khảo sát môi trường thích hợp tạo cây đơn bội kép từ bầu noãn cây bí đỏ cucurbita moschata duch doir

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn là hai phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc tạo cây đơn bội phục vụ cho mục đích lai tạo và nghiên cứu di truyền.. cây khi nuôi cấy bao phấn, h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ hồ chí MINH -^0^ -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -x0x -

'KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP TẠO CÂY ĐƠN BỘI KÉP TỪ BẦU NOÃN CÂY BÍ ĐỎ

CUCURBITA MOSCHATA (DUCH.) POIR.

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒ A XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

THÀ NH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

KHOA CÔ NG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁ C NHẬN

Tôi tên là: Thái Thị Thúy Kiều

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1753010106

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VÍÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Trần Đông Phương

Học viên thực hiện: Thái Thị Thuý Kiều Lớp: DH17SH02

Ngày sinh: 18-07-1999 Nơi sinh: Bình Định

Tên đề tài: KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP TẠO CÂY ĐƠN BỘI KÉP TỪ BẦUNOÃN CÂY BÍ ĐỎ CUCURBITA MOSCHATA (DUCH.) POIR.

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Thái Thị Thuý Kiềuđưực bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được học tập và rèn luyện tốt nhất

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Trần Đông Phương đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn các bạn thành viên trong phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào đã giúp đỡ, hỗ trợ cũng như chia sẻ những khó khăn trong công việc

Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình Cảm ơn những tình cảm, những quan tâm lo lắng và những lời động viên giúp con có thêm động lực và tự tin bước tiếp trên con đường học vấn và đường đời.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật cây Bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 4

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố (Cucurbitaceae) 4

1.1.2 Phân loại thực vật Bí đỏ 5

1.2 Một số đặc tính sinh học của cây Bí đỏ 6

1.2.1 Đặc tính thực vật học 6

1.2.2 Đặc tính sinh trưởng và phát triển 7

1.3 Cấu tạo của noãn 8

1.3.1 Noãn 8

1.3.2 Sự hình thành và cấu tạo của túi phôi 8

1.4 Cây đơn bội và đơn bội kép 9

1.4.1 Giới thiệu chung 9

1.4.2 Ứng dụng 10

1.4.3 Tạo cây đơn bội in vitro 10

1.4.4 Tạo cây đơn bội kép 12

1.5 Nuôi cấy noãn 12

1.5.1 Giới thiệu chung 12

1.5.2 Các nghiên cứu về nuôi cấy noãn 13

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy noãn 14

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 18

2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 18

2.1.5 Môi trường nuôi cấy 18

2.1.6 Hóa chất 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Quan sát hình thái giải phẫu 19

2.2.2 Khảo sát nồng độ TDZ ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 19

2.2.3 Khảo sát nồng độ AgNO3 ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 21

2.2.4 Khảo sát nồng độ TDZ kết hợp với AgNO3 10 mg/L ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 22

3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25

3.1 Quan sát hình thái giải phẫu 25

3.2 Khảo sát nồng độ TDZ ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 26

3.3 Khảo sát nồng độ AgNO3 ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 28

3.4 Khảo sát nồng độ TDZ kết hợp với AgNO3 10 mg/L ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 31

3.5 Tạo cây hoàn chỉnh từ phôi đã cảm ứng 35

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D ABA

2,4-dichlorophenoxyacetic acid Abscisic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát nồng độ TDZ ảnh hưởng đến sự

cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 20

Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát nồng độ AgNO3 ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir 22

Bảng 2.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát nồng độ TDZ kết hợp với AgNO3

10 mg/L ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.)

Poir ……… 23

Bảng 3.1 Số noãn cảm ứng và trạng thái noãn bí đỏ trên môi trường MS ½ có bổ sung

TDZ với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy 26

Bảng 3.2 Số noãn cảm ứng và trạng thái noãn bí đỏ trên môi trường MS ½ có bổ sung

AgNO3 với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy 29

Bảng 3.3 Số noãn cảm ứng và trạng thái noãn bí đỏ trên môi trường MS ½ có bổ sung

AgNO3 10 mg/L và TDZ với các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy………32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây bí đỏ 5

Hình 1.2 Quá trình hình thành của túi phôi 9

Hình 2.1 Sơ đồ nhuộm đỏ carmin, xanh iod 19

Hình 3.1 Bầu noãn bí đỏ 1 ngày trước khi nở 25

Hình 3.2 Hình thái giải phẫu noãn bí đỏ 1 ngày trước khi nở 25

Hình 3.3 Noãn bí đỏ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung TDZ với các nồng độ khác nhau 27

Hình 3.4 Noãn bí đỏ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung AgNO3 với các nồng độ khác nhau 30

Hình 3.5 Noãn bí đỏ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung AgNO3 10 mg/L và TDZ với các nồng độ khác nhau 33

Hình 3.6 Chồi bí đỏ sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS ½ thu nhận từ nghiệm thức tạo phôi……… 35

Hình 3.7 Chồi bí đỏ được nuôi cấy trên môi trường MS ½ bổ sung than hoạt tính 1 g/L ……….36

