Định danh mẫu cây bình vôi (stephania spp ) thông qua đặc điểm hình thái, giải phẫu và dna barcode

Ông đã công bố các dẫn liệu hình thái giải phẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu về cây cỏ” [10].. Các nhà sinh học đã sử dụng phương pháp so sánh h

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

PHẠM THỊ NGỌC KHÁNH

ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.) THÔNG QUA

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ DNA BARCODE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

PHẠM THỊ NGỌC KHÁNH

ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.) THÔNG QUA

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ DNA BARCODE

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Thanh Nhàn

THÁI NGUYÊN - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Thị Thanh Nhàn Các kết quả nghiên cứu là trung thực chưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021

Tác giả

Phạm Thị Ngọc Khánh

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo, hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Em xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh học, bộ môn Di truyền học & CNSH, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT Chuyên Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian học tập

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình

đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021

Tác giả

Phạm Thị Ngọc Khánh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

PHỤ LỤC vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Bình vôi 3

1.1.1 Vị trí của cây Bình vôi trong hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bình vôi 3

1.1.3 Giá trị y học của cây Bình vôi 6

1.1.4 Vấn đề bảo tồn cây Bình vôi 9

1.2 Một số phương pháp định danh thực vật 14

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu 14

1.2.2 Phương pháp phân loại học phân tử 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu 21

2.1.1 Vật liệu thực vật 21

2.1.2 Vật liệu nhân đoạn gen matK và vùng gen ITS 21

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 21

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vôi 22 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 22

2.2.3 Phương pháp PCR 23

2.2.4 Phương pháp xác định trình tự nucleotid 24

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu mẫu cây Bình vôi nghiên cứu 25

3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu cây Bình vôi nghiên cứu 25

3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu mẫu cây Bình vôi nghiên cứu 27

3.2 Kết quả định danh mẫu cây Bình vôi bằng DNA barcode 29

3.2.1 Kết quả tách chiết và khuếch đại đoạn gen matK và vùng ITS 29

3.2.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen matK 30

3.2.3 Đặc điểm trình tự vùng gen ITS 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

1 Kết luận 39

2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool

DNA : Deoxyribose nucleic acid

Đtg : Đồng tác giả

ITS : Internal Transcribed Spacer

matK : Maturase K

NCBI : The National Center for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

rpoC1 : RNA polymerase beta' subunit

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của một số alkaloid tách chiết từ cây Bình vôi 8

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong phân loại thực vật 17

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR 21

Bảng 3.1 BLAS trình tự đoạn gen matK của Stepphania 31

Bảng 3.2 Đa hình nucleotide của đoạn gen matK 32

Bảng 3.3 Hệ số sai khác về trình tự nucleotide của các đoạn gen matK 33

Bảng 3.4 BLAS trình tự vùng gen ITS của Stepphania 36

Bảng 3.5 Đa hình nucleotide(SNP) của vùng gen ITS 36

Bảng 3.6 Hệ số sai khác về trình tự nucleotide của các vùng gen ITS 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bình vôi tím 5

Hình 1.2 Hạt bình vôi 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của L - tetrahydropalmatine 9

Hình 1.4 Bình vôi nhị ngắn 11

Hình 1.5 Bình vôi Cambod 12

Hình 1.6 Bình vôi hoa đầu 13

Hình 1.7 Bình vôi tím 14

Hình 1.8 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS 17

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu cây Bình vôi nghiên cứu 26

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái một số phận của mẫu cây Bình vôi nghiên cứu 26 Hình 3.3 Bình vôi nhị ngắn 27

Hình 3.4 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu thân mẫu cây Bình vôi 27

Hình 3.5 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu lá tẩy diệp lục mẫu cây Bình vôi 28

Hình 3.6 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu cuống lá mẫu cây Bình vôi 28

Hình 3.7 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu mặt cắt ngang phiến lá mẫu cây Bình vôi 29

Hình 3.8 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số 29

Hình 3.9 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩn PCR 30

Hình 3.10 Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vôi dựa vào trình tự đoạn gen matK 34

Hình 3.11 Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vôi dựa vào trình tự vùng gen ITS 37

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Hình ảnh BLAST trình tự đoạn gen matK 46

Phụ lục 2 Hình ảnh so sánh trình tự đoạn gen matK với trình tự trên Genbank 47

Phụ lục 3 Hình ảnh BLAST trình tự vùng ITS 51

Phụ lục 4 Hình ảnh so sánh trình tự vùng ITS với trình tự trên Genbank 52

Ở Việt Nam, chi Bình vôi (Stephanta) có khoảng 14 đến 16 loài, trong đó một

số loài như Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), Bình vôi vàng (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng (Stephania japonica Miers) đang

