Hỗ trợ định danh trên một số loài cantharellus bằng phương pháp phân tích phát sinh loài đa gene đề tài nghiên cứu khoa học

Nghiên cứu khoa học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: HỖ TRỢ ĐỊNH DANH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CANTHARELLUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT SINH LỒI ĐA GENE - Sinh viên thực hiện: Sinh viên thực 1: K’TRỌNG NGHĨA Lớp: DH15YD01 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: Năm thứ: Số năm đào tạo: Sinh viên thực 2: NGÔ VĂN TÀI Lớp: DH15YD01 Khoa: CNSH Sinh viên thực 3: NGUYỄN THỊ QUỲNH ANH Lớp: DH15YD01 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: Sinh viên thực 4: NGUYỄN THANH NGÀ Lớp: DH16YD01 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: Sinh viên thực 5: NGUYỄN THANH TÙNG Lớp: DH17SH01 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: Giảng viên hướng dẫn: ThS LAO ĐỨC THUẬN ThS VŨ TIẾN LUYỆN Mục tiêu đề tài: Xây dựng sỡ dự liệu cục giúp hỗ trợ cho việc phân loại phát sinh loài cho loài thuộc chi Cantharellus Đà Lạt mở rộng cho chi nấm liên quan Việt Nam Nghiên cứu khoa học Thiết lập quy trình tối ưu quy trình tách chiết khuếch đại trình tự gene ITS, nrLSU, nrSSU cho nấm thuộc chi Cantharellus Phân tích đánh giá mối quan hệ phát sinh loài loài Cantharellus phát sinh loài đơn gene đa gene qua gene ITS, nrLSU, nrSSU dựa vào kết nghiên cứu Buyck et al., (2013) Đồng thời cách phân loại hổ trợ định danh số lồi nấm thu từ rừng thơng Đà Lạt, Lâm Đồng Tính sáng tạo Hiện tại, Việt Nam nghiên cứu định danh phân tử loài nấm Cantharellus chưa phổ biến, cần bổ sung để hoàn thiện liệu NCBI, nên với nghiên cứu này, qua việc phát số mẫu vật vùng núi Labiang, Lâm Đồng, Đà Lạt tiến hành định danh mẫu vật thu kỹ thuật sinh học phân tử, qua thiết lập bảng liệu cục dựng phả hệ phân tử để góp phần hỗ trợ xây dựng hệ thống phân loại nấm Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu Các hội nghị khoa học tham gia: Ngày … tháng … năm … Sinh viên chịu trách nhiệm Thực đề tài (ký ghi rõ họ tên) ………………………… Nghiên cứu khoa học Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài: Ngày … tháng … năm … Xác nhận đơn vị Người hướng dẫn (ký tên đóng dấu) (ký ghi rõ họ tên) …………………………… ……………………… Người hướng dẫn (ký ghi rõ họ tên) ………………………… Nghiên cứu khoa học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN Họ tên: K’TRỌNG NGHĨA Ngày sinh: 13/08/1997 Nơi sinh: Lâm Đồng Lớp: DH15YD01 Khóa: 2015-2019 Khoa: Cơng Nghệ Sinh Học Địa liên hệ: 178/90b Huỳnh Văn Lũy, P.Phú Lợi, Tp.Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương Điện thoại: 0375373717 Email: newseed97@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP  Năm thứ Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: TB Khá  Năm thứ Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: TB Khá  Năm thứ Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: TB Khá Khoa: Công Nghệ Sinh Học Nghiên cứu khoa học Năm thứ Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: … Ngày … tháng … năm … Xác nhận đơn vị Sinh viên chịu trách nhiệm (ký tên đóng dấu) thực đề tài (ký ghi rõ họ tên) ……………………………… ………………………………… Nghiên cứu khoa học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình biểu diễn tổng số lồi thuộc chi Cantharellus cơng bố theo nguồn thống kê eElurikkus Hình 1.2 Nấm Cantharellus cibarius ngồi tự nhiên Hình 1.3 Hình biểu diễn hệ thống cấu trúc vùng gene ITS Hình 1.4 Hình biểu diễn hệ thống cấu trúc vùng gene nrLSU Hình 1.5 Cấu trúc hóa học Canthaxanthin (C40H52O2) Hình 2.1 Tiến trình nghiên cứu Hình 3.1.1 Kết gióng cột mồi xi ITS1 với trình tự gen ITS Hình 3.1.2 Kết gióng cột mồi ngược ITS4 với trình tự gen ITS Hình 3.1.3 Kết Annhyb cặp mồi ITS1 trình tự gen ITS Hình 3.1.4 Kết Annhyb cặp mồi ITS4 trình tự gen ITS Hình 3.1.5 Kết BLAST cặp mồi ITS1/ITS4 