Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự gen matk của cây vú bò

Trang 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– VŨ VĂN TRUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ GEN matK CỦA CÂY VÚ BÒ Ficus simplicissima Lour..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

VŨ VĂN TRUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,

GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ GEN matK CỦA CÂY VÚ BÒ (Ficus simplicissima Lour.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2023

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

VŨ VĂN TRUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,

GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ GEN matK CỦA CÂY VÚ BÒ (Ficus simplicissima Lour.)

Ngành: Di truyền học

Mã số: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy

THÁI NGUYÊN - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc Kết quả của luận văn được công bố cùng nhóm nghiên cứu trên Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên và Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2022

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2023

Tác giả luận văn

Vũ Văn Trung

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Thị Thu Thuỷ, khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người chỉ bảo, hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài NCKH cấpTrường Đại học Sư phạm,

mã số CS2021-19 do PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy khoa Sinh học làm chủ nhiệm

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện luận văn Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ

bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên

đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học này

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn tới bạn bè, gia đình đã quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2023

Tác giả luận văn

Vũ Văn Trung

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn i

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắ iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây Vú bò 3

1.1.1 Đặc điểm của cây Vú bò 3

1.1.2 Các nghiên cứu về cây Vú bò 4

1.2 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu trong định danh thực vật 5

1.3 Hệ gen lục lạp và DNA barcode 9

1.3.1 Hệ gen lục lạp 9

1.3.2 DNA barcode 11

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu 15

2.2.2 Nhóm phương pháp phân tích gen matK 16

2.3 Địa điểm nghiên cứu 17

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Kết quả phân tích về đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Vú bò 18

3.1.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái cây Vú bò 18

3.1.2 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu của cây Vú bò 19

3.2 Kết quả phân tích trình tự nucleotid của đoạn gen matK 23

3.2.1 Kết quả tách DNA tổng số và xác định độ tinh sạch của DNA 23

3.2.2 Kết quả nhân gen matK 24

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

1 Kết luận 30

2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

NCBI National Center for Biotechnology Information

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh mẫu cây Vú bò thu thập tại Thái Nguyên 3

Hình 2.1 Mẫu cây Vú bò thu thập và bảo quản tại Thái Nguyên 15

Hình 3.1 Hình ảnh cây Vú bò trồng ngoài tự nhiên 18

Hình 3.2 Hình ảnh tiêu bản hiển vi tạm thời lát cắt ngang gân chính của lá cây Vú bò 19

Hình 3.3 Hình ảnh tiêu bản hiển vi tạm thời lát cắt ngang cuống lá cây Vú bò 20

Hình 3.4 Hình ảnh tiêu bản hiển vi tạm thời lát cắt ngang thân chínhcủa cây Vú bò 21

Hình 3.5 Hình ảnh tiêu bản hiển vi tạm thời lát cắt ngang rễ cây Vú bò 22

Hình 3.6 Kết quả khuếch đại gen matK mẫu cây Vú bò 24

Hình 3.7 Trình tự nucleotide đoạn gen matK cây Vú bò 25

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen matK trên NCBI 26

Hình 3.9 Sơ đồ mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Ficus 29

Trong rễ cây Vú bò có chứa các axit hữu cơ, axit amin, các chất triterpen, alkaloid và coumarin… Trong đó alkaloid và coumarin là hai trong

số các thành phần đóng vai trò quan trọng trong dược liệu

Việc định danh thực vật được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: hình thái, giải phẫu và sinh học phân tử Cách thức này đã thành công trên nhiều thực vật như: Tam thất bắc [3], cây bảy lá một hoa [4] cây hài Helen [10]…

Lục lạp (Chloroplast, Cp), một bào quan hình trứng đặc trưng với cấu trúc thylakoid và màng hai lớp, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp và một số quá trình sinh hóa quan trọng của thực vật Cũng giống như ty thể, lục lạp chứa bộ gen của riêng chúng.Vì bộ gen lục lạptương đối bảo thủ về tổ chức, cấu trúc và trình tự DNA so với bộ gen nhân và ty thể, nên chúng đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá ý nghĩa phân loại và mối quan hệ phát sinh loài Trong hệ gen lục lạp có nhiều đoạn gen được sử dụng

làm DNA barcode như matK, rpoC1, ips2,…

Với mục đích đóng góp thông tin về cây Vú bò làm cơ sở cho việc khai

thác và phát triển cây Vú bò chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm

hình thái, giải phẫu và trình tự gen matK của cây Vú bò (Ficus

simplicissima Lour.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được đặc điểm hình thái, giải phẫu và đoạn gen matK của cây

