện diện của bảy tín hiệu proton methyl mũi đơn ở vùng từ trường cao tại δH 0.78 (3H, s, H-24), 0.78 (3H, s, H-28), 0.83 (3H, s, H-25), 0.94 (3H, s, H-27), 0.96 (3H, s, H-23), 1.03 (3H, s, H-26), 1.68 (3H, s, H-30) và cặp tín hiệu mũi đơn proton olefin ở δH 4.56 ppm (1H, s, H–29b) và 4.68 ppm (1H, s, H–29a) Đây là tín hiệu đặc trưng cho liên kết đôi ngoài vòng và cũng là đặc trưng của các hợp chất triterpenoid thuộc khung sườn lupane Phổ 1 H–NMR cũng cho thấy một tín hiệu proton hydroxy tại δH 3.18 ppm (1H, dd, H–3) và có giá trị J = 11.5 Hz nên hydroxy ở vị trí C-
Phổ 13 C-NMR của hợp chất BC01 cho thấy ba mươi tín hiệu carbon trong đó hai tín hiệu liên kết đôi ngoài vòng xuất hiện ở ở δC 109.5 ppm (C–29) và 151.1 ppm (C–20) khẳng định hợp chất BC01 là triterpenoid có khung sườn lupan Tín hiệu carbon ở δC
79.1 ppm là cũng giúp khẳng định có nhóm hydroxy gắn vào vị trí C-3 của khung sườn lupane
Qua các phân tích về dữ liệu phổ NMR của hợp chất BC01 cũng như so sánh tài liệu tham khảo [32] , cấu trúc hóa học của hợp chất BC01 được đề nghị là lupeol
Hình 3 1 Lupeol (BC01) Bảng 3 1 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất BC01 và lupeol
Bảng 3 2 Dữ liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất BC01và lupeol
Biện luận cấu trúc hợp chất BC04
Hợp chất BC04 cô lập từ phân đoạn H33.1 thu được 5.1 mg, chất dạng dầu không màu, tan trong chloroform
Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C–NMR (CDCl3) (Phụ lục 1.3, 1.4)
Thảo luận cấu trúc hóa học
Phổ 1 H–NMR của hợp chất BC04 tương tự như của hợp chất BC01 cũng có bảy tín hiệu proton methyl mũi đơn trong vùng từ trường cao tại δH 0,87 ppm – 1.68 ppm và còn
Phổ 1H–NMR của hợp chất BC04 cho thấy cặp tín hiệu proton olefin tại δH 4,58 ppm (H-29a) và 4,69 ppm (H-29b) đặc trưng cho hợp chất triterpenoid có khung sườn lupane Ngoài ra, các tín hiệu proton mũi đôi đôi ở δH 7,46 ppm (H-2', H-6') và 6,85 ppm (H-3', H-5') có giá trị J = 8,5 Hz, chỉ ra rằng chúng nằm ở vị trí ortho của nhau trên vòng benzen Các tín hiệu proton olefin mũi đôi, ghép trans tại δH 6,37 ppm (H-8') và 7,63 ppm (H-7') xác nhận sự hiện diện của nhóm coumaroyl.
C-7′ và C-8′ được khẳng định bởi hằng số ghép lớn (J 7′, 8′.5 Hz) [33] (J cis = 4-12 Hz) Thêm vào đó, tín hiệu proton mũi đơn bầu của methine bị oxy hóa được quan sát tại δH
4.74 ppm (1H, brs, H-3) cho thấy cấu hình α của nhóm chức coumaroyl
Phổ 13 C-NMR xuất hiện các tín hiệu carbon olefin tại δC 150.3 ppm (C-20), 110.0 ppm (C-29) đây là tín hiệu đặc trung của khung sườn lupan Khác với hợp chất BC01, phổ 13 C-NMR của hợp chất BC04 còn có sự hiện diện các tín hiệu carbon của vòng benzen từ δC 116.7 ppm đến 144.0 ppm và có thêm một tín hiệu carbon carboxyl δC 167.1 ppm (C-9′) tạo thành nhóm courmaroyl Thêm vào đó, tín hiệu carbon ở δC 78.4 ppm (C- 3) giúp khẳng định hợp chất BC04 là triterpenoid khung sườn lupan có nhóm chức coumaroyl gắn vào vị trí C-3
Dựa trên phân tích phổ NMR và đối chiếu với tài liệu tham khảo [20], cấu trúc hợp chất BC04 được xác định là 3α-(E)- coumaroyllupeol.
