Định danh mẫu cây bình vôi tím bằng phương pháp hình thái so sánh kết hợp với mã vạch its, matk

Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vôi .... Kết quả nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, hình thái mẫu cây Bình vôi tím .... Đặc điểm hình thái mẫu cây Bình vôi tím

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

NGUYỄN VĂN TÙNG

ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VÔI TÍM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÌNH THÁI SO SÁNH KẾT HỢP

VỚI MÃ VẠCH ITS, matK

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Phạm Thị Thanh Nhàn

2 TS Từ Quang Trung

THÁI NGUYÊN - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Thị Thanh Nhàn và TS Từ Quang Trung Các kết quả nghiên cứu là trung thực chưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác

Xác nhận đại diện

của người hướng dẫn khoa học

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2023

Tác giả

Nguyễn Văn Tùng

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Nhàn

và TS Từ Quang Trung, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã chỉ bảo, hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh học, bộ môn Di truyền học & CNSH, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT Thuận Thành số 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian học tập

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2023

Tác giả

Nguyễn Văn Tùng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Các loài cây Bình vôi 3

1.1.1 Vị trí của loài cây Bình vôi tím trong hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bình vôi 4

1.1.3 Giá trị y học của cây Bình vôi 8

1.1.4 Vấn đề bảo tồn Bình vôi 11

1.2 Những phương pháp để định danh thực vật 15

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu 15

1.2.2 Phương pháp phân loại phân tử học 16

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ VẬT LIỆU 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Vật liệu là thực vật 23

2.1.2 Vật liệu nhân đoạn gen ITS và vùng gen matK 23

2.1.3 Thiết bị và hóa chất 23

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vôi 24

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 24

2.2.3 Phương pháp PCR 26

2.2.4 Phương pháp xác định trình tự nucleotid 26

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, hình thái mẫu cây Bình vôi tím 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu cây Bình vôi tím nghiên cứu 27

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu mẫu cây Bình vôi tím nghiên cứu 29

3.2 Kết quả định danh mẫu cây Bình vôi tím bằng DNA barcode 31

3.2.1 Kết quả tách chiết và khuếch đại đoạn gen matK và vùng ITS 31

3.2.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen matK 32

3.2.3 Đặc điểm trình tự vùng gen ITS 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Aligment Search Tool Công cụ tìm kiếm trình tự

tương đồng

ITS Internal Transcribed Spacer Vùng nội phiên mã trên

gene mã hóa RNA ribosome

maturase K trong lục lạp NCBI The National Center for

Biotechnology Information

Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Mỹ) PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp DNA rpoC1 RNA polymerase β' subunit Gene mã hóa chuỗi β' RNA

polymerase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi 5

Bảng 1.2 Hoạt tính của một số alkaloid từ những loài cây Bình vôi 10

Bảng 1.3 Những nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong định danh các loài thực vật 19

Bảng 2.1 Trình tự của mồi vùng gen ITS và vùng gen 23

Bảng 3.1 Kết quả BLAST trình tự đoạn gen matK của chi Stepphania 33

Bảng 3.2 Đa hình nucleotide (SNP) của đoạn gen matK 34

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền về trình tự nucleotide của các đoạn gen matK 35

Bảng 3.4 Kết quả BLAST trình tự vùng ITS của cây Bình vôi tím 37

Bảng 3.5 Đa hình nucleotide (SNP) của vùng gen ITS 38

Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền về trình tự nucleotide của các vùng gen ITS 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan cây Bình vôi tím 6

Hình 1.2 Hạt cây bình vôi 7

Hình 1.3 Công thức hóa học của chất L– tetrahydropalmatine 9

Hình 1.4 Bình vôi nhị ngắn 12

Hình 1.5 Bình vôi Cambod 13

Hình 1.6 Bình vôi hoa đầu 14

Hình 1.7 Bình vôi tím 15

Hình 1.8 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS 18

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái một số phận của mẫu cây Bình vôi tím 27

Hình 3.2 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu thân mẫu cây Bình vôi tím 29

Hình 3.3 Hình ảnh giải phẫu lá tẩy diệp lục của mẫu Bình vôi tím 30

Hình 3.4 Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu Bình vôi tím 30

Hình 3.5 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu mặt cắt ngang phiến lá cây Bình vôi tím 31

Hình 3.6 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu mặt cắt tiêu bản cuống lá cây Bình vôi tím 31

Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số 32

Hình 3.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩn PCR 32

Hình 3.9 Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vôi dựa vào trình tự đoạn gen matK 36

Hình 3.10 Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vôi tím dựa vào trình tự vùng gen ITS 40

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây Bình vôi tím có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê

(Menispermaceae), là một loài dây leo, phần rễ phát tiển thành củ to, bám vào núi đá Cây có tại tỉnh Hòa Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Trong ngành y học cổ truyền thì cây Bình vôi là loại cây dược liệu có vị dắng, tính lương, được quy vào hai kinh là Tỳ và Can có tác dụng chính là trấn kinh, an thần, tuyên phế Trong y học hiện đại, cây Bình vôi có chứa rất nhiều alkaloid có tác dụng an thần, ổn định huyển áp, chống co giật và chữa nhức đầu, sốt nóng…

Ở Việt Nam, có khoảng 14 – 16 loài cây thuộc chi Bình vôi (Stephania), như loài Bình vôi vàng (Stepphania rotunada Lour), Bình vôi tím, Bình vôi hoa đầu (Stephania cephanntha Hayata), Thiên kim đẳng (Stephania japonica