được khai thác, hàm lượng rotundin của các loài Bình vôi tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái Hiện nay, cây Bình vôi đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) Tuy nhiên, việc định loại có thể gặp khó khăn do sự giống nhau về hình thái, giải phẫu nên ảnh hưởng đến công tác bảo tồn nguồn gen cây này

Thực vật có thể nhận diện bằng nhiều phương pháp khác nhau Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh hướng nghiên cứu này đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như Hà thủ ô đỏ, Sóng rắn, Phong lữ thảo… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như cây không còn nguyên vẹn

Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loại phương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử Trong đó, mã vạch DNA được lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới Một số mã vạch DNA được

nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây trồng Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên

cứu nhiều trong định danh thực vật Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các

loài thực vật dựa trên trình tự vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai, hay các chi Erica, Scrophularia, Potamogeto và nhiều thực vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Định

danh mẫu cây Bình vôi (Stephania spp ) thông qua đặc điểm hình thái, giải

phẫu và DNA barcode”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Định danh được mẫu cây Bình vôi thu tại Lào Cai thông qua đặc điểm hình thái, giải phẫu và DNA barcode nhằm góp phần vào công tác bảo tồn và khai thác nguồn gen, dược chất của cây này tại Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bình vôi thu tại Lào Cai

3.2 Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây Bình vôi

thu tại Lào Cai

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Bình vôi

1.1.1 Vị trí của cây Bình vôi trong hệ thống phân loại

Cây Bình vôi phân bố ở những vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Vùng phân bố kéo dài từ Nepal, Ấn Độ, Thái Lan, miền nam Trung Quốc, phía nam Nhật Bản, Việt Nam, Lào, … đến phía đông Australia Số lượng loài đa dạng nhất tập trung tại các tỉnh phía bắc của Việt Nam, Lào, Thái Lan, nam Trung Quốc Tại Trung Quốc có khoảng 20 loài, tại Thái Lan có khoảng 11 loài [11] Các loài Bình vôi có sự khác nhau về hình thái, hàm lượng và thành phần của alkaloid

Những loài Bình vôi hiện có ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú Chúng sinh trưởng nhiều trên núi đá Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp

khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền

đông và nam châu Á cũng như Australasia Tên gọi dân dã nhất trong tiếng Việt là Bình vôi Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc:

Chi Bình vôi, hay chi Thiên kim đằng (Stephania spp.), là một chi thực vật có

hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australia Tên gọi dân dã nhất trong tiếng Việt là Bình vôi Tuy nhiên, nhiều loài có các tên gọi địa phương có thể trùng nhau

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bình vôi

Bình vôi là cây dây leo, thân thảo, sống lâu năm, phần gốc thường hóa gỗ Chồi và thân non thường nhẵn, có màu xanh đậm, xanh nhạt hay xanh bóng Vỏ

ngoài thân có những rãnh nứt dọc theo thân hay gờ, những mụn cóc xù xì Thân già

có màu xám tro, nâu sẫm, nâu nhạt hay nâu đất sáng

Lá mọc so le, cuống lá dài khoảng 5 - 10 cm, đính vào phiến lá khoảng 1/3 - 1/6 chiều dài lá Phiến lá mỏng, thường nhẵn, có hình khiên nhọn, hình tròn hoặc hình tam giác tròn, mép lá nguyên hay hơi chia thùy Gân lá dạng chân vịt gồm từ 8

- 11 gân xuất phát từ đỉnh của cuống lá Chóp lá nhọn hoặc gần tròn, gốc lá tròn hoặc có hình tim Phiến lá màu xanh đậm, xanh vàng nhạt hoặc xanh sáng, mặt dưới

có màu xanh nhạt hay hơi bạc [12], [60]

Rễ củ rất đa dạng, củ thường có dạng hình cầu, hình trụ hay hình bất định Kích thước và trọng lượng củ cũng rất khác nhau, có loài chỉ khoảng 1 - 3 kg, có loài củ rất nặng tới 80 kg Ruột củ màu vàng nhạt, vàng chanh, trắng ngà hoặc nâu

đỏ [12]

Cây Bình vôi có hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa có dạng tán kép, tán đơn, sim tán kép, dạng hình đầu và tán ngù, có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6 - 8 rời, xếp thành 2 vòng; 3 - 4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2 -