Vú bò thu thập tại tỉnh Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Vú bò

(2) Nghiên cứu đặc điểm trình tự đoạn gen matK của cây Vú bò

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Vú bò

1.1.1 Đặc điểm của cây Vú bò

Cây Vú bò hay còn gọi là Thổ hoàng kỳ, Vú bò sẻ, Vú chó, Vú lợn, Ngải

phún, Sung ba thùy có tên khoa học là Ficus simplicissima Lour Cây Vú bò

là 1 trong khoảng 850 loài thuộc chi Đa đề, còn gọi là chi Sung (Ficus), họ Dâu tằm (Moraceae), bộ Hoa hồng (Rosales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida),

Hình ảnh cây Vú bò tại xã Bình Sơn-

Thành phố Sông Công- tỉnh Thái Nguyên

Hình ảnh cây Vú bò tại xã Hùng Sơn- Huyện Đại Từ- tỉnh Thái Nguyên

Hình 1.1 Hình ảnh mẫu cây Vú bò thu thập tại Thái Nguyên

(Hình ảnh do nhóm nghiên cứu của đề tài CS.2021-19, Trường Đại học Sư phạm-

ĐHTN cung cấp)

1.1.2 Các nghiên cứu về cây Vú bò

Theo Đông y, cây Vú bò vị cay, ngọt, hơi ấm, có tác dụng kiện tỳ, bổ phế, hành khí lợi thấp, tráng gân cốt, chữa phong thấp tê bại, ho do phế lao, ra

mồ hôi trộm, mệt mỏi chân tay, ăn ít bụng trướng, viêm gan, phụ nữ sau sinh không có sữa Rễ cây Vú bò là bộ phận chính được sử dụng làm thuốc Theo

Đỗ Huy Bích và cs (2006), trong rễ cây Vú bò có 3 loại hợp quan trọng đó là triterpen, alkaloid và coumarin, các chất này có hoạt tính sinh học mạnh, là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học Chỉ tính riêng coumarin, ít nhất cũng có 1300 coumarin khác nhau đã được xác định Coumarin có các hoạt động chống huyết khối, chống viêm và giãn mạch Coumarins cũng có thể có tác dụng kháng virus và rất độc đối với loài gặm nhấm Một số hợp chất coumarin có thể sử dụng để chữa bệnh nấm Candida âm đạo Ngoài ra, coumarin có thể tạo ra các đại thực bào, tác động tiêu cực đến nhiễm trùng do vi khuẩn [1] Hiện nay, cây Vú bò chưa được trồng chính thức mà chỉ được sử dụng làm thuốc bằng cách thu hái trong tự nhiên Vú bò có thể trồng bằng hạt nhưng tỉ lệ nảy mầm thấp

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Tâm và cs (2014) về việc nhân giống in

vitro cây Vú bò cho thấy: sử dụng javen nồng độ 60% để làm sạch hạt trong 15

phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm đạt 76,67% trong tổng số hạt không nhiễm, chất lượng chồi tốt(mầm mập, màu xanh bình thường) Tạo đa chồi tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung agar 0,85% than hoạt tính 0,1%, saccarose 3%, nước dừa 0,05%, BAP 1,5mg/l (hay NAA 0,3mg/l), pH 5,8 Môi trường thích hợp để

tạo cây vú bò invittro hoàn chỉnh là MS có bổ sung nước dừa 0,05%, agar

0,85%, than hoạt tính 0,1%,NAA 0,3mg/l, saccarose 3% Cây Vú bò sinh trưởng tốt nhất trong vườn ươm trước khi trồng đại trà là đất thịt trung bình kết hợp vớ trấu hun theo tỉ lệ 2:1 Kết quả nghiên cứu này bước đầu làm cơ sở cho việc bảo tồn và cải tạo cây thuốc phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu [8]