Hình 3.8 Cây bí đỏ có nguồn gốc từ nuôi cấy noãn sau 27 ngày đưa ra ngoài trồng 37

Để tạo được giống bí đỏ lai có năng suất cao, ổn định và thích nghi với các vùng sinh thái khác nhau thì bố mẹ phải là các dòng có khả năng thích nghi với những điều kiện bất lợi, khả năng chống bệnh và đặc biệt là ở dạng đồng hợp tử Tuy nhiên, việc tạo ra các dòng bố mẹ thuần chủng bằng phương pháp tự thụ phấn mất rất nhiều

thời gian từ 6 đến 8 thế hệ (Gémes-Juhász et al., 2002) Trong khi đó, sử dụng kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro có thể rút ngắn việc tạo dòng thuần chỉ còn 1 đến 2 thế hệ (Lê Huy Hàm và cs., 2005) Cây đơn bội đầu tiên được tạo ra nhờ kĩ thuật này từ cây cà độc dược lùn bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn (Blakelsee et al., 1992)

Nhiều nghiên cứu tạo cây đơn bội sau đó cũng đã được tiến hành như: lúa mạch (Kasa

and Kao, 1970), thuốc lá (Burk et al., 1979), hành (Bohanec and Jakse, 1999)

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn là hai phương pháp mang lại hiệu quả cao trong việc tạo cây đơn bội phục vụ cho mục đích lai tạo và nghiên cứu di truyền

Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành

cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và trong đó nuôi cấy kích thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) có khả năng tạo cây đơn bội nhanh hơn và thường được áp dụng cho những loài bất dục đực, loài có tỷ lệ cây tái sinh bị bạch tạng cao và các loài đơn

tính khác gốc (Thomas et al., 2000; Bhat and Murthy, 2007)

Trong họ bầu bí, cây đơn bội được tạo ra với nhiều biện pháp khác nhau như:

nuôi cấy noãn bí ngòi Cucurbita pepo L (Shalaby, 2007), cảm ứng hiệu quả sự hình thành cây con thông qua nuôi cấy noãn chưa thụ tinh với bí Cucurbita maxima Duch và Cucurbita moschata Duch (Zou et al., 2020), nghiên cứu tạo cây đơn bội và cây đơn bội kép ở cây dưa lưới để sử dụng trong việc kháng lại nhiều virus (Lotfi et al.,

2003), khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ, BA, IAA, NAA, 2,4-D đến noãn chưa thụ tinh nhằm tạo nên cây đơn bội kép ở cây dưa lưới (Koliet al., 2013) Nuôi cấy

noãn là phương pháp được xem là thành công nhất trong việc sản xuất cây đơn bội

trong nhiều loài (Hansen et al., 1995; Alan et al., 2003) nhưng lại bị kiểm soát bởi

nhiều yếu tố như lựa chọn kiểu gen, giai đoạn phát triển của noãn, tiền xử lý, thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng, sự biến đổi của phôi và điều

kiện chiếu sáng thực vật (Gemes - Juhasz et al., 2002; Shalaby 2007, Chen et al.,

2010)

Dựa trên những lợi ích của việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn và nhu cầu

sản xuất thực tế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát môi trường thích

hợp tạo cây đơn bội kép từ bầu noãn bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir ”

Nhằm tìm ra môi trường thích hợp để tạo cây đơn bội kép từ nuôi cấy noãn cây bí đỏ

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc, sự phân bố và phân loại thực vật cây Bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố (Cucurbitaceae)

Bí đỏ gồm 25 loài nhưng phát triển phổ biến nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới là các loài Cucurbita pepo L và Cucurbita moschata (Duch.) Poir., còn loài

Cucurbita maxima (Duch.) Poir thích hợp ở vùng ôn đới Theo nhiều báo cáo nghiên

cứu khoa học cho thấy, bí đỏ có nguồn gốc từ Trung Mỹ và Nam Mỹ Có nhiều nghiên

cứu khảo cổ chỉ ra rằng: loài Cucurbita pepo L phân bố rộng khắp ở các vùng Bắc Mexico và Tây Nam Hoa Kỳ từ 7000 năm trước Công nguyên, loài Cucurbita

moschata (Duch.) Poir đã xuất hiện ở Mexico và Peru từ ngàn năm nay, loài Cucurbita maxima (Duch.) Poir cũng được tìm thấy bởi các nhà khảo cổ ở Peru

khoảng 1200 năm trước Công nguyên (Marita et Trevor, 2002) Bí đỏ được thổ dân ở Bắc Mỹ thuần hóa trồng và sử dụng như một nguồn thức ăn chính Đến thế kỷ XVI, khi những người da trắng đến định cư và từ đó bí ngô được chuyển đến Châu Âu và dần trở thành phổ biến như ngày nay (Mattews and Endress, 2004) Một số tài liệu khác cho rằng bí đỏ cũng như các cây bầu bí khác có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới, vậy nên bí đỏ và cây họ bầu bí có khả năng phát triển rộng ở nước ta