6, thường 4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xoè thành đĩa tròn Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3 - 4 lá đài và 3 - 4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [12], [30]

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có 1 phát triển thành hạt, còn 1 thoái hóa Ở quả chín, vỏ ngoài thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, hình trứng dẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai [12]

Nhìn chung, chi Bình vôi rất đa dạng về hình thái, phụ thuộc vào điều kiện đất đai, khí hậu nơi sinh sống và đặc tính của từng loài.Các loài thuộc chi Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21 - 23oC, lượng mưa 2000 – 2500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5 - 7 Một số loài có thể phân bố ở độ cao 2000 - 2800 m so

với mực nước biển Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa sáng, ưa đất có độ ẩm vừa phải [24]

(a)

(b)

(c)

(d)

Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bình vôi tím

(a) Cây Bình vôi; (b) Mặt trước và mặt sau lá cây Bình vôi tím; (c) Củ Bình vôi; (d)

Quả Bình vôi (nguồn website: www.24h.com.vn)

Các loài Bình vôi hiện ở Việt Nam thường có 2 thời vụ chồi chính trong năm Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi xuất hiện (trên thân và trên đầu củ) ngay từ tháng 11 - 12 Những chồi này ở trạng thái "chồi ngủ" cho đến mùa xuân (tháng 1 - 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ trong vòng 1 - 2 tháng, chồi

đã dài tới hơn 1m Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Bình vôi, vì

từ chồi này cây sẽ ra lá, hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân hè (chồi cấp II) Số lá của chồi cấp II nhiều hơn gấp bội so với chồi đông xuân (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi) Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi xuống đất Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác Người ta có thể lợi dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi Trong tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng [15], [24]

Hạt Bình vôi hình móng ngựa, rất nhỏ, khối lượng trung bình 1000 hạt khoảng 10 – 29 g Hạt thường phát tán nhờ nước Các cá thể Bình vôi trồng từ hạt thường sinh trưởng, phát triển nhanh hơn [15], [24]

Hình 1.2 Hạt bình vôi

a Hạt tươi; b hạt tươi bỏ vỏ; c Hạt khô (nguồn website: www.24h.com.vn)

Bình vôi là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta Cây không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao Cây Bình vôi sẽ là cây

có tiềm năng lớn trong y học Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phá rừng của người dân [1], [11]

1.1.3 Giá trị y học của cây Bình vôi

Cây Bình vôi có giá trị về mặt kinh tế, có tiềm năng lớn trong y học, được coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng cao nếu được sự quan tâm của các cấp lãnh đạo

Cây Bình vôi chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid rất đa dạng cả về hàm lượng và thành phần cấu tạo

(Bảng 1.1) Theo y học cổ truyền, củ Bình vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa các bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng [14], [15], [56]

Đối với những alkaloid của củ bình vôi chỉ có alkaloid A (tức là roemerin) do Ngô Vân Thu tách chiết được Dương Hữu Lợi thí nghiệm dược lý và đã đi tới những kết luận: Dung dịch có tác dụng gây tê niêm mạc và phong bế Tính theo công thức

G Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây tê niêm mạc tương đương với dung dịch 1,8% clohydrat cocain Theo thí nghiệm của Mak và Nelson, dung dịch có tác dụng gây tê phong bế mạnh hơn dung dịch clohydrat cocain 1% và dung dịch novocain 3% [30] Dung dịch alkaloid A có tác dụng đối lập với tác dụng gây tăng trương lực và nhu động co bóp ruột của dung dịch axetylcholin Dung dịch alkaloid A có tác dụng

an thần gây ngủ với liều lượng nhẹ nhưng với liều cao kích thích thần kinh hệ trung ương, gây co giật và chết Ngoài ra, alkaloid A có tác dụng giãn mạch hạ huyết áp, giảm cả huyết áp tối đa và tối thiểu [15]

Những cây thuộc chi Stephania (họ Menispermaceae) phân bố rộng Hơn

150 hợp chất alkaloid cùng với flavonoids, lignans, steroids, terpenoids và coumarins đã được tách chiết và xác định cấu trúc có hoạt tính sinh học cao [24] Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi mọc ở Việt Nam các chất tinh bột, đường khử oxy, malic acid, men oxydaza và một alkaloid với tỷ lệ 1,2 đến 1,5% (tính trên củ tươi) được đặt tên là rotundin [15] Rotundin là tinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Rotundin tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong sulfuric acid loãng Điểm nóng chảy của rotundin ở 141oC đến 144oC Tiến hành đo độ hấp thụ (A) của dung dịch chế phẩm

có nồng độ 30 g/ml trong dung dịch acid sulfuric 0,5 % ở bước sóng 281 nm từ 150 đến 160 [24]