1.2 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu trong định danh thực vật

1.2.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái- giải phẫu thực vật

Hình thái giải phẫu học thực vật đã được nghiên cứu từ lâu, phương pháp chủ yếu là quan sát ngoài tự nhiên, tiến hành giải phẫu trong phòng nghiệm, so sánh với các mẫu thu thập được, phân tích, tổng hợp và rút ra các nhận xét chính xác [7]

Việc tiến hành qua sát không những trên cơ thể sống, mà cả các bộ phận chết của các cơ quan, kể cả các cơ quan đang hình thành, phải theo trong quá trình phát triển cá thể cũng như chủng loại phát sinh

Hầu hết cấu trúc của các cơ quan đều phải nghiên cứu ở mức độ hiển vi Các mẫu thực vật cần được cắt thật mỏng, các lát cắt phải theo những hướng nhất định trong không gian Để theo dõi sự hình thành một cơ quan hay sự biến đổi cấu tạo từ bộ phận này sang bộ phận khác, cần tiến hành hàng loạt các lát cắt liên tiếp nhau Nhiều trường hợp, muốn quan sát hình dạng tế bào phải dùng phương pháp ngâm mủn, tức là dùng hoá chất hoà tan chất gian bào để tách rời

tế bào Để giữ nguyên cấu trúc bên trong tế bào hay của mô, người ta thường phải sử lí các cơ quan sống của cây trong các chất định hình dùng trong phương phương pháp nhuộm màu Phương pháp này giúp ta phân biệt rõ các thành phần cấu tạo các cơ quan Ở đây, người ta dùng các chất tẩy nhẹ để tẩy hết nội chất tế bào, sau đó dùng thuốc nhuộm, mỗi thành phần bắt một màu nhất định Cũng có khi không cần tẩy, như khi dùng hematoxilin để nhuộm nhân tế bào Nhiều trường hợp phải dùng phương pháp phi phân tích, tuỳ theo yêu cầu quan sát

Ngày nay, người ta còn dùng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào Tách

mô hoặc tế bào ra khỏi cơ thể và nuôi trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo,

có thể phát triển và hình thành các tế bào, mô mới Bằng phương pháp này người ta có thể tìm hiểu quá trình hình thành tế bào, mô và sự phát triển cá thể

của một loài nào đó Áp dụng phương pháp này, người ta có thể nhân giống cây trồng rất nhanh mà không cần đến các hình thức sinh sản khác

Dùng kính hiển vi quang học thông thường với độ phóng đại 100 – 1000 lần, ta có thể quan sát cấu tạo chi tiết của tổ chức cơ thể Trong nhiều trường hợp, muon quan sát rõ một bộ phận nào đó, người ta còn dùng các loại ánh sáng khác nhau như: Tia phân cực, tia tử ngoại, ánh sáng đèn huỳnh quang,

Ngày nay, kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 10000 - 40000 lần đã cho phép các nhà nghiên cứu giải phẫu tìm ra các cấu trúc siêu hiển vi và phát hiện nhiều đặc điểm mơi của tế bào, cấu trúc của nhân tế bào, của thể nhiễm sắc, góp phần to lớn trong việc nghiên cứu giải phẫu học và di truyền học hiện đại

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu hình thái - giải phẫu thực vật

Theo Phrate(371 -286 trước CN) đã viết nhiều sách về thực vật như: Lịch

sử thực vật, nghiên cứu về cây cỏ, Trong các sách đó, lần đầu tiên đề cập đến dẫn liệu có hệ thống về hình thái, cấu tạo của cơ thể thực vật, cùng với cách sống, cách trồng, cũng như công dụng của nhiều loài cây Những hiểu biết ban đầu về đặc điểm hình thái trong một thời gia dài là cơ sở để phân loại cây cối Bởi vậy, lịch sử phát triển của hình thái giải phẫu học thực vật luôn gắn liền với sự phát triển của phân loại học thực vật

Năm 1703, John Ray đã phân biệt sự khác nhau của cây môt lá mầm và cây hai lá mầm, tách chúng thành hai nhóm phân loại lớn