Hình 3 2 3α-(E)-coumaroyllupeol (BC04) Bảng 3 3 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất BC04 và 3α-(E)-coumaroyllupeol
Bảng 3 4 Dữ liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất BC04 và 3α-(E)-coumaroyllupeol
Biện luận cấu trúc hợp chất BC02
Hợp chất BC02 cô lập từ phân đoạn H34 thu được 8.2 mg, dạng bột trắng vô định hình, tan trong chloroform (Sơ đồ 2.1)
Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C–NMR (CDCl3) (Phụ lục 1.5, 1.6)
Thảo luận về cấu trúc hóa học
Tương tự với hợp chất BC01 và BC04, phổ 1 H–NMR của hợp chất BC02 cũng cho thấy có sự hiện diện của tám tín hiệu proton methyl mũi đơn ở vùng từ trường cao từ δH
0.60 ppm đến 1.17 ppm, tín hiệu proton olefin ở δH 5.62 ppm (1H, d, 6 Hz) và tín hiệu proton hydroxyl mũi đơn bầu tại δH 3.462 ppm (1H ,brs , H–3) là đặc trưng của các hợp chất triterpenoid Khác với hợp chất BC01, có tín hiệu proeton hydroxy ở vị trí H-3 có cấu hình β vì giá trị J = 11.5 Hz, thỉ ở hợp chất BC03 có một bộ ba có giá trị J thấp nên nhóm hydroxy ở vị trí H-3 còn cho thấy cấu hình α
Phổ 13 C-NMR của hợp chất BC02 cho thấy có ba mươi tín hiệu carbon, trong đó có hai tín hiệu carbon olefin tại δC 141.8 ppm (C-5) và 122.1 ppm (C-6) Từ những dữ liệu cho thấy đặc điểm của một triterpenoid có khung oleanane Tín hiệu carbon ở δC 76.5 ppm là do vị trí C–3 có nhóm hydroxy gắn vào khung sườn
Qua các phân tích về dữ liệu phổ NMR của hợp chất BC02 cũng như so sánh tài liệu tham khảo [34] , cấu trúc hóa học của hợp chất BC02 được đề nghị là glut-5-en-3ol
Hình 3 3 Glut-5-en-3ol (BC02) Bảng 3 5 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất BC02 và Glut-5-en-3ol
Bảng 3 6 Dữ liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất BC02 và Glut-5-en-3ol
BC02 Glut-5-en-3ol [34] BC02 Glut-5-en-3ol [34]
Biện luận cấu trúc hợp chất BC05
Hợp chất BC05 cô lập từ phân đoạn H33.1 thu được 5.8 mg, dạng tinh thể hình kim màu trắng, tan trong chloroform (Sơ đồ 2.1)
Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C–NMR (CDCl3) (Phụ lục 1.7, 1.8)
Thảo luận về cấu trúc hóa học
Phổ 1 H-NMR của hợp chất BC05 cũng tương tự hợp chất BC04 có sự hiện diện của tám tín hiệu proton methyl mũi đơn trong vùng từ trường cao từ δH 0,81 ppm đến 1.19
31 ppm và hai tín hiệu proton olefin tại δH 5.58 ppm (1H, d, J= 5.5 Hz, H-11) và 5.50 ppm (1H, d, J= 5.5 Hz, H-12) Đây là các tín hiệu đặc trung của các hợp chất triterpenoid có khung sườn oleanane Ngoài ra, còn có một tín hiệu proton mũi đôi đôi của hydroxyl tại δH 3.24 ppm (1H, dd, J= 12, 5 Hz, H-3) cho thấy hợp nhóm hydroxy ở vị trí C-3 có cấu hình β bởi có giá trị J= 12 Hz
Phổ 13 C-NMR của hợp chất BC05 cho thấy có ba mươi tín hiệu carbon, trong đó có một tín hiệu carbon tại δC 78.87 ppm giúp khẳng định có nhóm hydroxy ở vị trí C-3 Phổ còn xuất hiện bốn tín hiệu carbon ở δC 154.5 ppm (C-9), 115.9 ppm (C-11), 120.9 ppm (C-12), 147.3 ppm (C-13) giúp khẳng định hợp chất BC05 là một triterpenoid có khung sườn oleanane
Theo phân tích dữ liệu phổ NMR của hợp chất BC05, cấu trúc hóa học của hợp chất này được đề xuất là 3β-hydroxy-oleana-9(11),12-diene Đề xuất này dựa trên sự so sánh phổ NMR của hợp chất BC05 với dữ liệu tham khảo [35].
Hình 3 4 3β- hydroxy-oleana-9(11),12-diene (BC05)
Bảng 3 7 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất BC05 và 3β- hydroxy-oleana-9(11),12- diene
Bảng 3 8 Dữ liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất BC05 và 3β- hydroxy-oleana-9(11),12- diene
Biện luận cấu trúc hợp chất BC03
Hợp chất BC03 cô lập từ phân đoạn H2 thu được 10.2 mg, là chất rắn vô định hình có màu vàng, tan trong methanol (Sơ đồ 2.1)
Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C–NMR (DMSO) (Phụ lục 1.9, 1.10)
Thảo luận về cấu trúc hóa học
Phổ 1 H–NMR của BC03 chỉ ra rằng có một tín hiệu mũi đơn bị chẽ có hai proton tại vị trí δ H 6.19 ppm (1H, d, 2.0 Hz, H-6) và 6.50 ppm (1H, d, 2.0 Hz, H-8) cho thấy dạng khung sườn của 5,7–dihydroxy flavonoid của vòng A Các tín hiệu mũi đôi ghép cặp ortho xuất hiện tại vị trí δ H 7.55 ppm và 7.56 ppm (2H, d, 8.9 Hz, H–2′ và H–6′) Thêm vào đó, sự hiện diện của một proton mũi đơn tại δH 6.87 ppm của H–3 cho phép đề nghị
BC03 có dạng khung sườn flavone Hơn nữa, phổ 1 H–NMR ở BC03 cũng chỉ ra sự hiện diện của 1 nhóm hydroxyl kiềm nỗi tại δH 12.95 ppm (s, 5–OH) Hai tín hiệu proton vòng thơm đôi ghép cặp meta tại δH 6.19 ppm (d, 2.0 Hz, H-6), 6.50 ppm (d, 2.0 Hz, H-8), một tín hiệu proton vòng thơm nối đôi ghép cặp ortho tại δH 6.93 ppm (d, 1.0 Hz) và một tín hiệu proton vòng thơm nối đôi tại δH 7.56 ppm (d, 2.0 Hz) của lần lượt H–5′ và H–6′ Đây là các tín hiệu đặc trưng của flavonoid mang bốn nhóm thế tại 5, 7, 3′ và 4′ Ngoài ra, sự hiện diện của một tín hiệu proton mũi đơn tại δH 3.89 ppm cho thấy rằng có sự hiện diện của một nhóm methoxy ở vị trí 3′
Phổ 13 C–NMR BC03 cho thấy BC03 có 16 carbon, một tín hiệu carbon tại δc 56.0 ppm cho thấy sự hiện diện của một nhóm methoxy tại vị trí C–3′, một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị trí δC 181.7 ppm (C–4), 6 tín hiệu carbon tứ cấp thơm 100–167 ppm 6 tín hiệu carbon methine thơm tương ứng 95.0–129.0 ppm, hai tín hiệu tại δC 163.6 ppm và 103.1 ppm đặc trưng của C–2 và C–3 của khung flavone
Qua các phân tích về dữ liệu phổ NMR của hợp chất BC03 cũng như so sánh với tài liệu tham khảo [36] , cấu trúc hóa học của hợp chất BC03được đề nghị là Chrysoeriol
Hình 3 5 Chrysoeriol (BC03) Bảng 3 9 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất BC03 và Chrysoeriol
STT BC03 (DMSO-d 6 ) Chrysoeriol (DMSO-d 6 ) [36] δ H , J (Hz) δ C δ H , J (Hz) δ C