Miers), … Các loài cây Bình vôi được khai thác có hàm lượng rotundin tùy

thuộc vào điều kiện sinh thái và từng loài cây Hiện nay, các loài Bình vôi này

đã được ghi vào Sách đỏ của Việt Nam, năm 1996 ở mức độ đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) Tuy vậy, việc định danh loài có thể gặp khó khăn đã ảnh hưởng đến công tác bảo tồn nguồn gen của các loài cây này

Các phương pháp định danh loài trước đây thường dùng như so sánh các đặc điểm về hình thái, cấu tạo giải phẫu, đặc điểm sinh lý, hóa sinh… Với hướng nghiên cứu trên đã có thành công trên nhiều đối tượng thực vật như Song rắn, Phong lữ thảo, Hà thủ ô đỏ,… Tuy vậy, các phương pháp định danh này sẽ kém hiệu quả nếu như các cây cần định danh không còn nguyên vẹn, giống nhau về đặc điểm hình thái, giải phẫu giữa các loài thân thuộc

Công nghệ sinh học hiện đại đã bổ sung vào hệ thống định danh thực vật một phương pháp định danh mới là dựa vào chỉ thị sinh học phân tử Trong đó,

mã vạch DNA đã được chọn là một trong các phương tiện định danh mới nhất hiện nay Một số mã vạch DNA được ứng dụng và nghiên cứu hiệu quả trong định danh nhiều loài thực vật làm nguyên liệu trong y học cổ truyền như:

rpoC1, ITS, matK, trnH-psbA, rbcL, … Theo đó, vùng gen ITS nằm trong nhân

tế bào, bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2 được nghiên cứu nhiều trong định

danh các loài thực vật như cây Cẩm lai, cây gỗ Trắc, cây Sưa hay các chi

Scrophularia, Erica, Potamogeto… Vùng gen matK ở lục lạp cũng mang lại

những thành tựu nhất định trong định danh nhiều loài cây hiện nay

Xuất phát với những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành chọn và thực hiện

đề tài: “Định danh mẫu cây Bình vôi tím bằng phương pháp hình thái so sánh kết hợp với mã vạch ITS, matK”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Định danh được mẫu Bình vôi tím thu tại tỉnh Hòa Bình thông qua các đặc

điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu và mã vạch vùng gen ITS, đoạn gen matK

nhằm góp phần vào công tác khai thác và bảo tồn nguồn gen các loài cây dược liệu tại Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Cấu tạo giải phẫu và hình thái mẫu Bình vôi tím thu tại tỉnh Hòa Bình

3.2 Đặc điểm trình tự vùng gen matK, ITS của mẫu cây Bình vôi tím thu tại

tỉnh Hòa Bình

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Các loài cây Bình vôi

1.1.1 Vị trí của loài cây Bình vôi tím trong hệ thống phân loại

Khu vực phân bố của các loài Bình vôi kéo dài từ Việt Nam, Lào, miền nam Trung Quốc, phía mam của nước Nhật, Thái Lan, Ấn Độ, … đến phía đông nước Úc Đây là vùng khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới Các loài Bình vôi có sự đa dạng loài cao nhất tập trung tại các tỉnh phía bắc của Thái Lan, Lào, Việt Nam, phía nam Trung Quốc Các loài Bình vôi khác nhau chúng khác nhau về hàm lượng alkaloid và hình thái giải phẫu Ở Trung Quốc có khoảng

20 loài cây Bình vôi còn Thái Lan có khoảng 11 loài [11]

Những loài cây Bình vôi tại Việt Nam rất phong phú và đa dạng, thường

sống trên các vách núi đá Các loài thuộc chi Bình vôi Stephania có hoa, hạt

kín Trong hệ thống phân loại thực vật, Bình vôi thuộc:

Giới (regnum) Plante

Chi Stephania có khoảng trên 45 loài Một số loài được công bố ở Việt

Nam như:

 Stephania glabra (Roxb) Miers

 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang

 Stephania pierrei Diels

 Stephania excentrica H S Lo

 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong

 Stephania kwangsiensis H S Lo

 Stephania sinica Diels

 Stephania viridiflavens H S Lo et M.Yang

 Stephania rotunda Lour

 Stephania dielsiana Y C Wu

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bình vôi

Cây Bình vôi thường có lá mọc so le, lá của chúng có cuống dài khoảng 5

- 10 cm và đính vào phiến lá khoảng 1/3 - 1/6 chiều dài lá Chóp lá hình gần tròn hoặc hình nhọn, gốc lá hình trái tim hoặc có hình tròn Lá có gân dạng chân vịt gồm khoảng từ 8 - 11 được xuất phát từ đỉnh của cuống lá Phiến lá của cây Bình vôi thường nhẵn, mỏng, nhẵn, có hình khiên nhọn, tam giác tròn hoặc tròn, mép của lá hơi chia thùy hay nguyên Phiến lá có màu xanh vàng nhạt, xanh đậm hoặc xanh sáng, mặt dưới có màu xanh nhạt hay hơi bạc [12], [60]

Bình vôi là loài thực vật thân thảo và thân dây leo, chúng sống lâu năm, có phần gốc thường bị hóa gỗ Thân già có nâu sẫm, màu xám tro, nâu nhạt hay nâu đất sáng Thân non có màu xanh nhạt, xanh đậm hay xanh bóng, có chồi thường nhẵn Vỏ bên ngoài thân có những rãnh nứt dọc thân hay gờ, những mụn cóc xù xì