Sự ra đời của kính hiển vi (thế kỉ XVII) đã mở đầu cho một giai đoạn mới nghiên cứu cấu trúc bên trong cơ thể, tức là nghiên cứu tế bào Vào những năm 70 của thé kỉ XVII các nhà sinh vật học Malphighi(người Ý) và Grew (người Anh) đã công bố công trình mang tên: “Giải phẫu thực vật” có thể xem

là mở đầu cho giải phẫu thực vật ngày nay

Năm 1877, De Barry cho xuất bản cuốn: “Giải phẫu so sánh các cơ quan sinh dưỡng” trong đó đã phân biệt các loại mô, túi tiết, mạch, ống nhựa mủ, đánh dấu một bước tiến bộ trong việc nghiên cứu cấu trúc cơ thể thực vật

Cuối thế kỉ XIX và đầu thế kỉ XX, việc nghiên cứu tế bào được tiến hành mạnh mẽ Nhân tế bào được phát hiện, sự phân chia tế bào cũng được tìm ra bởi nhà sinh học người Nga Tchitiacov Sau đó Gherasimov tìm được vai trò của nhân

tế bào Năm 1898, Navasin đã phát hiện sự thụ tinh kép ở thực vật hạt kín

Từ nửa sau thế kỉ XX, nhờ kính hiển vi điện tử, việc nghiên cứu hình thái giải phẫu thực vật càng được đẩy mạnh

Ở Việt nam, việc nghiên cứu hình thái giải phẫu thực vật còn chưa nhiều, trong thời kì Pháp thuộc có cuốn: Các cây gỗ ở Đông dương của H.Lecomte và một số tài liệu liên quan khác Những năm gần đây, một số tác giả trong nước

đã quan tâm nghiên cứu giải phẫu một số loài, chi hay họ thực vật hạt kín Ngoài ra, trong các trường Đại học ở Việt nam cũng cho xuất bản các giáo trình về hình thái- giải phẫu học thực vật, là tập hợp về mặt lí thuyết và kết quả nghiên cứu thực tế trong lĩnh vực giải phẫu thực vật của các tác giả trong

và ngoài nước [7]

1.2.3 Quan hệ giữa hình thái giải phẫu thực vật với các môn khoa học khác

Hình thái- giải phẫu học thực vật cung cấp các kiến thức cơ sở cho nhiều môn học khác, trước hết là đối với phân loại học thực vật Từ thời xa xưa, các nhà thực vật học đã sử dụng nhiều dấu hiệu hình thái để phân loại cây cối Đặc biệt, từ thế kỉ XVI trở đi người ta đã biết dựa vào các đậc điểm hình thái cơ quan sinh sản và sinh dưỡng làm tiêu chuẩn phân loại

Từ khi có kính hiển vi, việc nghiên cứu giải phẫu so sánh được phát triển mạnh mẽ và đóng góp tích cực vào lĩnh vực phân loại học Trong nhiều trường hợp các đặc điểm giải phẫu được dùng để phân loại không những các bậc phân loại lớn họ, chi mà cả đến loài và dưới loài Ngày nay, hệ thống học thực vật được xây dựng dựa trên cơ sở tổng hợp các dẫn liệu của các ngành khoa học khác nhau

có liên quan đến thực vật, trng đó có hình thái tiến hoá, đặc biệt các dấu hiệu về giải phẫu là những dẫn liêu đáng tin cậy và không thể thiếu được

Đối với môn cổ thực vật học, khoa học chuyên nghiên cứu các thực vật sống ở các thời đại địa chất trước đây cũng phải sử dụng phương pháp nghiên

cứu hình thái và giải phẫu, vì các di tích hoá đá của thực vật được giữ lại trong các lớp đất vẫn còn giữ được hình thái ngoài( vết lá, dạng lá,vỏ thân, ) và cả những chi tiết hiển vi trong cấu tạo Các chi tiết đó không những cần thiết cho việc xác định lich sử phát triển thực vật, mà còn giúp cho việc xác định tuổi của các tầng của lớp vỏ trái đất

Hình thái - giải phẫu học thực vật cũng góp phần đáng kể trong việc nghiên cứu sinh lí học thực vật Dựa vào các đặc điểm giải phẫu, ta có thể giải thích được các hoạt động sinh lí của cây, qua đó thấy được mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của các cơ qua trong cơ thể

