Đang tải... (xem toàn văn)
Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vôi .... Kết quả nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, hình thái mẫu cây Bình vôi tím .... Đặc điểm hình thái mẫu cây Bình vôi tím
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– NGUYỄN VĂN TÙNG ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VÔI TÍM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÌNH THÁI SO SÁNH KẾT HỢP VỚI MÃ VẠCH ITS, matK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2023 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– NGUYỄN VĂN TÙNG ĐỊNH DANH MẪU CÂY BÌNH VÔI TÍM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÌNH THÁI SO SÁNH KẾT HỢP VỚI MÃ VẠCH ITS, matK Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Phạm Thị Thanh Nhàn 2 TS Từ Quang Trung THÁI NGUYÊN - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Thị Thanh Nhàn và TS Từ Quang Trung Các kết quả nghiên cứu là trung thực chưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác Xác nhận đại diện Thái Nguyên, tháng 6 năm 2023 của người hướng dẫn khoa học Tác giả Nguyễn Văn Tùng i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Nhàn và TS Từ Quang Trung, khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã chỉ bảo, hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinh học, bộ môn Di truyền học & CNSH, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT Thuận Thành số 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian học tập Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em Thái Nguyên, tháng 6 năm 2023 Tác giả Nguyễn Văn Tùng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 1 Lý do chọn đề tài 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Nội dung nghiên cứu 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3 1.1 Các loài cây Bình vôi 3 1.1.1 Vị trí của loài cây Bình vôi tím trong hệ thống phân loại 3 1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bình vôi 4 1.1.3 Giá trị y học của cây Bình vôi 8 1.1.4 Vấn đề bảo tồn Bình vôi 11 1.2 Những phương pháp để định danh thực vật 15 1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu .15 1.2.2 Phương pháp phân loại phân tử học 16 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ VẬT LIỆU 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Vật liệu là thực vật 23 2.1.2 Vật liệu nhân đoạn gen ITS và vùng gen matK 23 2.1.3 Thiết bị và hóa chất 23 2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 iii 2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu mẫu cây Bình vôi 24 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 24 2.2.3 Phương pháp PCR 26 2.2.4 Phương pháp xác định trình tự nucleotid 26 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, hình thái mẫu cây Bình vôi tím 27 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu cây Bình vôi tím nghiên cứu 27 3.1.2 Đặc điểm giải phẫu mẫu cây Bình vôi tím nghiên cứu 29 3.2 Kết quả định danh mẫu cây Bình vôi tím bằng DNA barcode 31 3.2.1 Kết quả tách chiết và khuếch đại đoạn gen matK và vùng ITS 31 3.2.2 Đặc điểm trình tự đoạn gen matK 32 3.2.3 Đặc điểm trình tự vùng gen ITS 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .42 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Nghĩa Tiếng Việt Công cụ tìm kiếm trình tự BLAST Basic Local Aligment Search Tool tương đồng DNA Deoxyribonucleic acid Đồng tác giả Đtg Internal Transcribed Spacer Vùng nội phiên mã trên ITS gene mã hóa RNA ribosome kb Kilobase, 1 kb = 1000 bp Gene mã hóa enzyme matK Maturase K maturase K trong lục lạp Trung tâm Thông tin Công NCBI The National Center for nghệ sinh học Quốc gia (Mỹ) Biotechnology Information Phản ứng tổng hợp DNA PCR Polymerase Chain Reaction Gene mã hóa chuỗi β' RNA rpoC1 RNA polymerase β' subunit polymerase iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm đặc trưng về hình thái của một số loài Bình vôi 