Cây Bình vôi có hoa đơn tính khác gốc Hoa cụm có dạng tán đơn, tán kép, sim tán kép, dạng đầu và tán ngù, hoa có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6 - 8 rời, xếp thành 2 vòng; 3 - 4 cánh hoa, dạng vỏ sò, hoa có màu vàng, đôi khi trắng xanh; có 2 – 6 nhị, thường 4 nhị, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xoè thành đĩa tròn Hoa cái chỉ gồm một lá đài và hai cánh hoa (rất ít khi có 3 - 4 lá đài và 3 - 4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [12], [30]

Bảng 1.1 Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi [26] STT Các loài Bình vôi Điểm đặc trưng về hình thái

1 Stephania rotunda Lour - Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một nửa giống

hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm

- Lá hình khiên, mọc cách

2 Stephania pierrei Diels - Ngọn hoa có nhiều chấm màu tím hồng

- Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác

- Hoa đực không có cánh hoa

3 Stephania hainanensis H.S

Lo et Y Tsoong

- Cành non

- Cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt

4 Stephania cambodiana Gag

- Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá

- Gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng

6 Stephania excentrica H S

Lo

- Cuống lá rất dài, có khi đến 14 cm

- Giá noãn có lỗ lệch 1 bên

7 Stephania cepharantha Hay - Giá noãn không có lỗ

8 Stephania sinica Diels - Giá noãn không có lỗ

9 Stephania viridiflavens H.S

Lo et Yang

- Lá có phiến hình tam giác

- Cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá

Quả là dạng quả hạch, hình trứng, trứng bầu, gần tròn, hai bên dẹt, vỏ ngoài của cây Bình vôi thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Bầu gồm hai noãn, nhưng chỉ có một noãn phát triển thành hạt, còn một noãn thoái hóa Quả chín có hạt hình trứng dẹp, hình móng ngựa hoặc hơi tròn, hai mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có bốn hàng vằn hoặc gai [12]

Rễ của cây Bình vôi rất đa dạng, rễ củ thường có dạng hình cầu, hình trụ hay hình bất định Kích thước và trọng lượng của củ cũng rất đa dạng, có loài

củ chỉ khoảng 1 - 3 kg, có loài củ rất nặng tới 80 kg Ruột củ màu vàng chanh, vàng nhạt, trắng ngà hoặc nâu đỏ [12]

Những loài cây thuộc chi Bình vôi thường sinh trưởng và phát triển trong các rừng nguyên sinh hoặc rừng thứ sinh Các loài cây Bình vôi đều ưa loại đất

có độ ẩm vừa phải và ưa sáng Cây Bình vôi thích nghi trong điều kiện nhiệt độ trung bình vào khoảng 21-23oC, với hàm lượng mưa trung bình vào khoảng 2000- 2500mm Chúng sinh trưởng và phát triển tốt trên loại đất có nhiều mùn

và dễ thoát nước có độ pH= 6,5-7 hơi axit Có những loài cây Bình vôi chúng sống ở độ cao lớn khoảng 2000- 2800m so với mực nước biển Tóm lại, các loài cây của chi Bình vôi rất đa dạng và phong phú về hình thái giải phẫu, sự đa dạng đó phụ thuộc nhiều vào điều kiện đất đai và khí hậu, cũng như đặc tính của loài [24]

(a)

(b)

(c)

Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan cây Bình vôi tím

(a) Cây Bình vôi;(b) Quả Bình vôi; (c) Củ Bình vôi

(nguồn website: www.24h.com.vn)

Cây Bình vôi có hạt rất nhỏ hình móng ngựa và có khối lượng khoảng 10-29 g/ 1000 hạt, chúng phát tán nhờ nước Những cây Bình vôi trồng bằng hạt thường sinh trưởng và phát triển tốt hơn [15], [24]

Hình 1.2 Hạt cây bình vôi

a Hạt tươi; b hạt tươi bỏ vỏ; c Hạt khô (nguồn website: www.24h.com.vn)

Ở Việt Nam, cây Bình vôi có chồi chính nẩy ở hai vụ chính trong một năm “Chồi ngủ” là chồi ở trạng thái không sinh trưởng và phát triển cho đến mua xuân trong khoảng tháng 1 - tháng 2 mới bắt đầu chu kỳ phát triển và sinh trưởng Chồi đông xuân là các chồi xuất hiện trên đầu của củ và trên thân từ khoảng tháng 10 đến tháng 12 Chồi đông xuân là chồi quan trong nhất đối với cây Bình vôi Từ chồi này cây sẽ hình thành hoa, quả và ra lá và hình thành chồi xuân hè, hay còn gọi là chồi cấp II có số lượng gấp bội so với số lá trên chồi đông xuân (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi) Từ những mảnh

củ đem bổ ra và vùi xuống đất cũng có thể mọc thành cây Khoảng 1/3 phía trên của củ có khả năng mọc chồi hơn các loại mảnh khác Cây bình vôi có hoa thụ phấn chéo nhờ côn trùng [15], [24]