Mối quan hệ giữa hình thái- giải phẫu học với sinh thái học thực vật rất chặt chẽ Nhờ các dấu hiệu biến đổi về hình thái giải phẫu các cơ quan khác nhau của cây, của các cá thể hoặc một số loài nhất định mà ta có thể giải thích được các hình thức thích nghi khác nhau nhau của cơ thể với điều kiện sống bến ngoài

Các kiến thức về giải phẫu cũng cần cho bộ môn bảo vệ thực vật Nhờ giải phẫu các bộ phận cây, ta mới biết được các nấm, vi khuẩn hay virus kí sinh gây bệnh cho cây chủ yếu trong các loại tế bào và mô nào, các tế bào phản ứng lại với sự phá hoại của các vi sinh vật kí sinh hay sâu bệnh ra sao Ngoài ra, các nghiên cứu về hình thái, giải phẫu thực vật cũng phục vụ cho các ngành sản xuất có liên quan:

Ngành Dược thường sử dụng nhiều sản phẩm khác nhau có nguồn gốc thực vật, phần lớn là các mẫu đã phơi hoặc sấy khô Do đó, nếu chỉ nhìn hình dáng, màu sắc thì dễ lầm lẫn loài này với loài khác Nhờ phương pháp giải phẫu so sánh, ta có thể phân biệt được loài thật với loài giả, cây lành với cây độc

Hình thái - giải phẫu học cũng phục vụ cho việc nghiên cứu cây trồng Nhờ phương pháp giải phẫu và ngâm mủn, người ta biết được hình thái kích thước, số lượng của các loài cây lấy sợi khác nhau Trong công tác chọn giống, màu sắc của các cơ quan (nhất là hạt) là một tiêu chí quan trọng Chỉ có phân

tích giải phẫu mới biết được bản chất của các chất màu và sự phân bố của chúng trong mô

Việc kiểm tra cellulose bằng phương pháp hiển vi cũng được ứng dụng trong ngành sản xuất giấy Nhờ đó người ta biết được nguồn gốc của nguyên liệu của loài cây nào và đặc điểm cấu tạo của các loại cellulose

Cuối cùng, giải phẫu thực vật cũng có vai trò quan trọng trong việc xác định chất lượng gỗ của ngành lâm nghiệp Độ bền cơ học của gỗ phụ thuộc vào cấu trúc các yếu tố gỗ và sợi Đối với các nhà thực hành giải phẫu gỗ có kinh nghiệm thì việc xác định các đồ dùng bằng gỗ thuộc loại cây nào không phải là điều khó khăn sau khi các mẫu gỗ đó được quan sát phân tích dưới kính hiển vi Nhiều nước đã có những tài liệu nghiên cứu xác định tên cây bằng phương pháp giải phẫu gỗ

Như vậy, việc nghiên cứu hình thái giải phẫu thực vật không những cung cấp kiến thức cơ sở cho các môn học thực vật khác, mà còn có thể phục vụ cho nhiều ngành nghiên cứu ứng dụng trong công, nông, lâm nghiệp và ngành địa chất

1.3 Hệ gen lục lạp và DNA barcode

1.3.1 Hệ gen lục lạp

Lục lạp (Chloroplast) là một bào quan hình trứng đặc trưng với cấu trúc thylakoid và màng hai lớp, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp và một số quá trình sinh hóa quan trọng của thực vật Cũng giống như ti thể, lục lạp chứa bộ gen của riêng chúng.Vì bộ gen lục lạp tương đối bảo thủ về

tổ chức, cấu trúc và trình tự DNA so với bộ gen nhân và ty thể, nên chúng đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá ý nghĩa phân loại và mối quan hệ phát sinh loài Hệ gen lục lạp (chloroplasts) của thực vật không chỉ có chức năng sản xuất một số protein cho lục lạp mà còn cung cấp thông tin nghiên cứu về mối quan hệ tiến hóa của các loài, xác định một loài một cách chính xác, cung cấp chỉ thị ứng dụng trong chuyển gen, nhân giống Với đa số các loài trong chi