1.1.2 Phân loại thực vật Bí đỏ

Bí đỏ thuộc vị trí phân loại sau:

Giới thực vật

Ngành: Ngọc lan Lớp: Ngọc lan Bộ: Bầu Bí Họ: Bầu Bí

Họ bầu bí có danh pháp khoa học là Cucurbitaceae Phần lớn các loài trong họ này đều là loại dây leo sống một năm hoặc sống dai, leo nhờ tua cuốn hoặc bò trên mặt đất Lá mọc cách có cuốn dài, phiến lá thường chia thùy chân vịt, không có lá kèm Thân, lá thường phủ lông cứng, màu trắng nhất là khi còn non, hoa có màu sắc sặc sỡ (Watson and Dallwitz, 1992) Họ bầu bí (Cucurbitaceae) gồm khoảng 120 chi và khoảng 1000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của 2 bán cầu Ở nước ta có trên 20 chi và gần 50 loài, phần lớn là những loài cây trồng có quả ăn được hoặc làm rau ăn (Hoàng Thị Sản, 2003)

Trong họ bầu bí (Cucurbitaceae) có nhiều loại dưa cho quả như: dưa hấu

(Citrullus lanatus (Thunb.) Mats Et Nakai), dưa gang (Cucumis melo L var

Hình 1.1 Cây bí đỏ

conomon Mak.), dưa leo (Cucumis sativus L.), dưa bở (Melo sinensis L.) Một số loài

cho quả hoặc cả lá làm rau ăn như: Bí đao (Benincasa hispida Cogn.), bí ngô (Cucurbita pepo L.), bầu (Lagenaria sireraria Standl.), mướp ta (Lufa cylindrica (L.) Roem.), mướp khía (Luffa acutangular Roxb.), mướp đắng (Momordica charantia L.), gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.), su su (Sechium edule (Jacq.) Sw.) Ngoài ra, trong họ còn nhiều loại cây mọc dại như: mỡ lợn (Hodgsonia

⮚ Thân

Thân leo hoặc bò có tua cuốn, thân dài từ 2 - 10 m Thân ngắn, tròn hay có gốc cạnh của thân tùy thuộc vào đặc điểm của giống Thân có khả năng ra rễ bất định ở đốt Tua cuốn phân nhánh mọc ở đốt thân Thân mọc chậm ở giai đoạn đầu khoảng 3 tuần sau khi gieo Bên trong thân rỗng và xốp, bên ngoài thân có nhiều lông tơ Các nhánh được sinh ra từ các đốt trên thân, các lóng trên thân phát triển rất nhanh (Trần Thị Ba, 2008)

⮚ Lá

Lá mầm to dạng hình trứng Trong điều kiện chăm sóc tốt, các lá mầm có thể kéo dài tuổi thọ đến hết thời gian sinh trưởng của cây Lá đơn, mọc cách, cuốn dài, phiến lá rộng, tròn hay góc cạnh, có xẻ thùy sâu hay cạn, màu xanh hay lốm đốm trắng Diện tích mặt lá lớn nên khả năng quang hợp mạnh Trên bề mặt lá có nhiều lông tơ bao phủ nên hạn chế khả năng thoát hơi nước (Trần Thị Ba, 2008)

⮚ Hoa

Hoa đơn tính cùng cây, to, cánh màu vàng, thụ phấn nhờ côn trùng Số lượng hoa đực nhiều hơn hoa cái từ 10 - 30 lần (Trần Thị Ba, 2008) Hoa nằm đơn độc ở nách lá Cánh hoa màu vàng đậm, có bầu noãn hạ, cuống hoa dài, phần lớn hoa nở vào buổi sáng Quả phát triển nhanh sau khi hoa cái nở Khi nở hoa hướng lên trên nhưng quả phát triển hướng xuống

⮚ Quả

Quả bí đỏ thuộc loại phì quả, có 3 tâm bì Hình dạng, kích thước, màu sắc quả thay đổi tùy theo giống Cuốn quả mềm hay cứng, tròn hay góc cạnh, đáy cuốn phình hay không phình, vỏ bí cứng hay mềm, trơn hay sần sùi, màu sắc vỏ thay đổi từ xanh đậm tới vàng, thịt quả dày hay mỏng, màu vàng đỏ đến vàng tươi, tất cả điều tùy theo mỗi giống mà có đặc điểm khác nhau Ruột quả chứa nhiều hạt nằm ở giữa (Watson and Dallwitz, 1992)

⮚ Hạt

Hạt bí đỏ được hình thành bên trong quả, do quá trình thụ phấn và thụ tinh của hoa đực và hoa cái Hạt bí đỏ có hình dạng dẹt, hơi dài, một đầu nhọn và một đầu tròn Kích thước hạt từ 5 -12 mm Trong một quả có thể chứa 500 - 600 hạt tùy giống và kích thước quả Hạt chứa nhiều chất béo nên rất dễ mất sức nảy mầm Một số loại bí trong hạt có chứa chất cucurbitacin là một hợp chất sinh học có tính chất gây độc cho tế bào và đang được nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chúng (Rosa, 2015)