Bình vôi thường dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, chúng là những dạng dây leo Trồng cây Bình vôi cần ít công chăm sóc và yêu cầu trình độ canh tác không cao Chính vì vậy những loài Bình vôi rất có nhiều tiềm năng trong ngành y học cổ truyền Hiện nay các loài cây Bình vôi quý đang bị cạn kiệt dần và có nguy cơ tuyệt chủng cao do khai thác và tàn phá rừng của người dân Việt Nam [1], [11]

1.1.3 Giá trị y học của cây Bình vôi

Cây Bình vôi là loại cây có thể “xóa đói giảm nghèo” cho đồng bào dân tộc thiểu số vùng núi cao nhưng cần được sự qua tâm của các cấp lãnh đạo Vì đây là loại cây trồng có giá trị kinh tế và tiềm năng lớn trong ngành y học cổ truyền cũng như y học hiện đại

Cây Bình vôi có những hoạt chất có giá trị về dược liệu y học Trong các

củ của Bình vôi có chứa một lượng chất alkaloid rất đa dạng cả về thành phần cấu tạo và hàm lượng (Bảng 1.1) Theo ngành y học, củ của Bình vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa các chứng bệnh mất ngủ, bệnh ho hen, bệnh kiết lỵ, sốt hay đau bụng [14], [15], [56]

Những chất alkaloid trong củ cây bình vôi là alkaloid A (tức là roemerin)

do tác giả Dương Hữu Lợi và Ngô Vân Thu đã thu nhận và làm thử nghiệm tác dụng phong bế và gây tê niêm mạc Tính theo công thức G Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây tê niêm mạc tương đương với dung dịch 1,8% clohydrat cocain Theo thí nghiệm của Nelson và Mak, dung dịch có tác dụng gây tê phong

bế mạnh hơn dung dịch clohydrat cocain 1% và dung dịch novocain 3% [30] Dung dịch alkaloid A có tác dụng đối lập với tác dụng gây tăng trương lực và nhu động co bóp ruột của dung dịch acetylcholin Dung dịch alkaloid A có tác dụng an thần gây ngủ với liều lượng nhẹ nhưng với liều cao kích thích thần kinh

hệ trung ương, gây co giật và chết Ngoài ra, alkaloid A có tác dụng giãn mạch

hạ huyết áp, cả huyết áp tối đa và tối thiểu [15]

Những cây thuộc chi Stephania (họ Menispermaceae) phân bố rộng Hơn

150 hợp chất alkaloid cùng với flavonoids, lignans, steroids, terpenoids và coumarins đã được tách chiết và xác định cấu trúc có hoạt tính sinh học cao [24] Năm 1940, tác giả Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi ở Việt Nam các chất tinh bột, đường khử, malic acid, men oxydase và một alkaloid với tỷ lệ 1,2 đến 1,5% (tính trên củ tươi), được đặt tên là rotundin [15] Rotundin là tinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màu vàng khi

tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Rotundin tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong sulfuric acid loãng Điểm nóng chảy của rotundin ở 141oC đến 144oC Độ hấp thụ (A) của dung dịch chế phẩm có nồng độ 30 g/ml trong dung dịch sulfuric acid 0,5 % ở bước sóng 281

nm từ 150 đến 160 [24]

Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatine (5, 8, 13,

13a-tetrahydro-2, 3, 9, 10-tetramethoxy-6H dibenzo quinolizine, C21H25NO4) Đây là một loại alkaloid, thu được đầu tiên vào năm 1902 nhờ vào phương pháp hydro hóa palmatin Do được tách chiết từ các chi họ khác nhau, mà trước đây hợp chất này còn mang một số tên gọi khác như: caseanin, rotundin và hyndarin Rotundin có tính kiềm yếu, được giải phóng bằng kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, cacbonat kiềm, NaOH… Người ta sử dụng tính chất này để định lượng L- tetrahydropalmatine trong nguyên liệu thực vật hay để tủa trong quá trình chiết alkaloid toàn phần Chất này thường được người ta sử dụng dạng muối clorat hoặc sulfat và bảo quản trong lọ màu hổ phách [24]

Hình 1.3 Công thức hóa học của chất L– tetrahydropalmatine

(Nguồn website: http://nguyenlieuyduoc.com.vn/rotundin-chiet-xuat-cu-binh-voi)

Tác dụng dược lý của rotundin được nghiên cứu trong nước, Trung Quốc

và Liên Xô cũ [15]: (1) Rotundin có rất ít tính độc, tiêm vào tĩnh mạch máu của một con thỏ với liều cao hơn 30 mg/1kg, con thỏ chỉ mệt trong khoảng 2 ngày, đồng tử bị liệt nhất thời rồi lại hết; (2) Tác dụng thần kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng, trên mẩu ruột lấy riêng nó gây hiện tượng giảm khuẩn rõ rệt mà vẫn duy trì sự co bóp điều hòa và kéo dài, có thể dùng để chữa những trường hợp bị tăng nhu động đường tiêu hoá; (3) Tác dụng điều hoà nhịp tim; (4) Tác

dụng điều hoà hô hấp do vậy có thể dùng chữa nấc hoặc chữa hen; (5) Tác dụng của rotundin là chống co quắp, hạ huyết áp và an thần, gây ngủ Trên lâm sàng rotundin được áp dụng điều trị rộng rãi từ năm 1944 và trong suốt kháng chiến chống Pháp [15]

Bảng 1.2 Hoạt tính của một số alkaloid từ những loài cây Bình vôi [14]