khuếch đại gen ITS Hình 3.1.6 Kết BLAST cặp mồi ITS1/ITS4 khuếch đại gen ITS Hình 3.1.7 Kết gióng cột mồi xi NS1 với trình tự gen nrSSU Hình 3.1.8 Kết gióng cột mồi ngược NS4 với trình tự gen nrSSU Hình 3.1.9 Kết Annhyb cặp mồi NS1 trình tự gen nrSSU Hình 3.1.10 Kết Annhyb cặp mồi NS4 trình tự gen nrSSU Hình 3.1.11 Kết BLAST cặp mồi NS1/NS4 khuếch đại gen nrSSU Hình 3.1.12 Kết BLAST cặp mồi NS1/NS4 khuếch đại gen nrSSU Hình 3.1.13 Kết gióng cột mồi xi LR0R với trình tự gen nrLSU Hình 3.1.14 Kết gióng cột mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU Hình 3.1.15 Kết Annhyb cặp mồi LR0R trình tự gen nrLSU Hình 3.1.16 Kết Annhyb cặp mồi LR5 trình tự gen nrLSU Hình 3.1.17 Kết BLAST cặp mồi LR0R/LR5 khuếch đại gen nrLSU Hình 3.1.18 Kết BLAST cặp mồi LR0R/LR5 khuếch đại gen nrLSU Hình 3.2.1 Kết sản phẩm PCR gene nrSSU, nrLSU, ITS tách chiết theo phương pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol CTAB Hình 3.3.1 Hiệu chỉnh tín hiệu nhiễu đầu mạch xi nrLSU Nghiên cứu khoa học Hình 3.3.2 Vị trí sai lệch hai kết giải trình tự đầu mạch xi nrLSU Hình 3.3.3 Hiệu chỉnh vùng mạch gen nrLSU Hình 3.3.4 Hiệu chỉnh vùng mạch gen nrLSU Hình 3.3.5 Hiệu chỉnh vùng mạch gen nrLSU Hình 3.3.6 Kết BLAST trình tự gen nrLSU mạch xi hiệu chỉnh mẫu C002 Hình 3.4.1 Cây phả hệ phân tử xây dựng loài khảo sát phương pháp biểu diễn NJ/ML/MP vùng gene 5.8S-ITS2 (Các số hiển thị giá trị bootstrap ≥50, phân nhánh ủng hộ thông qua giá trị bootstrap với nhau) Hình 3.4.2 Cây phả hệ phân tử xây dựng loài khảo sát phương pháp biểu diễn NJ/ML/MP vùng gene nrLSU (Các số hiển thị giá trị bootstrap ≥50, phân nhánh ủng hộ thơng qua giá trị bootstrap với nhau) Hình 3.4.3 Cây phả hệ phân tử xây dựng 29 loài khảo sát phương pháp biểu diễn NJ/ML/MP vùng gene nrSSU (Các số hiển thị giá trị bootstrap ≥50, phân nhánh ủng hộ thông qua giá trị bootstrap với nhau) Hình 3.4.4 Cây phả hệ phân tử xây dựng 29 loài khảo sát phương pháp biểu diễn NJ/ML/MP vùng gene nrSSU-nrLSU (Các số hiển thị giá trị bootstrap ≥50, phân nhánh ủng hộ thông qua giá trị bootstrap với nhau) Hình 3.4.5 Cây phả hệ phân tử xây dựng 29 loài khảo sát phương pháp biểu diễn NJ/ML/MP vùng gene nrLSU-ITS (Các số hiển thị giá trị bootstrap ≥50, phân nhánh ủng hộ thơng qua giá trị bootstrap với nhau) Hình 3.4.6 Các ký tự phân loại đặc điểm hình thái (màu sắc) thực vật cộng sinh biểu diễn Maximum likelihood suy từ liệu trình tự ITS2 - nrLSU Nghiên cứu khoa học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng mồi sử dụng thực nghiệm Bảng 3.1 Thơng tin trình tự thông số vật lý đánh giá cặp mồi nhằm khuếch đại vùng gene Bảng 3.2 Hiệu chỉnh vị trí sai lệch hai kết giải trình tự đầu mạch xuôi nrLSU Bảng 3.2.1 Kết kiểm tra DNA quang phổ kế khảo sát mẫu nấm ký sinh côn trùng tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform Bảng 3.3 Tổng hợp kết hiệu chỉnh trình tự mẫu nấm Cantharellus Bảng 3.4 Kết chiều dài trình tự trước sau hiệu chỉnh Bảng 3.5 Danh mục thơng tin trình tự vùng gene ITS2 nrLSU Bảng 3.6 Danh mục thơng tin trình tự vùng gene ITS2 nrLSU Bảng 3.7 Kết đồng khối liệu dựng phát sinh loài Bảng 3.8 Kết đồng khối liệu dựng phát sinh loài Bảng 3.9 Tổng hợp kết định danh mẫu nấm từ liệu phân tử đơn gen Bảng 3.10 Tổng hợp kết định danh mẫu nấm từ liệu phân tử đa gen Bảng 3.11 Tổng hợp kết định danh hình thái định danh phân tử Nghiên cứu khoa học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AIC Akaike Information Content BIC Bayesian Information Content BLAST Basic Local Alignment Search Tool BP Base-Pair C Cantharellus Cr Craterellus CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GTR General time reverible model ITS Internal Transcribed Spacer ML Maximum Likelihood MP Maximum parsimony NCBI National Center for Biotechnology Information NJ Neighber-Joining Nu Nucleotide PCR Polymerase