Rotundin có tên khoa học là L - tetrahydropalmatin 2,3,9,10- tetramethoxy - 6H dibenzo quinolizine, C21H25NO4) Đây là một alkaloid, thu được lần đầu tiên vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin Do được tách chiết từ các chi họ khác nhau, mà trước đây hợp chất này còn mang một số tên gọi khác như: caseanin, rotundin và hyndarin Rotundin có tính kiềm yếu, được giải

(5,8,13,13a-tetrahydro-phóng bằng kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, cacbonat kiềm, NaOH… Người

ta sử dụng tính chất này để định lượng L - tetrahydropalmatin trong nguyên liệu thực vật hay để tủa trong quá trình chiết alkaloid toàn phần Chất này thường được người

ta sử dụng dạng muối clorat hoặc sulfat và bảo quản trong lọ màu hổ phách [24]

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của một số alkaloid tách chiết từ cây Bình vôi [14]

Chống sốt rét

Dehydroroemerine, cepharanthine, dicentrinone, tetrahydropalmatine, aloe - emodine, corydine, Nmethylliriodendronine, liriodenine, 2 - O, N dimethylliriodendronine,

Dl - tetrandrine, fangchinoline, d - tetrandrine,

d - isochondrodendrine, dịch chiết từ củ loài S venosa

(Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine

An thần (−) Stepholidine, L - tetrahydropalmatin

Kích đẻ cho phụ sản Tetrandrine

Đảo chiều đa kháng Insotrilobine và trilobine

Chống viêm, giảm đau Tetrandrine, fangchinoline, L - tetrahydropalmatin,

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của L – tetrahydropalmatine

(Nguồn website: http://nguyenlieuyduoc.com.vn/rotundin-chiet-xuat-cu-binh-voi) Tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu trong nước, Liên Xô cũ

và Trung Quốc [15]:

(1) Rotundin rất ít độc, tiêm vào tĩnh mạch máu một con thỏ với liều cao hơn

30 mg/1kg, con thỏ chỉ mệt trong 1-2 ngày, đồng tử bị liệt nhất thời rồi lại hết

(2) Tác dụng thần kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng, trên mẩu ruột lấy riêng

nó gây hiện tượng giảm khuẩn rõ rệt mà vẫn duy trì sự co bóp điều hòa và kéo dài,

có thể dùng chữa những trường hợp tăng nhu động ống tiêu hoá

(3) Tác dụng điều hoà đối với tim

(4) Tác dụng điều hoà hô hấp, có thể dùng chữa hen hay chữa nấc

(5) Rotundin có tác dụng an thần, gây ngủ và chống co quắp, hạ huyết áp Trên lâm sàng rotundin được áp dụng rộng rãi từ năm 1944 và trong suốt kháng chiến chống Pháp [15]

Mantsch John nghiên cứu cơ chế giảm đau của L - tetrahydropalmatin cho thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện [42] Một số bài thuốc quý được tuyên truyền phổ biến trong dân gian để chữa bệnh bằng cây Bình vôi [61]

1.1.4 Vấn đề bảo tồn cây Bình vôi

Bảo tồn đa dạng sinh học đặc biệt các loài thực vật làm thuốc là vấn đề toàn cầu, không chỉ riêng các quốc gia mà của các tổ chức quốc tế (IUCN, WWF, FAO, WHO,…) Vấn đề bảo tồn cây thuốc ở các quốc gia chính là sự nhận biết và bảo tồn giá trị sử dụng chúng trong y học dân tộc Đề cập đến bảo tồn những loài cây thuốc đang bị đe dọa không có cách nào khác là phải nắm vững về phân bố, tình hình hiện trạng để thiết lập các khu vực bảo tồn nội vi hay bảo tồn nguyên vị (in - situ) và bảo

tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển vị (ex - situ) Vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học nói chung, cây thuốc nói riêng, gắn với bảo tồn tri thức bản địa ở Việt Nam đã và đang được quan tâm đặc biệt [6]