1.2.2 Đặc tính sinh trưởng và phát triển

⮚ Thời kỳ nảy mầm

Là thời gian từ khi gieo hạt cho đến khi có hai lá mầm Nhiệt độ thích hợp cho hạt nảy mầm là 25 - 30 oC Bí đỏ có khả năng nảy mầm mạnh (Trần Thị Ba, 2008)

⮚ Thời kỳ cây con

Là thời kỳ khi cây được hai lá mầm đến khi cây xuất hiện 4 - 5 lá thật Thời kỳ này thân lá tăng trưởng chậm, lóng ngắn, lá nhỏ, chưa phân cành Rễ phát triển nhanh theo chiều sâu và chiều rộng, đặc biệt là rễ phụ phát triển mạnh Thời kỳ này cần vun gốc, bón thúc, tưới nước, để giữ ẩm cho cây sinh trưởng và kích thích ra rễ (Trần Thị Ba, 2008)

⮚ Thời kỳ tăng trưởng

Là thời kỳ khi cây được 4 - 5 lá đến khi ra hoa Ở thời kỳ này thân chuyển sang dạng bò, phát triển nhanh, tốc độ ra lá nhanh, kích thước lá lớn Hoa đực nhiều, hoa cái đầu tiên xuất hiện sau hoa đực Bộ rễ phát triển nhanh hơn thân lá nên rất dễ xảy ra hiện tượng lốp, khi đó cây mất cân đối, thân lá nhiều, hoa và quả ít (Trần Thị Ba, 2008)

⮚ Thời kỳ ra hoa, kết quả

Đây là tời kỳ ra hoa và đậu quả khá tập trung Thân, lá, rễ phát triển tối đa Thân dài hơn rễ và cho quả lứa đầu tiên Đây là thời kỳ mà cây yêu cầu nhiều nước và dưỡng chất Việc giữ độ ẩm và cung cấp đủ dinh dưỡng có vai trò quyết định đến năng suất (Trần Thị Ba, 2008)

⮚ Thời kỳ già cỗi

Sinh trưởng của lá, thân giảm mạnh, cây tàn Cây vẫn tiếp tục ra hoa, quả nhưng ít và bị dị dạng nhiều, chất lượng thấp Nếu được chăm sóc tốt sẽ kéo dài được tuổi thọ lá và quả và ít bị dị dạng hơn (Trần Thị Ba, 2008)

1.3 Cấu tạo của noãn

1.3.1 Noãn

Noãn là khối đa bào, hình trứng, hình cầu hoặc hình thận Mỗi noãn gồm 2 phần: cuống noãn là nơi đính noãn và giá noãn; thân noãn là một khối tế bào nhỏ gọi là phôi tâm, có lớp vỏ noãn bao ngoài (2 lớp vỏ) Vỏ noãn thường để hở một lỗ ở phía dưới gọi là lỗ noãn Chỗ thân noãn đính vào gọi là rốn Chỗ các lớp vỏ noãn gặp nhau và đính với tâm gọi là hợp điểm

Túi phôi nằm trong phôi tâm gồm 1 nhân lưỡng bội ở giữa, 1 noãn cầu đơn bội với 2 nhân trợ bào ở hai bên, nằm ở một cực, 2 nhân đối cực nằm ở cực đối diện (Trương Thị Đẹp, 2007)

1.3.2 Sự hình thành và cấu tạo của túi phôi

Tế bào mẹ nguyên bào tử phân chia giảm phân cho ra 4 tế bào đơn bội (đại bào tử), nhưng chỉ có 1 bào tử được duy trì và phát triển thành túi phôi bằng cách trải qua nhiều lần phân chia Lần phân chia đầu tạo ra 2 nhân con, chúng tách ra và đi về

2 cực của túi phôi, mỗi nhân con phân chia 2 lần nữa tạo thành 4 nhân Như vậy,

trong túi phôi có 8 nhân hợp thành 2 nhóm Về sau, tại mỗi cực có 1 nhân tách ra đi vào trung tâm túi phôi và kết hợp với nhau tạo thành nhân thứ cấp lưỡng bội (2n) Ở đầu phía gần lỗ noãn, tế bào nằm giữa là noãn cầu, 2 tế bào hai bên là 2 trợ bào có kích thức nhỏ hơn noãn cầu Ba nhân còn lại ở cực đối diện được gọi là các tế bào đối cực, có chức năng dinh dưỡng (Lê Thị

Trúc Linh và cs, 2018)