Chain Reaction rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate SSU Small subunit ribosomal RNA TEF-1α The Elongation Factor alpha nrLSU Nuclear Large Subunit Ribosomal RNA UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean Nghiên cứu khoa học MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung thành phần loài họ Cantharellaceae 1.2 Giới thiệu chung chi nấm Cantharellus 11 1.3 Đặc điểm phân bố chi nấm Cantharellus 12 1.3.1 Phương pháp phân loại cổ điển 16 1.3.2 Phương pháp phân loại dựa phân tử 18 1.3.2.1 Internal transcribed spacers (ITS) 19 1.3.2.2 Nuclear Large Subunit Ribosomal RNA (LSU) 22 1.3.2.3 Small subunit ribosomal RNA (nrSSU, 18S ribosomal RNA) 23 1.3.3 Phương pháp giải trình tự 24 1.3.4 Gía trị dinh dưỡng chi nấm Cantharellus 25 1.3.4.1 Cacbohydrades 26 1.3.4.2 Protein Amino acid 26 1.3.4.3 Acid béo 28 1.3.4.4 Hoạt tính độc tố hợp chất thứ cấp 28 1.3.4.5 Carotenoids 30 1.3.4.6 Vitamins 31 1.3.5 Phả hệ phân tử 32 1.3.5.1 Phả hệ phân tử nghiên cứu phát sinh loài 32 1.3.5.2 Những bước nghiên cứu phát sinh chủng loài 33 1.3.5.3 Sắp gióng cột 33 1.3.5.4 Phương pháp phân tích phân sinh loài đa gene 37 1.3.6 Tình hình nghiên cứu nước 40 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 42 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Bộ mẫu nấm Cantharellus 42 2.2.2 Dung cụ - thiết bị - hóa chất 42 2.2.3 Thiết bị 42 2.2.4 Hóa chất 43 2.3 Danh mục phần mền sử dụng 44 2.4 Tiến trình nghiên cứu 45 Nghiên cứu khoa học similar classification accuracies influenced by database composition Applied and Environmental Microbiology, 80(3), 829-840 Potter R M.(2008), ‘Constructing Phylogenetic Trees using Multiple Sequence Alignment’, University of Washington Redhead, S.A., 1979 A study of the sphagnicolous fleshy Basidiomycetes in the eastern sections of the Canadian boreal forest Toronto, ON: University of Toronto 495 p., Ph.D dissertation Redhead, S.A., Norvell, L., Danell, E., 1997 Cantharellus formosus and the Pacific golden chanterelle harvest in western North America Mycotaxon 65: 285– 322 Redman, R.S., Ranson, J., Rodriguez, R.J., 2006 Genetic structure of Cantharellus formosus populations in a second-growth temperate rain forest of the Pacific Northwest Pacific Northwest Fungi 1(7): 1-13 Rehner, S A., & Samuels, G J (1995) Molecular systematics of the Hypocreales: a teleomorph gene phylogeny and the status of their anamorphs Canadian Journal of Botany, 73(S1), 816-823 Rizzo J., Rouchka E C.(2007), ‘Review of Phylogenetic Tree Construction’, University of Louisville Bioinformatics Laboratory Techical Report Rouchka E C., Rudraraju Y L., ‘MPrime-DEG: Multiple Degenerate Primer Design for Amplifying Homologous Sequences’, Vol 34 Rozen, S & Skaletsky, H In Bioinformatics methods and protocols (eds Misener, S & Krawetz, S A.) Ch 20, 365–386 (Springer, 1999) Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA, Chen W, Fungal Barcoding Consortium (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi Proc Natl Acad Sci USA 109:6241–6246 doi:10.1073/pnas.1117018109 Schoch, C L., Seifert, K A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J L., Levesque, C A., & Miller, A N (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(16), 6241-6246 107 | 109 Nghiên cứu khoa học Shao SC, Buyck B, Hofstetter V, Tian XF, Geng YH, Yu FQ, Liu PG (2014) Cantharellus hygrophorus, a new species in subgenus Afrocantharellus from tropical southwestern China Cryptogam Mycol 35:283–291 Shao S-C, Liu P-G, Tian X-F, Buyck B, Geng Y-H(2016) Anewspecies of Cantharellus (Cantharellales, Basidiomycota, Fungi) from subalpine forest in Yunnan, China Phytotaxa 252(4):273–279 Singer, R (1986) The Agaricales in Modern Taxonomy 4th ed Koeltz Scientific Books : Koenigstein, Germany Smith, A.H., 1968 The Cantharellaceae of Michigan