Chống sốt rét

Dehydroroemerine, cepharanthine, dicentrinone, tetrahydropalmatine, aloe-emodine, corydine, Nmethylliriodendronine, liriodenine, 2-O, N dimethylliriodendronine

Dl - tetrandrine, fangchinoline, d - tetrandrine,

d - isochondrodendrine, dịch chiết từ củ loài S venosa (Blume)

Spreng, cepharanoline, cepharanthine, aporphine, isotetrandrine

Chống oxy hóa Fangchinoline cepharanthine

Nghiên cứu cơ chế giảm đau của L- tetrahydropalmatine, Mantsch John

đã cho thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, người ta đã ứng

dụng và đã sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ma túy [42] Cây Bình vôi đã được đưa vào một số bài thuốc quý để chữa một số bệnh phổ biến trong dân gian [61]

1.1.4 Vấn đề bảo tồn Bình vôi

Bảo tồn đa dạng sinh học nói chung, các loài thực vật làm thuốc nói riêng, gắn với bảo tồn tri thức bản địa của Việt Nam đã và đang được quan tâm đặc biệt Đề cập đến bảo tồn những loài thực vật quý đang bị đe dọa không có cách nào khác là phải nắm vững về phân bố và tình hình hiện trạng, để thiết lập các khu vực bảo tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển vị (ex - situ) và bảo tồn nội vi hay bảo tồn nguyên vị (in - situ) Vấn đề bảo tồn thực vật dùng làm thuốc ở các quốc gia chính là sự nhận biết và bảo tồn giá trị sử dụng của chúng trong ngành

y học cổ truyền [6]

Theo thống kê số liệu của ngành Y tế những năm trở lại đây cho thấy, mỗi năm đã xuất khẩu gần 10.000 tấn cây dược liệu, với giá trị khoảng trên 15 triệu USD, mỗi năm ở nước ta tiêu thụ gần 50.000 tấn các loại cây dược liệu khác nhau… Ngoài ra còn xuất khẩu một số thành phẩm thuốc dưới dạng hoạt chất hóa học như: berberin, rotundin, palmatine, rutin, palmatine,… Nhiều doanh nghiệp ở nước ta đã xuất khẩu thuốc dạng hoạt chất như: artemisinin, artesunat,… và nhiều loại thuốc đông dược khác [6] Nguồn cây Bình vôi làm dược liệu chủ yếu được khai thác từ tự nhiên Tốc độ khai thác ngày càng gia tăng, cách thức khai thác chủ yếu là khai thác hủy diệt và hầu như không có kế hoạch tái sinh, do đó, sự phân bố và cây Bình vôi trong tự nhiên ngày càng bị thu hẹp và số lượng ngày càng khan hiếm [18]

Trước đây, khi các nhà khoa học khảo sát những cây thuốc ở An Giang thấy rằng, cây Bình vôi là loại cây trồng khá phổ biến tại vùng núi Tô và núi Cấm thuộc hai huyện Tịnh Biên và Tri Tôn nhưng hiện nay là đối tượng cây trồng quý hiếm rất khó tìm thấy trong tự nhiên Vì vậy, khi chỉ có một mình hoặc một nhóm chỉ toàn cây cái, hoặc toàn cây đực thì không thể thụ phấn tạo

hạt được, dẫn đến khả năng duy trì nòi giống có phần bị hạn chế Vì cây Bình vôi là cây có hoa đơn tính khác gốc (cây cái và đực riêng) [4]

Những loài Bình vôi có khu phân bố phân cắt ở các vùng núi đá vôi, nơi sống của nó bị xâm hại do nạn chặt phá rừng Người dân đào rễ cây Bình vôi để làm thuốc dẫn đễn nguy cơ tuyệt chủng rất cao Loài đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam, năm 2007 với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) Loại thực vật quý này đã và đang dần bị cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phá rừng của người dân Việt Nam [1]

Hiện nay có 4 loài Bình vôi được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (1996), Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam (2007) và Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) để khuyến cáo bảo vệ Có tên trong danh mục II.A- Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số

32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) là Bình vôi hoa dài (Stepphania

cambodica Gagnep), Bình vôi hoa đầu (Stepphania cepharantha Hayata), Bình

vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stepphania brachyandra Diels) [1], [22]

Hình 1.4 Bình vôi nhị ngắn

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 258)

Loài Bình vôi núi cao hay Bình vôi nhị ngắn (Stepphania brachyandra

Diels) là loài đặc hữu vùng Nam Trung Quốc- Bắc Việt Nam Ở Việt Nam, bình vôi nhị ngắn phân bố ở huyện Phong Thổ- tỉnh Lai Châu, huyện Sapa và

huyện Bát Xát- tỉnh Lào Cai Đây là loài Bình vôi duy nhất có thể mọc ở vùng núi cao tới 1800m (hoặc hơn), có hàm lượng hoạt chất L- tetrahydropalmatine

cao nhất so với các loài khác trong chi Stephania Loài Bình vôi núi cao đã bị

khai thác nhiều cùng với các loài bình vôi khác để chiết xuất hoạt chất làm thuốc an thần ở trong nước và xuất khẩu qua biên giới Bình vôi núi đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (1996), Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam (1996,

2001 và 2006) nhằm tăng cường quản lý và bảo vệ với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): R

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): EN.A2c,d [22]

Hình 1.5 Bình vôi Cambod

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 259)

Bình vôi hoa dài hay Bình vôi Cambod (Stepphania cambodica Gagnep)

là loài đặc hữu Đông Dương Ở Việt Nam mới chỉ thấy phân bố hạn chế ở một

số tỉnh phía nam Với những tư liệu hiện có và do nạn phá rừng và khai thác

rừng có thể xâm hại tới nơi sống của Bình vôi hoa dài (Stepphania cambodica Gagnep) ở Krông Pách – Đăk lăk nên có thể xếp Bình vôi hoa dài (Stepphania

cambodica Gagnep) vào diện những thực vật làm thuốc bị đe dọa, cần bảo vệ

Loài cây thuốc này đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam, năm 1996, Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam, năm 1996, năm 2001 và năm 2006 để khuyến cáo bảo vệ,

có tên trong danh mục II.A- Hạn chế sử dụng, khai thác vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): R

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): VU.A3c,d [22]

Bình vôi hoa đầu (Stepphania cepharantha Hayata) là cây thuốc đặc

biệt quý hiếm và đang có nguy cơ tuyệt chủng rất cao ở Việt Nam Xét về giá trị sử dụng, đây là loài Bình vôi duy nhất phát hiện thấy có hợp chất cepharatin (có tác dụng chống ung thư) Ở Việt Nam, Bình vôi hoa đầu

(Stepphania cepharantha Hayata) phân bố ở tỉnh Quảng Ninh (huyện Cẩm

phả: Quang Hanh); Hòa Bình (huyện Kỳ Sơn), là loài cực hiếm được đưa vào sách đỏ Việt Nam năm 1996, Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam, năm

1996, năm 2001 và năm 2006 để khuyến cáo bảo vệ Loài có tên trong danh mục II.A- Hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại, trong nghị định số 32/2006/NĐ- CP của chính phủ (30/03/2006) với mức phân hạng như sau:

Sách đỏ Việt Nam (1996): V

Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006): CR.B2a,b(ii,iii,iv,v) [22]

Hình 1.6 Bình vôi hoa đầu

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 261)

Củ dòm hay Bình vôi tím (Stephania dielsiana C.Y.Wu) thường hay mọc

ở những vùng núi đá của các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Hà Sơn

Bình, Hà Nam, rễ cây đã được dùng làm thuốc có tác dụng giải độc, tiêu phù,

an thần, thanh nhiệt và giảm đau được ghi trong Sách đỏ của Việt Nam, năm

1996 ở cấp độ đánh giá sẽ nguy cấp (V) Cây rất hiếm ở Việt Nam và có thể bị tuyệt chủng [22]

Hình 1.7 Bình vôi tím

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam, trang 262)

Do vậy, hướng nghiên cứu của đề tài là sưu tập, định danh mẫu cây Bình vôi thu được thông qua hình thái, cấu tạo giải phẫu cơ thể và DNA barcode

nhằm góp phần vào công tác bảo tồn (in situ, ex situ, in vitro) và khai thác

nguồn gen, dược chất của cây này tại Việt Nam

1.2 Những phương pháp để định danh thực vật

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu

Trong lịch sử phát triển của thực vật học thì giải phẫu cơ thể thực vật, nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật phát triển tương đối sớm (từ những năm 371-286 TCN) [10] Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về vẫn

là quan sát hình thái, so sánh trên cơ sở các dữ kiện thực tế ngoài tự nhiên, sau

đó tiến hành giải phẫu cấu tạo cơ thể thực vật trong phòng thí nghiệm, so sánh cấu tạo của các cơ quan bộ phận như thân, cuống lá, phiến lá của các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, sau phân tích, tổng hợp và rút ra những nhận xét Để phân biệt đặc điểm hình thái các loại tế bào hay thành phần cấu tạo giải phẫu của các loại mô trong cơ quan, các lát cắt được nhuộm màu và tùy theo yêu cầu quan sát mẫu phần nào của cơ thể thực vật mà sẽ nhuộm màu cho phù hợp [20]

Các nhà sinh học đã sử dụng phương pháp so sánh đặc điểm giải phẫu, hình thái cơ thể đối chiếu khóa phân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa học của các mẫu Hà thủ ô đỏ [10], cây Phong lữ thảo

(Pelargonium hortorum L H Bailey) [7], cây Sóng rắn ở tỉnh Thái Nguyên

[25] Đặc biệt trong các nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quỳnh Nga và đtg (2016) đã mô tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa định danh loài cho 8 loài

và 2 thứ thuộc chi Paris ở Việt Nam [43] Phương pháp này cũng có thể được

sử dụng để định danh nhiều loài cây Bình vôi (Stephania spp.)

1.2.2 Phương pháp phân loại phân tử học

1.2.2.1 Mã vạch DNA

Khái niệm về mã vạch DNA đã được nhà bác học Hebert và cộng sự đưa

ra lần đầu tiên vào năm 2003, giúp nhận diện các mẫu sinh vật [44] Mã vạch DNA sử dụng trình tự DNA ngắn nằm trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài với nhau, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau

Đối với những loài thực vật việc lựa chọn định danh bằng mã vạch DNA cần phải quan tâm đến các yếu tố như: (1) khuếch đại PCR mang tính tổng thể, thành công trên nhiều loài thực vật, (2) phạm vi đa dạng phân loại, sử dụng được cho nhiều loài cây khác nhau, (3) có sự sai khác, đặc trưng phân loại các loài cây, (4) sử dụng công cụ hỗ trợ tin sinh học trong phân tích và ứng dụng