Ficus, các công bố từ năm 2020 đến nay cho thấy, hệ gen lục lạp hoàn chỉnh

công bố trên GenBank có kích thước lớn hơn 160000 bp Hệ gen lục lạp được chia ra làm 4 vùng: vùng sao chép đơn lớn hay vùng sao chép đơn dài (large/long single copy region, LSC), vùng sao chép đơn nhỏ hay vùng sao chép đơn ngắn (small/short single copy region, SSC) được phân tách bởi hai vùng lặp lại đảo ngược (Inveted repeat, IR) Các nghiên cứu trước đây đã gợi ý rằng những vùng lặp lại đảo ngược, phát triển với tốc độ tương đối chậm, tích lũy đột biến điểm chậm hơn các vùng sao chép đơn Vì vậy, hầu hết các nhà nghiên cứu thực vật sử dụng công cụ phân tử đã tập trung vào các vùng sao chép đơn (Huang và cs, 2022) [11]

Nghiên cứu của Shaw và cs (2007) cho thấy, trong cấu trúc của hệ gen lục lạp thì các vùng sao chép đơn có khả năng đột biến điểm cao gấp 2,3 lần so với vùng IR (Shaw và cs, 2007) Vì vậy, vùng sao chép đơn thường là vùng được nghiên cứu nhiều hơn (Shaw và đtg, 2007) Tuy nhiên vùng lặp lại đảo ngược- IR chứa các gen lặp lại (gen mã hóa ribosome, một

số gen tRNA, gen mã hóa protein) lại có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự sắp xếp các gen của DNA lục lạp (Václav và cs, 2018) [16]

Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Điềm và cs (2019) sử dụng kỹ thuật IlluminaHiSeq để xác định trình tự thô và kiểm tra chất lượng của dữ liệu trình tự thô bằng chương trình FastQC version 0.11.8 Sử dụng chương trình NOVOPlasty 2.7.2 để lắp ráp các đoạn trình tự thô kết quả đã xác định

được bộ gen lục lạp loài lan Hài hồng (Paphiopedilum delenatii) có chiều

dài 160.955 bp Tổng số gen là 130 gen gồm 77 gen mã hóa protein, 39 gen

mã hóa tRNA, 8 gen mã hóa rRNA, phần trăm hàm lượng GC của bộ gen lục lạp 35,6% Dữ liệu trình tự đã được đăng kí vào Ngân hàng gen (GenBank) với mã số MK463585 [2]

Nguyen và cs (2021) sử dụng kỹ thuật PacBioSEQUEL để xác định

trình tự thô của bộ gen lục lạp của loài A megaphylla Hu, thuộc chi Dương

đồng (Adrinandra) Sử dụng chương trình phần mềm HGAP4 để lắp ráp các đoạn trình tự thô kết quả đã xác định được hệ gen lục lạp loài A Megaphylla

Hu có chiều dài 29.815.452bp, gồm một vùng sao chép lớn (LSC 85.688 bp), một vùng sao chép nhỏ (SSC 18.424 bp) được phân tách bởi hai vùng lặp lại đảo ngược (IRs 26.093 bp) Tổng số gen là 131 gen gồm 86 gen mã hóa protein, 37 gen mã hóa tRNA, 8 gen mã hóa rRNA, phần trăm hàm lượng

GC của hệ gen lục lạp là 37,4% [14]

Theo nghiên cứu của Shi (2020) xác định trình tự nucleotide của hệ gen

lục lạp hoàn chỉnh của loài Ficus hirta gồm 160357 bp (mã số trên GenBank

NC051532) Nghiên cứu của Yu (2020) xác định trình tự nucleotide của hệ

gen lục lạp hoàn chỉnh của loài Ficus beipeiensis gồm 160595 bp (mã số trên

GenBank NC050048) [20]

1.3.2 DNA barcode

Mã vạch DNA (DNA barcode, chỉ thị DNA) là một đoạn trình tự nucleotide ngắn, chuẩn của các loài sinh vật đã được xác định nằm trong ngân hàng gen, được sử dụng để định danh các loài sinh vật chưa biết bằng phương pháp so sánh với trình tự DNA của ngân hàng gen (Genbank)

Đến nay, các mẫu sinh vật vