Hỗ trợ định danh các loài nấm thuộc chi nấm kí sinh côn trùng dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ phân tử và cấu trúc bậc hai của vùng trình tự its1 5 7s its2 nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LỒI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CƠN TRÙNG DỰA TRÊN CƠ SỞ DỮ LIỆU PHẢ HỆ PHÂN TỬ VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI CỦA VÙNG TRÌNH TỰ ITS1-5.8S-ITS2 Thuộc nhóm nghành khoa học: Sinh Học Phân Tử Tp.Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN CƠ SỞ DỮ LIỆU PHẢ HỆ PHÂN TỬ VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI CỦA VÙNG TRÌNH TỰ ITS1-5.8S-ITS2 Thuộc nhóm nghành khoa học: Sinh Học Phân Tử Sinh viện thực hiện: Đỗ Ngọc Nam Giới tính: Nam Dân tộc: Kinh Lớp: SH09A3, Cơng Nghệ Sinh Học Năm thứ 4/ Số năm đào tạo: năm Nghành học: Công Nghệ Sinh Học Người hướng dẫn: PGS TS Lê Huyền Ái Thuý Tp.Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ tên: Đỗ Ngọc Nam Sinh ngày: 14 tháng năm 1991 08 Nơi sinh: Krong Pak – Dak Lak Lớp: SH09A3 Khóa: 2009 - 2013 Khoa: Công Nghệ Sinh Học Địa liên hệ: Điện thoại: 01667580705 Email: ngocnam0707@yahoo.com.vn II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP: * Năm thứ 1: Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Trung Bình Khá Sơ lược thành tích: * Năm thứ 2: Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Trung Bình Khá Sơ lược thành tích: Khoa: Cơng Nghệ Sinh Học * Năm thứ 3: Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: * Năm thứ 4: Ngành học: Cơng Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: Ngày Xác nhận đơn vị (ký tên đóng dấu) tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Sinh viên thực hiện: Đỗ Ngọc Nam Nam, Nữ: Nam - Dân tộc: Kinh - Lớp, khoa: Khóa 2009-Khoa CNSH Năm thứ: /Số năm đào tạo:4 - Ngành học: Chuyên ngành Vi sinh-Sinh học phân tử - Người hướng dẫn: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY Mục tiêu đề tài: Mục tiêu lớn đề tài giúp định danh xác sưu tập lồi thuộc chi nấm ký sinh côn trùng Trong khuôn khổ đề tài NCKH sinh viên, mục tiêu đề tài tóm gọn lại mục tiêu lớn nói trên, tập trung việc xây dựng phương pháp luận hoàn chỉnh dựa kỹ thuật Sinh học Phân tử kết hợp Tin-Sinh học ứng dụng nhằm hỗ trợ định danh số mẫu nấm ký sinh trùng Tính sáng tạo: Với hạn chế mặt kinh phí thực hiện, có thơng tin di truyền vùng gen ITS1-5.8S-ITS2, vận dụng thành công việc khai thác thơng tin này: trình tự cấu trúc bậc 1, cấu trúc bậc vùng ITS2 để hỗ trợ tối đa cho công tác định danh mẫu nấm có Kết nghiên cứu: Phương pháp luận xây dựng tổng thể, toàn bộ: từ thực nghiệm máy tính Các khâu tách chiết DNA, PCR, giải trình tự quy trình hóa với ghi quan trọng, cần thiết Các bước hiệu chỉnh trình tự sau giải, xây dựng sở liệu cục tin cậy, khai thác sỡ liệu Genbank, xây dựng phả hệ phân tử phương pháp, xây dựng cấu trúc bậc 2, áp dụng theo quy chuẩn giới Kết vậy, hỗ trợ định danh đạc mức độ xác cao Số mẫu xác định đến mức lồi, hay mức chi có kết luận rõ ràng, cung cấp thông tin cần thiết cho việc khai thác ứng dụng chi nấm hay hỗ trợ tiếp tục cho công tác phân loại tiếp tục tiến hành Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: Tuy kết thực nghiệm bước đầu, chúng tơi hồn tồn có đầy đủ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu mức cao hơn, tăng cỡ mẫu thực sưu tập lên đến 100 mẫu Phương pháp luận xây dựng qua nghiên cứu hoàn toàn đủ sở để áp dụng cho chi nấm khác Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ tên tạp chí có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài (phần người hướng dẫn ghi): Nhóm sinh viên thực đề tài, SV Nguyễn Ngọc Nam làm trưởng nhóm hồn thành tốt cơng việc GV hướng dẫn đề nghị giai đoạn đầu thực đề tài Kết thúc giai đoạn này, em cung cấp số liệu khai thác thơng tin (data mining) hồn để xây dựng sỡ liệu cục bộ, phục vụ mục tiêu phân loại định danh nấm sau Các ghi thực nghiệm quan trọng tiến hành với nấm ký sinh rút Các phương pháp sử dụng mang quy chuẩn giới, phương pháp luận xây dựng hoàn chỉnh kết bậc đề tài Đề tài tiếp tục mở rộng để định danh cho sưu tập lên đến 100 mẫu có Ngày tháng Xác nhận đơn vị Người hướng dẫn (ký tên đóng dấu) (ký, họ tên) năm LỜI CÁM ƠN LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài này, với phấn đấu cố gắng hết mình, em nhận đƣợc hƣớng dẫn giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trƣờng đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức tảng vô quý giá, tạo tiền đề để em tiếp tục học tập, nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Huyền Ái Thúy anh Trần Huỳnh Minh Nhật, cảm ơn thầy cô bên cạnh định hƣớng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên em hoàn thành đề tài Xin cảm ơn bạn thực tập em học việc phịng thí nghiệm hỗ trợ, giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài thực thập Và cuối cùng, xin đƣợc gửi lời cám ơn đến ba mẹ ln động viên hỗ trợ để có đƣợc nhƣ ngày hơm Con xin chúc ba mẹ lời chúc sức khỏe Một lần em xin gửi đến quý thầy cô, anh chị, bạn em lời biết ơn lời kính chúc sức khỏe, gặt hái nhiều thành cơng tƣơng lai Em xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh,tháng 04 năm 2013 Đỗ Ngọc Nam Nguyễn Thị Hải Ngọc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 T ỔNG QUAN VỀ CÁC LỒI NẤM KÝ SINH CƠN TRÙNG: 1.1.1 Đặc điểm chung thành phần loài 1.1.2 Phân loại khoa học: 1.1.3 Tiềm ứng dụng: 1.2 NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI: 1.2.1 Đặc điểm nhận dạng định danh: 1.2.2 DNA ribosome trình tự ITS định danh phân tử nấm: 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC: 14 1.4 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ: 15 1.4.1 Phƣơng pháp Maxam – Gilbert: 16 1.4.2 Phƣơng pháp Sanger hay dideoxynucleotide: 17 1.4.3 Những phƣơng pháp cải tiến phƣơng pháp Sanger: 19 1.4.4 Pyrosequencing 20 1.5 HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ (PROOFREADING) 20 1.6 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH LOÀI 22 1.7 DỰ ĐOÁN CẤU TRÚC BẬC HAI rDNA 26 CHƢƠNG 29 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 30 2.2 Vật liệu vá phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng 30 2.2.2 Dụng cụ - thiết bị - hoá chất 30 2.2.3 Danh mục phần mềm sử dụng 31 2.3 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU: 32 2.3.1 Thu thập mẫu sơ định danh hình thái: 33 2.3.2 Tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi: 33 2.3.3 PCR 34 MỤC LỤC 2.3.4 Xác định trình tự khuếch đại: 35 2.3.5 Hiệu chỉnh trình tự: 35 2.3.6 So sánh với sở liệu GenBank: 36 2.3.7 Xây dựng liệu DNA: 36 2.3.8 Dị tìm mơ hình tiến hố: 36 2.3.9 Xây dựng phát sinh loài: 37 2.3.10 Dự đoán cấu trúc bậc hai vùng gene ITS2 37 2.3.11 Xử lý hình ảnh: 37 CHƢƠNG 38 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 KẾT QUẢ SƢU TẬP MẪU VÀ SƠ BỘ ĐỊNH DANH HÌNH THÁI 39 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM NHẰM KHUẾCH ĐẠI VÙNG ITS1-5.8S-ITS2 CHO CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG: 39 3.3 KẾT QUẢ HIỆU CHỈNH TRÌNH TỰ 44 3.3.1 Kết hiệu chỉnh trình tự với SeaView Chromas Pro: 44 3.4 PHÂN TÍCH THÀNH PHẨN NUCLEOTIDE Ở VÙNG ITS1-5.8S-ITS2: 49 3.5 KẾT QUẢ SO SÁNH VỚI CƠ SỞ DỮ LIỆU GENBANK: 51 3.6 XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ ITS NHĨM NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG 55 3.7 XÁC ĐỊNH MƠ HÌNH TIẾN HỐ: 55 3.8 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH LOÀI: 56 3.9 KẾT QUẢ DỰ ĐOÁN CẤU TRÚC BẬC HAI VÙNG ITS2: 62 3.10 PHÂN TÍCH CÁC KẾT QUẢ - KẾT LUẬN VỀ PHÂN LOẠI, ĐỊNH DANH CHO CÁC MẪU NẤM THUỘC BỘ SƢU TẬP : 63 CHƢƠNG 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC 88 PHỤ LỤC Beauveria sp IMI 228343 Beauveria sp MTCC_4502 Beauveria sp NHJ11927 107 PHỤ LỤC Beauveria sp RCEF3903 Beauveria sp SJ2010 Beauveria sp SJL0910 108 PHỤ LỤC Beauveria sungii Beauveria varroae Beauveria vermiconia 109 PHỤ LỤC Isaria fumosorosea Isaria japonica Isaria javanica 110 PHỤ LỤC Isaria takamizusanensis Isaria tenuipes Isaria xylariiformis 111 PHỤ LỤC DL0025 DL0040 DL0041 112 PHỤ LỤC DL0042 DL0043 DL0044 113 PHỤ LỤC DL0045 DL0046 DL0047 114 PHỤ LỤC DL0048 DL0049 DL0024 115 PHỤ LỤC DL0028 DL0027 DL0029 116 PHỤ LỤC DL0030 DL0031 DL0077 117 PHỤ LỤC DL0081 DL0082 DL0088 118 PHỤ LỤC DL0090 DL0001 DL0002 119 PHỤ LỤC DL0003 DL0006 DL0007 120 PHỤ LỤC DL0008 121 ... ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LỒI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CƠN TRÙNG DỰA TRÊN CƠ SỞ DỮ LIỆU PHẢ... PHẢ HỆ PHÂN TỬ VÀ CẤU TRÚC BẬC HAI CỦA VÙNG TRÌNH TỰ ITS1- 5. 8S -ITS2 Thuộc nhóm nghành khoa học: Sinh Học Phân Tử Sinh viện thực hiện: Đỗ Ngọc Nam Giới tính: Nam Dân tộc: Kinh Lớp: SH09A3, Công... Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: * Năm thứ 4: Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học Kết xếp loại học tập: Khá