[37] Sau khi kiểm tra rộng rãi các vùng gen trong hệ gen của lục lạp, ty thể và

của nhân thì bốn đoạn gen/vùng gen chính là matK, trnH – psbA, ITS và

rbcL được thống nhất là mã vạch DNA [33], [38], [39], [40], [46], [50]

Quá trình tạo mã vạch DNA và áp dụng mã vạch DNA cho mục đích định danh loài thực vật đòi hỏi hai bước cơ bản: (1) xây dựng một thư viện mã vạch DNA của các loài thực vật đã biết; (2) so sánh mã vạch DNA của một mẫu thực vật chưa biết với thư viện mã vạch DNA

1.2.2.2 Nghiên cứu trên thế giới sử dụng mã vạch DNA

Các mã vạch DNA đã được phát triển, thử nghiệm và sử dụng để giải quyết các câu hỏi cơ bản về hệ thống sinh thái, bảo tồn và sinh học tiến hóa bao gồm lắp ráp cộng đồng, khám phá phân loại, mạng lưới tương tác các loài và đánh giá các lĩnh vực bảo vệ môi trường sống

Gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) đã được phát hiện lần đầu tiên

trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys (UUU) trong lục lạp Vùng gen matK gồm 1 đoạn ORF chứa 509 nucleotit nằm trong intron của gen trnK và người ta chưa rõ chức năng Các nhà nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài nhận thấy gen matK có tính đa dạng phong phú hơn những gen khác trong lục lạp và

do vậy vùng gen matK trở thành vùng gen chỉ thị phân tử quan trọng để giúp

định danh các loài thực vật [48]

Nhóm nghiên cứu của Savolainen và các cộng sự (năm 2005) sử dụng

vùng gen matK để nhận dạng được 1600 loài Lan khác nhau Trong quá trình

thực hiện, họ phát hiện một loài trước đây được cho là Lan, thực ra lại là hai loài tách biệt nhau Những loài này, chúng sống trên những dốc núi khác nhau

và có hình dạng hoa khác nhau để thích nghi với những loài côn trùng thụ phấn khác nhau [46]

Vùng gen matK thường được sử dụng trong vào việc định danh loài thực

vật, để phân loại ở các loài cây có hoa hạt kín, là những loài cây chiếm đa số

trong các hệ sinh thái hiện nay Layhaye và các cộng sự (năm 2008) đã lựa

chọn gen matK là một mã vạch ưa thích trong phân loại thực vật Những nghiên cứu của Lahaye và đtg (2008) đã chỉ ra rằng mã vạch DNA của thực vật có thể

được sử dụng để đánh giá nhận dạng nhiều loài trong các điểm nóng đa dạng sinh học giúp bảo tồn cũng như áp dụng giả thuyết để giám sát thương mại quốc tế trong các loài Lan đang bị đe dọa tuyệt chủng [39]

Vùng gen ITS (Internal Transcribed Spacer) là locus gen được giải mã

phổ biến nhất hiện nay Vùng gen ITS có hiệu quả cao trong nghiên cứu định

danh nhiều loài thực vật và nấm (ngoại trừ dương xỉ) và đây là một locus gen được sử dụng đọc trình tự nucleotide với DNA ngắn [49] Ở mức độ định danh

loài, vùng gen ITS có mức độ đa dạng phong phú cao (khoảng 13,6% giữa các

loài có quan hệ gần gũi) và được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu

Thuận lợi của vùng gen ITS là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và

ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu

bị hư hại Vùng ITS cũng đã được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên

trong các loài [32]

Vùng gen ITS là đoạn đệm nó nằm giữa gen mã hóa rRNA của tiểu

phần nhỏ và tiểu phần lớn ribosome (vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2

(hình 1.8) [63]

Hình 1.8 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS

(Nguồn website: https://www.researchgate.net/profile/Estela-Aguilar)

Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp

ra rRNA Tuy vậy, trong quá trình trưởng thành của phân tử rRNA, phần vùng

gen ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy Một lợi thế của vùng gen ITS là nó bao gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5,8S

Bảng 1.3 Những nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong

định danh các loài thực vật

Đối tượng phân loại Cấp độ

phân loại Năm Tài liệu tham khảo

Phân tông Saccharinae

Chi Plantago (Plantaginaceae) Loài 2002 John Kress và đtg [37]

Chi Tsuga (Pinaceae) Loài 2008 Havill và đtg [35]

Chi Erica (Ericaceae) Loài 2011 Pririe và đtg [ 45]

Chi Scrophularia

(Scrophulariacea) Loài 2014 Scheunert và đtg [47] Chi Potamogeton

(Potamogetonaceae) Loài 2016 Yang và đtg [52]

Vùng gen ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và phát sinh di truyền của các loài như trình tự vùng ITS mang các đặc điểm di

truyền của cả mẹ và bố, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch đại và xác định trình tự DNA ribosome Trình tự nucleotide vùng gen

ITS đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen của thế giới rất phong

phú và đa dạng, thuận lợi cho việc phân tích so sánh giữa các loài thực vật

Vùng gen ITS được chứng minh đặc biệt hữu ích trong việc làm sáng tỏ mối

quan hệ giữa các loài trong bảng 1.3

Một ví dụ về sự khác biệt giữa Schisandra chinensis - Ngũ vị tử bắc với các loài khác trong chi Schisandra Li và đtg (2013) đã thấy sự sai khác tại vị trí 86 bp trên vùng gen ITS, quan sát thấy C thay thế cho A trong các quần thể

hoang dã khi so sánh với quần thể người dân trồng Vùng ITS2 còn phân biệt rõ ràng Schisandra chinensis với Schisandra sphenanthera [40]