Số liệu thống kê của ngành Y tế gần đây cho biết, mỗi năm ở nước ta tiêu thụ

từ 30.000 - 50.000 tấn các loại dược liệu khác nhau Ở Việt Nam trong những năm gần đây, mỗi năm đã xuất khẩu từ 5.000 đến gần 10.000 tấn dược liệu, với giá trị khoảng 15 triệu USD… Ngoài ra còn xuất khẩu một số bán thành phẩm thuốc dưới dạng hoạt chất như: Berberin, palmatin, rotundin, rutin,… Một số doanh nghiệp đã xuất khẩu được thuốc hoạt chất như: Artemisinin, artesunat,… và nhiều dạng thuốc Đông dược khác [6]

Nguồn cây Bình vôi làm dược liệu chủ yếu được khai thác từ tự nhiên Tốc

độ khai thác ngày càng gia tăng, cách thức khai thác chủ yếu là khai thác hủy diệt

và hầu như không có kế hoạch tái sinh, do đó, sự phân bố và số lượng cây Bình vôi trong tự nhiên ngày càng bị thu hẹp và khan hiếm [18]

Trước đây, khi các nhà khoa học khảo sát cây thuốc ở An Giang thấy rằng, bình vôi là loại cây trồng khá phổ biến tại vùng núi Cấm và núi Tô thuộc hai huyện Tri Tôn và Tịnh Biên nhưng hiện nay là đối tượng cây trồng quý hiếm rất khó tìm thấy trong tự nhiên Trong khi đó, bình vôi là cây có hoa đơn tính khác gốc (cây đực

và cái riêng) Vì vậy, khi chỉ có một mình hoặc một nhóm chỉ toàn cây đực, hoặc toàn cây cái thì không thể thụ tạo hạt được, dẫn đến khả năng duy trì nòi giống có phần hạn chế [4]

Loài Bình vôi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng Cây bị đào rễ để làm thuốc dẫn đễn nguy cơ tuyệt chủng cao Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) Loại cây quý này đang dần cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phá rừng của người dân [1]

Hiện nay có 4 loài Bình vôi được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996), Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam (2007) và Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ Có tên trong danh mục II.A- Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của

chính phủ (30/03/2006) là Bình vôi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep), Bình vôi hoa đầu (Stepphania cepharantha Hayata), Bình vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stepphania brachyandra Diels) [1], [22]

Loài Bình vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stepphania brachyandra Diels)

là loài đặc hữu vùng Nam Trung Quốc- Bắc Việt Nam Ở Việt Nam, bình vôi nhị ngắn phân bố ở huyện Phong Thổ- tỉnh Lai Châu, huyện Sapa và huyện Bát Xát- tỉnh Lào Cai Đây là loài bình vôi duy nhất có thể mọc ở vùng núi cao tới 1800m (hoặc hơn), có hàm lượng hoạt chất L Tetrahydropalmatin cao nhất so với các loài

khác trong chi Stepphania Loài Bình vôi núi cao đã bị khai thác nhiều cùng với các

loài bình vôi khác để chiết xuất hoạt chất làm thuốc an thần ở trong nước và xuất

khẩu qua biên giới Bình vôi núi cao (Stepphania brachyandra Diels) đã được đưa

vào sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) nhằm tăng cường quản lý và bảo vệ với mức phân hạng như sau:

xâm hại tới nơi sống của Bình vôi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep) ở Krông Pách – Đăk lăk nên có thể xếp Bình vôi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep)

vào diện những cây thuốc bị đe dọa, cần bảo vệ Loài cây thuốc này đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ Có tên trong danh mục II.A- Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): R

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): VU.A3c,d [22]

Hình 1.5 Bình vôi Cambod

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 259)

Bình vôi hoa đầu (Stepphania cepharantha Hayata) là cây thuốc đặc

biệt quý hiếm và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng rất cao ở Việt Nam Xét về giá trị sử dụng, đây là loài Bình vôi duy nhất phát hiện thấy có hợp chất cepharatin (có tác dụng chống ung thư) Ở Việt Nam, Bình vôi hoa đầu

(Stepphania cepharantha Hayata) phân bố ở tỉnh Quảng Ninh (huyện Cẩm

phả: Quang Hanh); Hòa Bình (huyện Kỳ Sơn), là loài cực hiếm được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ Loài có tên trong danh mục II.A - Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): V

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): CR.B2a,b(ii,iii,iv,v) [22]

Hình 1.6 Bình vôi hoa đầu

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 261)

Củ dòm hay Bình vôi tím (Stephania Dielsiana C.Y.Wu) thường ưa mọc ở

những vùng có núi đá tại các tỉnh Hà Sơn Bình, Hà Nam, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa rễ củ dùng làm thuốc an thần, thanh nhiệt, giải độc, tiêu phù, giảm