1.4 Cây đơn bội và đơn bội kép

1.4.1 Giới thiệu chung

Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau Phổ biến là nhị bội

(2n) và tứ bội (4n) Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều alen của một gen chi phối Nếu đó là những cá thể dị hợp tử (bất kể là nhị bội hay tứ bội) thì sự biểu hiện tính trạng của mỗi gen hoàn toàn phụ thuộc vào tính trạng trội hay lặn của chúng quyết định, điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc nghiên cứu di truyền Vì vậy, mức bội thể lí tưởng để có thể thực hiện các nghiên cứu di truyền là mức đơn bội (n) Thể đơn bội này có thể tác động hoặc tự nhân đôi để tạo

thành cây đơn bội kép hoàn toàn đồng hợp tử (Jain et al., 1996) Điều này giúp tăng

cường hiệu quả chọn lựa các tính trạng mong muốn

⮚ Đặc điểm cây đơn bội

Cây đơn bội thường có nhiều tính trạng tương tự cây lưỡng bội Tuy nhiên, từ kích thước tế bào đến các bộ phận đều nhỏ hơn cây lưỡng bội do số lượng gen và nhiễm sắc thể đều bị giảm đi.Cây đơn bội có sức sống yếu và có những nét đặc thù riêng vì các gen lặn ở trạng thái đơn bội đều được thể hiện ra kiểu hình Các cây đơn bội đều bị bất dục vì các giao tử không phân chia và mang nhiễm sắc thể là n Cây

Hình 1.2 Quá trình hình thành của túi phôi (Lê Thị Trúc Linh và cs, 2018)

đơn bội khi được lưỡng bội hóa sẽ tạo thành cây có kiểu gen đồng hợp tử ở tất cả các gen dẫn đến tình trạng thuần chủng Điều này mang lại ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn thời gian tạo dòng thuần góp phần hữu ích cho công tác nghiên cứu và chọn tạo giống Nếu tác động đột biến vào cây đơn bội sẽ phát hiện được ngay đột biến, sau đó nếu lưỡng bội hóa sẽ được dạng đồng hợp tử về gen đột biến và dễ dàng duy trì thông qua sinh sản hữu tính

⮚ Chọn lọc cây đơn bội

Có thể xác định cây đơn bội bằng cách: đếm trực tiếp số lượng nhiễm sắc thể, đo gián tiếp hàm lượng DNA của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước và khả năng tăng trưởng, phát triển (Phan Hữu Tôn, 2004)

1.4.2 Ứng dụng

Từ rất lâu, người ta cũng đã biết đến giá trị của cây đơn bội tuy nhiên tần suất xuất hiện của cây đơn bội trong tự nhiên là rất thấp do đó không đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Các tác giả cho rằng bình quân các nhà nghiên cứu sẽ tiết kiệm được khoảng 5 năm khi sử dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro vào việc tạo ra giống mới Việc đưa cây đơn bội vào chương trình tạo giống đã trở thành phổ biến trên thế giới (Đỗ Năng Vịnh, 2005)

Tạo cây đơn bội kép từ cây đơn bội là một bước tiến hữu ích cho ngành lai tạo và chọn giống Với kiểu gen hoàn toàn đồng hợp tử chúng ta có thể dễ dàng lựa chọn những kiểu gen mong muốn Lofti và cộng sự, năm 2003 đã sử dụng giống laiđược lai tạo từ nhiều giống có đặc tính kháng các bệnh khác nhau để làm vật liệu tạo

ra cây đơn bội và đơn bội kép phục vụ cho việc tạo ra giống dưa hấu Citrullus lanatus

Thunb có thể kháng một số loại virus Nghiên cứu về việc chọn lọc các cây dưa hấu

Citrullus lanatus Thunb mang gen kháng phấn trắng do nấm sphaerotheca fuliginea

gây ra ở mức độ đơn bội cũng đã được công bố (Kuzuya et al., 2003)

Ngoài các ứng dụng chuyển gen để tạo ra các giống mong muốn Cây đơn bội và đơn bội kép còn được sử dụng để lập bản đồ di truyền, nghiên cứu đột biến và nghiên cứu phân tử (Forster and Thomas, 2005)

1.4.3 Tạo cây đơn bội in vitro

Đối với công tác chọn lọc và lai tạo giống việc có được hai dòng bố mẹ thuần chủng là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, với phương pháp tự thụ phấn truyền thống

sẽ mất rất nhiều thời gian từ 6 đến 8 thế hệ (Gémes-Juhász et al., 2002) Trong khi đó nếu áp dụng các phương pháp tạo cây đơn bội in vitro sẽ rút ngắn thời gian tạo dòng thuần thậm chí chỉ còn 1 - 2 thế hệ (Lê Huy Hàm và cs., 2005)

Sự nuôi cấy hạt phấn non thành công vào khoảng năm 1965 đã dẫn tới sự hoàn chỉnh các phương pháp nuôi cấy để tạo các phôi và cây đơn bội (n) từ hạt phấn và các tế bào túi phôi Trong thực tế, người ta dùng bao phấn, hạt phấn hay bầu noãn để có cây tái sinh chứa thông tin di truyền của thể giao tử (Bùi Trang Việt, 2000) Hai phương pháp cơ bản được áp dụng phổ biến nhất là:

⮚ Nuôi cấy trực tiếp từ hạt phấn hay từ noãn chưa thụ tinh

Cấu trúc dạng phôi sẽ phát triển trực tiếp từ hạt phấn hoặc từ noãn chưa thụ tinh (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011)