Một nghiên cứu khác nhằm xác định chi Hoàng kỳ (Astragalus) gồm

nhiều loài có sự tương đồng về hình thái Trong nghiên cứu của Gao và đtg

(2009), bốn gen mã hóa (trnH-psbA, rpoC1, rbcL, matK) và hai vùng gen không mã hóa (ITS, ITS2) được so sánh giữa 319 loài Mã vạch ITS2 và ITS có

hiệu quả cao hơn đối với việc phân biệt loài [34]

1.2.2.3 Những nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA ở Việt Nam

Việt Nam cũng đã bắt kịp xu hướng khi sử dụng mã vạch DNA vào công cuộc giám định thực vật phục vụ cho bảo tồn nguồn gen các loài thực vật quý hiếm Những năm gần đây các công trình nghiên cứu sử dụng các đoạn gen/vùng gen làm mã vạch DNA trong việc phân tích quan hệ di truyền, phân loại thực vật ngày càng phổ biến

Vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân của ba loài gỗ quý Trắc (D

cochinchinensis), Cẩm lai (D oliveri) và Sưa (D tonkinensis) ở Việt Nam và

bổ sung cho Ngân hàng trình tự DNA gen quốc tế Qua việc phân tích quan hệ

di truyền sử dụng trình tự ITS cho thấy: Sưa (D tonkinensis) có họ hàng gần nhất với D sisso và nằm trong một nhóm lớn với các loài D frutescens, D decipularis, D

brasiliensis và D congestiflora Loài Trắc (D cochinchinensis) có mối quan hệ họ

hàng gần nhất với Cẩm lai (D oliveri) công trình này do Dương Văn Tăng và

đtg đã phân lập và xác định trình tự đầy đủ, năm 2011 [21]

Năm 2014, Nguyễn Thị Phương Trang và đtg đã sử dụng kết hợp ba

vùng gen lục lạp rbcL, matK, trnH-psbA để nghiên cứu trình tự nucleotide của ba loài Sao (Hopea) đang có nguy cơ bị tuyệt chủng ở Việt Nam gồm Sao Hòn Gai (Hopea chinensis), Sao Hải Nam (H hainanensis) và Sao Mặt Quỷ (H

mollissima) Mức độ khác biệt di truyền rất thấp từ 0,2 đến 0,6 giữa các cặp loài

nghiên cứu, dùng để nhận biết và so sánh với các loài khác trên thế giới [26]

Phan Kế long và đtg (2014) cũng sử dụng kết hợp hai vùng gen matK và

ITS trong việc phân tích trình tự nucleotide hai vùng gen để nghiên cứu mối

quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châu Kết quả nghiên cứu đã giải

mã được 1485 nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen

ITS-rDNA cho tổng số 17 cá thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai Châu

(P vietnamensis var fuscidiscus) và Tam thất trắng (P stipuleanatus) Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA chỉ ra các loài Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa Hai thứ sâm ở tỉnh Lai Châu (P

vietnamensis var fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P vietnamensis Ha &

Grushv var vietnamensis) của loài sâm Việt (P vietnamensis Ha & Grushv.)

có quan hệ chị em [13]

Trong nghiên cứu của Nguyễn Văn Phong và Hà Văn Huân (2015) đã

xác định đoạn mã vạch DNA của Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia

tamdaoensis) Đoạn gen matK được nhân bản thành công và xác định trình

tự nucleotide với kích thước 951 bp Trình tự nucleotide của vùng gen matK

xác định được từ cây Trà hoa vàng Tam Đảo đã được đăng kí ở ngân hàng gen quốc tế (NCBI) có mã số KP241692 [9]

Vùng gen rpoC1 (RNA polymerase beta' subunit) được Lý Thị Bôn và

đtg, năm 2017 nghiên cứu sử dụng làm mã vạch DNA trong định danh loài

thực vật Hồng trâu (Capparis versicolor Griff.) Bằng kỹ thuật PCR, vùng gen

rpoC1 đã được phân lập thành công từ DNA của lục lạp có kích thước 527

nucleotide, mã hóa 175 phân tử amino acid Từ kết quả phân tích và so sánh

trình tự nucleotide DNA vùng gen rpoC1 có thể xác định chính xác mẫu nghiên cứu thuộc chi Capparis, và tạm thời xác định thuộc loài Capparis versicolor

Griff [2]

Năm 2017, Nguyễn Thị Hồng Mai và đtg đã nghiên cứu đặc điểm vùng

gen rpoC của loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis Pierre) và Sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis Prain) ở Việt Nam và ứng dụng phân loại Chỉ số tương

đồng của vùng gen rpoC từ 2 mẫu nghiên cứu với trình tự tương đồng từ hai loài Dalbergia cochinchinensis và Dalbergia tonkinensis tham khảo là 99% Kết quả công trình nghiên cứu bước đầu cho thấy vùng gen rpoC có khả năng dùng trong định danh các loài của chi Sưa (Dalbergia) Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai loài Dalbergia tonkinensis và Dalbergia cochinchinensis của Việt Nam

được đăng ký tại GenBank có mã số lần lượt là KY287755 và KY287750 [16]