đau được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá sẽ nguy cấp (V)

Cây rất hiếm ở Việt Nam và có thể bị tuyệt chủng.[22]

Hình 1.7 Bình vôi tím

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 262)

Do vậy, hướng nghiên cứu của đề tài là sưu tập, định danh mẫu cây Bình vôi thu được thông qua đặc điểm hình thái, giải phẫu và DNA barcode nhằm góp phần

vào công tác bảo tồn (in situ, ex situ, in vitro) và khai thác nguồn gen, dược chất của

cây này tại Việt Nam

1.2 Một số phương pháp định danh thực vật

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu

Trong lịch sử phát triển thực vật học thì hình thái, giải phẫu thực vật phát triển tương đối sớm Từ những năm 371-286 TCN, Theo phraste được gọi

là người sáng lập môn thực vật học Ông đã công bố các dẫn liệu hình thái giải phẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu

về cây cỏ” [10]

Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, so sánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẫu trong phòng thí nghiệm, so sánh các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, cuối cùng là phân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét Để phân biệt các loại tế bào hay thành phần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thường các lát cắt được nhuộm màu và tùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp Trong phòng thí nghiệm thực

vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celulose sẽ nhuộm đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ được nhuộm xanh với lục iod, nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin…[20]

Các nhà sinh học đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu đối chiếu khóa phân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa

học của các mẫu Hà thủ ô đỏ [10], cây Phong lữ thảo (Pelargonium hortorum L H

Bailey) [7], cây Sóng rắn ở Thái Nguyên [25] Đặc biệt trong nghiên cứu của Nguyễn Quỳnh Nga và đtg (2016) đã mô tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa

định loại cho 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris ở Việt Nam [43]

Việc sử dụng phương pháp so sánh hình thái đã hỗ trợ trong các nghiên cứu

để định loài Bình vôi (Stephania spp.)

1.2.2 Phương pháp phân loại học phân tử

(4) sử dụng công cụ tin sinh học trong phân tích và ứng dụng [37]

Sau khi kiểm tra rộng rãi các vùng gen trong hệ gen của ty thể, lục lạp và nhân

thì bốn đoạn gen/vùng gen chính là rbcL , matK, trnH - psbA và ITS được thống

nhất là mã vạch DNA [33], [38], [39], [40], [46], [50]

Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạng đòi hỏi hai bước cơ bản:

(1) Xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết;

(2) So sánh mã vạch DNA của một mẫu chưa biết với thư viện mã vạch DNA 1.2.2.2 Nghiên cứu trên thế giới sử dụng mã vạch DNA

Các mã vạch DNA đã được phát triển, thử nghiệm và sử dụng để giải quyết các câu hỏi cơ bản về hệ thống sinh thái, sinh học tiến hóa và bảo tồn, bao gồm lắp ráp cộng đồng, mạng lưới tương tác loài, khám phá phân loại và đánh giá các lĩnh vực ưu tiên bảo vệ môi trường

Gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên trên cây

thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys

(UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của

gen trnK và chưa rõ chức năng Các nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại

thực vật [48]

Nhóm nghiên cứu do Savolainen và cộng sự (2005) sử dụng gen matK để

nhận dạng 1600 loài Lan Trong quá trình thực hiện, họ phát hiện một loài trước đây được cho là Lan thực ra lại là hai loài tách biệt Loài này sống trên những dốc khác nhau trên núi và có hoa hình dạng khác nhau để thích nghi với những loài côn trùng thụ phấn khác nhau [46]

Gen matK thường được sử dụng trong việc định danh, phân loại ở các loài

thực vật hạt kín, là loài chiếm đa số trong các hệ sinh thái hiện nay Layhaye và

cộng sự (2008) đã lựa chọn gen matK là một mã vạch ưa thích trong phân loại thực vật Nghiên cứu của Lahaye và đtg (2008) chỉ ra rằng mã vạch DNA thực vật có thể

được sử dụng để đánh giá nhận dạng loài trong các điểm nóng đa dạng sinh học giúp bảo tồn cũng như áp dụng giả thuyết để giám sát thương mại quốc tế trong các loài Lan đang bị đe dọa [39]

Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là locus được giải mã phổ biến nhất

Vùng ITS có hiệu quả cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và

nấm (ngoại trừ dương xỉ) và đây là một locus được sử dụng đọc trình tự với DNA

ngắn [49] Ở mức độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các

loài gần gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu Thuận lợi của

vùng ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại Vùng ITS cũng

đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong loài [32]

ITS là một đoạn đệm nằm giữa gen mã hóa rRNA của tiểu phần nhỏ và tiểu

phần lớn ribosome (vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2 (hình 1.8) [63]

Hình 1.8 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS ( Nguồn website: https://www.researchgate.net/profile/Estela-Aguilar)

Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp rRNA Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong phân loại

thực vật

Đối tượng phân loại Cấp độ

phân loại Năm Tài liệu tham khảo

Phân tông Saccharinae

Chi Plantago

(Plantaginaceae) Loài 2002 John Kress và đtg [37] Chi Tsuga (Pinaceae) Loài 2008 Havill và đtg [35]

Họ Brassicaceae Tông 2010 Warwick và đtg [51]

Chi Erica (Ericaceae) Loài 2011 Pririe và đtg [ 45]

Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng

di truyền của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di

truyền của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch

đại và xác định trình tự DNA ribosome Trình tự nucleotide vùng gen ITS đã được

nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú và đa dạng,

thuận lợi cho việc phân tích so sánh Vùng gen ITS được chứng minh đặc biệt hữu

ích trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ ở các loài trong bảng 1.4

Một ví dụ về sự khác biệt giữa Schisandra chinensis - Ngũ vị tử bắc với các loài khác trong chi Schisandra Li và đtg (2013) đã thấy sự sai khác tại vị trí 86 bp trên vùng gen ITS, quan sát thấy C thay thế cho A trong các quần thể hoang dã khi

so sánh với quần thể người dân trồng Vùng ITS2 còn phân biệt rõ ràng Schisandra chinensis với Schisandra sphenanthera [40]

Một nghiên cứu khác nhằm xác định chi Hoàng kỳ (Astragalus) gồm nhiều

loài có sự tương đồng về hình thái Trong nghiên cứu của Gao và đtg (2009), bốn

gen mã hóa (trnH-psbA, rpoC1, rbcL, matK) và hai vùng gen không mã hóa (ITS, ITS2) được so sánh giữa 319 loài Mã vạch ITS2 và ITS có hiệu quả cao hơn đối với

việc phân biệt loài [34]

1.2.2.3 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA ở Việt Nam

Việt Nam cũng đã bắt kịp xu hướng khi sử dụng mã vạch DNA vào công cuộc giám định thực vật phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen các loài thực vật quý hiếm Những năm gần đây các công trình nghiên cứu sử dụng các đoạn gen/vùng gen làm mã vạch DNA trong việc phân tích quan hệ di truyền, phân loại thực vật ngày càng phổ biến

Năm 2011, Dương Văn Tăng và đtg đã phân lập và xác định trình tự đầy đủ

vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân của ba loài gỗ quý Trắc (D cochinchinensis), Cẩm lai (D oliveri) và Sưa (D tonkinensis) ở Việt Nam và bổ sung cho Ngân hàng trình

tự DNA gen quốc tế Qua việc phân tích quan hệ di truyền sử dụng trình tự ITS cho thấy: Sưa (D tonkinensis) có họ hàng gần nhất với D sisso và nằm trong một nhóm lớn với các loài D frutescens, D decipularis, D brasiliensis và D congestiflora

Loài Trắc (D cochinchinensis) có mối quan hệ họ hàng gần nhất với Cẩm lai (D oliveri) [21]

Năm 2014, Nguyễn Thị Phương Trang và đtg đã sử dụng kết hợp ba vùng

gen lục lạp rbcL, matK, trnH-psbA để nghiên cứu đặc điểm di truyền ba loài Sao (Hopea) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam gồm Sao Hòn Gai (Hopea chinensis), Sao Hải Nam (H hainanensis) và Sao Mặt Quỷ (H mollissima) Mức độ

khác biệt di truyền rất thấp từ 0,2 đến 0,6 giữa các cặp loài nghiên cứu, dùng để nhận biết và so sánh với các loài khác trên thế giới [26]

Phan Kế long và đtg (2014) cũng sử dụng kết hợp hai vùng gen matK và ITS

trong việc phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu trên cơ

sở phân tích trình tự nucleotide hai vùng gen đã chọn Kết quả nghiên cứu đã giải

mã được 1485 nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen ITS-rDNA cho tổng số 17 cá thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) và Tam thất trắng (P stipuleanatus) Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA chỉ ra các loài Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa Hai thứ sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P vietnamensis Ha & Grushv var vietnamensis) của loài sâm Việt (P vietnamensis Ha & Grushv.) có quan hệ chị em [13]