⮚ Nuôi cấy gián tiếp thông qua mô sẹo

Cây hoàn chỉnh được phát triển từ khối mô sẹo (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011)

Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử hoặc đại

bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho việc nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng Cây đơn bội đầu tiên đã được tạo ra từ cây cà độc dược lùn bằng phương

pháp nuôi cấy bao phấn (Blakelsee et al., 1922) Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã

Hạt phấn hay Noãn chưa thụ tinh

Cây đơn bội Hạt phấn hay

noãn chưa thụ tinh

được tiến hành như: lúa mạch (Kasha và Kao, 1970), thuốc lá (Burk et al., 1979),

hành (Bohanec và Jakse, 1999)

1.4.4 Tạo cây đơn bội kép

Phương pháp làm tăng gấp đôi nhiễm sắc thể chủ yếu được sử dụng là xử lý bằng colchicine (Caglar and Abak, 1996; Nikolova and Niemirowicz, 1995; Yetisir and Sari, 2003) Số lượng cây đơn bội kép thu được cao nhất là trên 60 % khi ngâm các cây con trong dung dịch colchicine 0,5 % trong 4 giờ (Caglar and Abak, 1996)

Một phương pháp khác là tái sinh trực tiếp từ lá cây đơn bội (Niemirowicz et

al., 1995) Tuy nhiên kết quả thu được không hiệu quả bằng phương pháp xử lí bằng

colchicine Khi tiến hành tái sinh từ lá thứ nhất và lá thứ hai của cây đơn bội, kết quả thu được có sự khác biệt rõ rệt Tất cả cây tái sinh từ lá thứ nhất đều là đơn bội kép

nhưng khi từ lá thứ hai thì tỷ lệ đạt được là 70,5 %, lá tiếp theo là 28,2 % (Faris et

al., 2000) Điều này cho thấy độ tuổi phát triển của mô được tái tạo góp một phần

quan trọng trong việc làm tăng gấp đôi nhiễm sắc thể Dù bằng phương pháp nào thì việc tạo ra cây đơn bội kép vẫn là một bước tiến quan trọng góp phần tạo ra dòng đơn bội hoàn toàn đồng hợp tử giúp ích rất nhiều cho việc nghiên cứu và chọn tạo giống mới

1.5 Nuôi cấy noãn

Nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn được xem là hai phương pháp hiệu quả nhất để tạo ra cây đơn bội phục vụ cho nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống Tuy nhiên, với phương pháp nuôi cấy bao phấn sẽ rất khó khăn trong việc sàng lọc cây đơn bội do giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều, cây tái sinh dễ bị bạch tạng Trong khi đó, nuôi cấy noãn có thể khắc phục được những nhược điểm đó Quá trình sản xuất cây đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy noãn được mô tả tương tự như quá trình trinh sinh cái Đây là hình thức noãn không qua thụ tinh nhưng vẫn có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh Bầu noãn chứa noãn với túi phôi đã trưởng thành được cô lập và đặt trên môi trường nhân tạo thích hợp (Bùi Trang Việt, 2000) Sau một thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào từng loại cây, các phôi hay mô sẹo sẽ phát triển

ra từ túi phôi Tiếp tục chuyển các phôi cũng như mô sẹo vừa hình thành sang môi trường tái sinh để thu được cây đơn bội

Phương pháp nuôi cấy noãn đã được chứng minh là sự lựa chọn tốt nhất để sản xuất cây đơn bội ở thực vật, đặc biệt là đối với những loài có hạt phản loạn hay những cây có tỉ lệ cây tái sinh bị bạch tạng cao, những loài bị bất dục đực hay những

loài đơn tính khác gốc (Thomas et al., 2000; Bhat và Murthy, 2007) Tuy nhiên, nuôi

cấy noãn vẫn gặp phải những khó khăn nhất định do đó vẫn còn bị hạn chế trong việc nghiên cứu Dù khó khăn và phức tạp nhưng nuôi cấy noãn vẫn là phương pháp hàng đầu được các nhà nghiên cứu lựa chọn để sản xuất cây đơn bội.

1.5.2 Các nghiên cứu về nuôi cấy noãn

Nhiều nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy noãn trên các đối tượng khác nhau đã được công bố như: hoa hướng dương (Gelebart và San, 1987), tỏi tây (Schum

et al., 1993), đồng tiền (Tosca et al., 1995), bắp (Bordes et al., 1997), hành tây

của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, kiểu gen và thời gian nuôi cấy Môi trường

chứa BAP 4,0 mg/L + NAA 0,05 mg/L + TDZ 0,1 mg/L cho kết quả cảm ứng phôi tốt nhất Cây con đã ra rễ và mọc dài trên môi trường MS rắn có bổ sung axit indole-

là đơn bội, 46 cây lưỡng bội và những cây còn lại là thể hỗn hợp

Năm 2020, Zou và cộng sựnghiên cứu về việc cảm ứng sự hình thành cây con

thông qua noãn chưa thụ tinh bí Cucurbita maxima (Duch.) Poir và Cucurbita

moschata (Duch.) Poir Trong nghiên cứu này, Zou và cs đã thực hiện với 13 dòng Cucurbita (9 Cucurbita maxima, 3 Cucurbita moschata, và 1 bí lai giữa hai dòng)