Michigan Botanist 7: 143–183 Smith, A.H., Morse, E.E., 1947 The genus Cantharellus in the Western United States Mycologia 39: 497-534 Smith, A.H., Morse, E.E., 1947 The genus Cantharellus in the Western United States Mycologia 39: 497-534 Smith, S.E., Read, D.J., 1997 Mycorrhizal symbiosis London: Academic Press 605 p Taylor JW, Jacobson DJ, Kroken S, Kasuga T, Geiser DM, Hibbett DS, Fisher MC (2000) Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi Fung Gen Biol 31:21–32 Trudell, S.; Ammirati, J (2009) Mushrooms of the Pacific Northwest Timber Press Field Guides Portland, Oregon: Timber Press p 45 Vilgalys, R., & Hester, M (1990) Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species Journal of bacteriology, 172(8), 4238-4246 Wahid, M., Sattar, A., Khan, S., 1998 Composition of wild and cultivated mushrooms of Pakistan Mushroom Journal for the Tropics 8: 47–51 Watling, R., Turnbull, E., 1998 Cantharellaceae, Gomphaceae and amyloidspored and xeruloid members of Tricholomataceae (excl Mycena) In: Henderson, D.M.; Orton, P.D.; Watling, R., eds British fungus flora: Agarics and Boleti Edinburgh, United Kingdom: Royal Botanic Garden Vol 8, 190 p 108 | 109 Nghiên cứu khoa học White, T J., Bruns, T., Lee, S & Taylor, J Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR protocols: a guide to methods and applications 18, 315–322 (1990) Wood, Michael; Stevens, Fred "California Fungi—Cantharellus subalbidus" mykoweb.com Retrieved 14 September 2010 Zambino, P.J., Szabo, L.J., 1993 Phylogenetic relationships of selected cereal and grass rusts based on rDNA sequence analysis Mycologia 85: 401–441 Zhou W G., H.-Y LV, Zhou C G.(2004),’A Discrete Particle Swarm Optimization Algorithm for Phylogenetic Tree Reconstruction’, pp 2650-2654 109 | 109 Nghiên cứu khoa học PHỤ LỤC 110 | 109 Nghiên cứu khoa học PHỤ LỤC Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Neighbor Joining dựa gen ITS2 111 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử duợc xây dựng phương pháp Maximum likelihood dựa gen ITS2 112 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Maximum Parsimony dựa gen ITS2 113 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Neighbor Joining dựa gen nrLSU 114 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử duợc xây dựng phương pháp Maximum likelihood dựa gen nrLSU 115 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Maximum Parsimony dựa gen nrSSU 116 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Neighbor Joining dựa gen nrSSU Cây phả hệ phân tử duợc xây dựng phương pháp Maximum likelihood dựa gen nrSSU 117 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Maximum Parsimony dựa gen nrSSU Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Neighbor Joining dựa gen nrSSU-nrLSU 118 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử duợc xây dựng phương pháp Maximum likelihood dựa gen nrSSU-nrLSU Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Maximum Parsimony dựa gen nrSSU-nrLSU 119 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử xây dựng phương pháp Neighbor Joining dựa gen nrLSU-ITS2 120 | 109 Nghiên cứu khoa học Cây phả hệ phân tử duợc xây dựng phương pháp Maximum likelihood dựa gen nrLSU-ITS2 121 | 109 ... Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: TB Khá  Năm thứ Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: TB Khá Khoa: Công Nghệ Sinh Học Nghiên cứu khoa học. .. phát sinh loài số lần lặp lại giả định liệu Kết phân tích bootstrap thường số số liên quan đến ngành cụ thể phát sinh loài, cung cấp tỷ lệ bootstrap để hỗ trợ định danh đơn ngành nhánh phát sinh. .. 1.3.5.4 Phương pháp phân tích phân sinh lồi đa gene Một số nghiên cứu phát sinh loài dựa ribosomeDNA (Artjariyasripong et al 2001, Sung et al., 2001, Stensrud et al., 2005) giải hỗ 37 | 109 Nghiên cứu