5 Bảng 1.2 Hoạt tính của một số alkaloid từ những loài cây Bình vôi 10 Bảng 1.3 Những nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong định danh các loài thực vật 19 Bảng 2.1 Trình tự của mồi vùng gen ITS và vùng gen 23 Bảng 3.1 Kết quả BLAST trình tự đoạn gen matK của chi Stepphania 33 Bảng 3.2 Đa hình nucleotide (SNP) của đoạn gen matK 34 Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền về trình tự nucleotide của các đoạn gen matK 35 Bảng 3.4 Kết quả BLAST trình tự vùng ITS của cây Bình vôi tím 37 Bảng 3.5 Đa hình nucleotide (SNP) của vùng gen ITS 38 Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền về trình tự nucleotide của các vùng gen ITS 39 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan cây Bình vôi tím 6 Hình 1.2 Hạt cây bình vôi 7 Hình 1.3 Công thức hóa học của chất L– tetrahydropalmatine 9 Hình 1.4 Bình vôi nhị ngắn 12 Hình 1.5 Bình vôi Cambod 13 Hình 1.6 Bình vôi hoa đầu 14 Hình 1.7 Bình vôi tím 15 Hình 1.8 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS 18 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái một số phận của mẫu cây Bình vôi tím 27 Hình 3.2 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu thân mẫu cây Bình vôi tím 29 Hình 3.3 Hình ảnh giải phẫu lá tẩy diệp lục của mẫu Bình vôi tím 30 Hình 3.4 Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu Bình vôi tím 30 Hình 3.5 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu mặt cắt ngang phiến lá cây Bình vôi tím 31 Hình 3.6 Hình ảnh cấu tạo giải phẫu mặt cắt tiêu bản cuống lá cây Bình vôi tím 31 Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số 32 Hình 3.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩn PCR 32 Hình 3.9 Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vôi dựa vào trình tự đoạn gen matK 36 Hình 3.10 Hình ảnh cây phân loại mẫu cây Bình vôi tím dựa vào trình tự vùng gen ITS 40 vi MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài Cây Bình vôi tím có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae), là một loài dây leo, phần rễ phát tiển thành củ to, bám vào núi đá Cây có tại tỉnh Hòa Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Trong ngành y học cổ truyền thì cây Bình vôi là loại cây dược liệu có vị dắng, tính lương, được quy vào hai kinh là Tỳ và Can có tác dụng chính là trấn kinh, an thần, tuyên phế Trong y học hiện đại, cây Bình vôi có chứa rất nhiều alkaloid có tác dụng an thần, ổn định huyển áp, chống co giật và chữa nhức đầu, sốt nóng… Ở Việt Nam, có khoảng 14 – 16 loài cây thuộc chi Bình vôi (Stephania), như loài Bình vôi vàng (Stepphania rotunada Lour), Bình vôi tím, Bình vôi hoa đầu (Stephania cephanntha Hayata), Thiên kim đẳng (Stephania japonica Miers), … Các loài cây Bình vôi được khai thác có hàm lượng rotundin tùy thuộc vào điều kiện sinh thái và từng loài cây Hiện nay, các loài Bình vôi này đã được ghi vào Sách đỏ của Việt Nam, năm 1996 ở mức độ đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) Tuy vậy, việc định danh loài có thể gặp khó khăn đã ảnh hưởng đến công tác bảo tồn nguồn gen của các loài cây này Các phương pháp định danh loài trước đây thường dùng như so sánh các đặc điểm về hình thái, cấu tạo giải phẫu, đặc điểm sinh lý, hóa sinh… Với hướng nghiên cứu trên đã có thành công trên nhiều đối tượng thực vật như Song rắn, Phong lữ thảo, Hà thủ ô đỏ,… Tuy vậy, các phương pháp định danh này sẽ kém hiệu quả nếu như các cây cần định danh không còn nguyên vẹn, giống nhau về đặc điểm hình thái, giải phẫu giữa các loài thân thuộc Công nghệ sinh học hiện đại đã bổ sung vào hệ thống định danh thực vật một phương pháp định danh mới là dựa vào chỉ thị sinh học phân tử Trong đó, mã vạch DNA đã được chọn là một trong các phương tiện định danh mới nhất hiện nay Một số mã vạch DNA được ứng dụng và nghiên cứu hiệu quả trong định danh nhiều loài thực vật làm nguyên liệu trong y học cổ truyền như: 1