Đầu tiên, đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen và môi trường cảm ứng đối với việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Kết quả cho thấy tỷ lệ cảm ứng của ELSs (embryo-like structures)và tỷ lệ cảm ứng cây con khác nhau ở các dòng trong cùng một điều kiện nuôi cấy và các dòng khác nhau có môi trường cảm ứng tối ưu khác nhau Tám trong

số 13 dòng Cucurbita đã sản xuất ELSs thành công ELS và tỷ lệ cảm ứng cây con

cao nhất tương ứng là 39,67 ELS và 10,18 cây con trên 100 mẫu và thu được trong môi trường I3 với 1,0 mg L-1 6-benzylaminopurine (6-BA) trong dòng L-13 Mức độ đơn bội của 59 cây tái sinh được xác định bằng phương pháp đo tế bào dòng, kết quả cho thấy 18,64 % là đơn bội, 3,40 % là tam bội, 32,20 % là lưỡng bội và 45,76 % là tứ bội

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy noãn.

Nuôi cấy noãn là phương pháp được xem là thành công nhất trong việc sản

xuất cây đơn bội trong nhiều loài (Hansen et al., 1995; Alanet et al., 2003) Tuy

nhiên, nuôi cấy noãn lại bị kiểm soát bởi rất nhiều yếu tố như: lựa chọn kiểu gen, giai đoạn phát triển của noãn, tiền xử lý, thành phần môi trường nuôi cấy, sự biến đổi của

phôi, điều kiện chiếu sáng và chất điều hòa tăng trưởng thực vật (Gémes-Juhász et

al., 2002; Shalaby 2007, Chen et al., 2010)

⮚ Lựa chọn kiểu gen

Kiểu gen của các cá thể cho vật liệu nuôi cấy đóng một vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy noãn Các tế bào và hình thái phát sinh phôi soma được kiểm soát bởi một loạt các điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường và môi trường vật

lý) và sự ảnh hưởng của kiểu gen Trong hành tây, khả năng cảm ứng đơn bội bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi kiểu gen của cây cho vật liệu nuôi cấy Dòng con lai F1 cho hiệu

quả sản xuất phôi và tái sinh cây cao hơn các dòng giao phấn (Gioffriau et al., 1997;

Bohanec and Jakse, 1999) Các kiểu gen đã được chứng minh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy noãn bí đao Tỷ lệ noãn cảm ứng dao động từ 0 % đến 48,8 % tùy thuộc vào kiểu gen

⮚ Giai đoạn phát triển noãn

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để tìm ra giai đoạn tối ưu nhất của noãn nhằm giúp cho quá trình nuôi cấy được diễn ra hiệu quả hơn Với các loài chẳng hạn như: củ cải đường, ngô, hướng dương, nhiều tác giả đã cho rằng nuôi cấy ở giai đoạn túi phôi gần trưởng thành là tối ưu nhất Các nghiên cứu mô học về sự phát triển của túi phôi dưa lưới đã chỉ ra rằng khả năng cảm ứng đơn bội ở giai đoạn đầu của túi phôi đã bị loại trừ Kết quả tốt nhất là vào giai đoạn túi phôi trưởng thành hoặc

hoàn toàn trưởng thành (Gémes-Juhász et al., 2002) Noãn nghệ tây phát triển ở các

giai đoạn khác nhau sẽ cho phản ứng khác nhau, khi noãn màu vàng là cảm ứng tốt nhất còn ở giai đoạn đã nở hoa thì không cảm ứng (Bhagyalakshmi, 1999)

⮚ Tiền xử lý

Sốc nhiệt là phương pháp xử lý được áp dụng khá phổ biến và có tác động khá hiệu quả đến sự cảm ứng phôi Tiền xử lý cũng có thể áp dụng ở các mức độ khác nhau, chẳng hạn như xử lý khi hoa cái vẫn còn nguyên vẹn hay noãn đã bị cô lập Với những loại cây khác nhau, cách thức, cấp độ và thời gian xử lý cũng khác nhau (Chen

et al., 2010)

Xử lý lạnh sẽ có hiệu quả đối với củ cải đường (Gu ̈rel et al., 2000), lúa mì

(Sibi et al., 2001) Noãn bí được ủ ở nhiệt độ 32 oC trong 4 ngày sau đó tiếp tục ủ ở 4 oC trong vòng 4 ngày nữa, kết quả thu được 22 - 28 % noãn cảm ứng thành phôi (Shalaby, 2007) Noãn thường được nuôi ngoài ánh sáng nhưng một vài trường hợp phải được ủ tối ví dụ như nghệ tây (Bhagyalakshmi, 1999) và dưa leo (Gémes-Juhász

et al., 2002), việc này giúp giảm thiểu hình thành phôi soma và tăng cường cảm ứng

Ngược lại, thời gian chiếu sáng cao sẽ có lợi hơn đối với hành tây (Puddephat et al.,