Trong nghiên cứu của Hà Văn Huân và Nguyễn Văn Phong (2015) đã xác

định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) Đoạn gen matK được nhân bản thành công và xác định trình tự nucleotide với kích thước 951 bp Trình tự nucleotide của đoạn gen matK xác định được từ cây

Trà hoa vàng Tam Đảo được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã

số KP241692 [9]

Vùng gen rpoC1 (RNA polymerase beta' subunit) được Lý Thị Bôn và đtg

(2017) nghiên cứu sử dụng làm mã vạch DNA trong việc định loại loài Hồng trâu

(Capparis versicolor Griff.) Bằng kỹ thuật PCR, vùng gen rpoC1 đã được phân lập

thành công từ DNA lục lạp có kích thước 527 nucleotide, mã hóa 175 amino acid

Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự DNA vùng gen rpoC1 có thể xác định

chính xác mẫu nghiên cứu thuộc chi Capparis, và tạm thời xác định thuộc loài Capparis versicolor Griff [2]

Năm 2017, Nguyễn Thị Hồng Mai và đtg đã nghiên cứu đặc điểm phân tử

vùng gen rpoC của loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) và Sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam và ứng dụng phân loại Chỉ số tương đồng của vùng gen rpoC từ 2 mẫu nghiên cứu với trình tự tương đồng từ hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis tham khảo là 99% Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy vùng gen rpoC có khả năng dùng trong phân loại các loài của chi Sưa (Dalbergia) Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis của Việt Nam đã được đăng ký tại

Genbank với mã số lần lượt là KY287755 và KY287750 [16]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Mẫu cây Bình vôi thu thập được ở tỉnh Lào Cai

2.1.2 Vật liệu nhân đoạn gen matK và vùng gen ITS

Các cặp mồi nhân gen matK, ITS do phòng Công nghệ gen, khoa Sinh học,

trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR

Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy ly tâm (Nhật Bản), máy điện

di (Mỹ), pipet (Eppendorf - Đức), máy PCR, kính hiển vi điện tử Kruss (Đức) thuộc phòng thí nghiệm khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên cùng các trang thiết bị khác thuộc viện Công nghệ sinh học thuộc viện Hàn lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 9 năm 2020 đến tháng 6 năm 2021

Các thí nghiệm và luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên

Thí nghiệm xác định trình tự đoạn gen matK, vùng gen ITS được thực

hiện tại viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vôi

Nhận diện mẫu cây Bình vôi dựa vào đặc điểm hình thái được tiến hành theo Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) [43], tài liệu ‘Cây cỏ Việt Nam’ [8], tài liệu

‘Paris Linaeus” [41] Các chỉ số nhận diện chính gồm: Chiều cao thân chính của cây, màu sắc thân cây; số lượng lá, hình dạng lá, kích thước lá; Hình dạng, màu sắc,

số lượng của đài, tràng, nhị, nhụy hoa

Phân tích cấu tạo giải phẫu các cơ quan dinh dưỡng (cuống hoa, thân cây, rễ cây) bằng phương pháp làm tiêu bản theo hướng dẫn của Hoàng Thị Sản và Nguyễn Thị Phương Nga (2008) [20] Các bước làm tiêu bản gồm:

+ Cắt ngang thân, rễ, cuống lá thành các lát mỏng, tẩy sạch bằng nước javen, rồi rửa thật sạch bằng nước thường

+ Nhuộm kép tiêu bản: nhỏ dung dịch xanh methylen lên đĩa đồng hồ có chứa mẫu vật để trong vòng 30 phút sau đó rửa lại thật sạch bằng nước thường Tiếp đó dùng dung dịch carmin nhỏ vào mẫu vật vừa nhuộm, để trong vòng 30 - 45 phút rồi rửa lại thật sạch bằng nước thường

+ Lên kính: nhỏ 1 giọt nước lên lam kính, đặt mẫu vật lên trên giọt nước và đậy lamen

+ Quan sát, chụp ảnh, và phân tích kết quả thu được

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA

Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Gawell và CS

có cải tiến

Thành phần đệm chiết:

2ml tris HCl 1M, pH=8 5,6 ml NaCl 5M

0,8 ml EDTA 0,5M, pH=8 0,8g CTAB (4%)