1999)

⮚ Môi trường nuôi cấy

Việc cải thiện môi trường nuôi cấy cũng đã góp phần làm tăng hiệu quả quá trình nuôi cấy noãn Nguồn nitơ hữu cơ, carbonhydrate và chất điều hòa tăng trưởng thực vật là 3 yếu tố thường xuyên được thay đổi nhất Mỗi giai đoạn trong quá trình nuôi cấy có thể có những nhu cầu dinh dưỡng khác nhau và mỗi loại cây sẽ có những yêu cầu khác biệt cho riêng chúng (Mukhambetzhanow, 1997) Trong quá trình cảm ứng nhu cầu dinh dưỡng chỉ ở mức thấp, đến khi tái sinh thì cần mức độ cao hơn Năm 1997, Giofriau và cộng sự đã sử dụng môi trường B5 cho việc cảm ứng và MS cho tái sinh cây CBM là môi trường được lựa chọn trong nuôi cấy noãn dưa leo

và cũng đem lại nhiều phản ứng tích cực (Gémes-Juhász et al., 2002) Các nghiên

cứu về môi trường nuôi cấy noãn chủ yếu xoay quanh những thay đổi về nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng, vitamin, acid amin Thông thường đường được sử dụng với nồn ngô sử dụng đến 12 % (Truong-Andre, Demarly, 1984) Với nồng độ 6 %, đường được chứng minh là có tác dụng thúc đẩy hình thành phôi và ức chế hình thành phôi soma trong nuôi cấy bao phấn lúa (Mukhambetzhanov, 1992) Một số acid amin và vitamin cũng được ghi nhận là có tác dụng tích cực đến quá trình cảm ứng noãn

như ở dâu (Thomas et al., 1999) và dưa leo (Gémes-Juhász et al., 2002)

Auxin và cytokinin là hai nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy noãn Trong dưa leo, TDZ đã đem lại nhiều hiệu quả tích cực trong việc cảm ứng và tái sinh cây Báo cáo về cảm ứng phôi cao nhất là 12,14 % trên giống IL69 với TDZ 0,03 mg/L và IL57 là 11,11 % với TDZ 0,07 mg/L

cũng đã được công bố (Li et al., 2013) NAA và BA phải được kết hợp với một tỷ lệ

cụ thể để có thể làm tăng khả năng phát triển chồi cả về chiều dài và số lá, NAA (0,54 mg/L): BA (2,22 mg/L) (Bhagyalakshmi, 1999)

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Hoa cái bí đỏ giống VINO 07 được trồng tại vườn của nông dân tại thành

phố Mới, tỉnh Bình Dương

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Phòng chuẩn bị môi trường, phòng hấp khử trùng, phòng bảo quản hóa chất: nồi hấp, máy cất nước một lần, lò vi sóng, tủ lạnh, máy đo pH, cân kỹ thuật, cân phân tích, đĩa Petri, Erlen

Phòng cấy vô trùng: tủ cấy, máy điều hòa, dao cấy, kẹp, đèn cồn Phòng nuôi cấy: máy điều hòa, kệ sắt, nhiệt kế, đèn chiếu sáng

2.1.4 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 2 oC Độ ẩm: 70 ± 5 %

Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux pH môi trường nuôi cấy: 5,7 – 5,8

2.1.5 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường MS ½ có bổ sung đường 30 g/L, agar 8 g/L và chất điều hòa tăng trưởng thực vật như TDZ (nồng độ thay đổi theo mục đích từng thí nghiệm)

2.1.6 Hóa chất

Cồn 700, cồn 960 C2H2, AgNO3

19

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quan sát hình thái giải phẫu

Mục đích thí nghiệm: Xác định và mô tả hình thái noãn trước và sau khi cảm

ứng

Vật liệu thí nghiệm: Hoa cái bí đỏ được thu hái một ngày trước khi nở Mô tả thí nghiệm: Noãn được cắt lát mỏng và nhuộm trong thuốc nhuộm đỏ

carmin, xanh iod theo quy trình như sơ đồ hình 2.1 và quan sát dưới kính hiển vi

2.2.2 Khảo sát nồng độ TDZ ảnh hưởng đến sự cảm ứng noãn tạo phôi cây bí đỏ Cucurbita moschata (Duch.) Poir

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ TDZ thích hợp cho việc cảm ứng tạo

phôi từ noãn bí đỏ

Vật liệu thí nghiệm: Hoa cái bí đỏ được thu hái một ngày trước khi nở

Ngâm trong thuốc nhuộm đỏ carmin, xanh iod trong 12 phút Rửa nước cất (3 lần)

Đặt mẫu trong Glycerin Ngâm trong Javel 10% 10 phút

Ngâm trong acid acetic 45% trong 12 phút Rửa nước cất (3 lần) Mẫu cắt

Quan sát dưới kính hiển vi

Rửa nước cất (3 lần)

Hình 2.1 Sơ đồ nhuộm đỏ carmin, xanh iod

Nghiệm thức Nồng độ TDZ (mg/L)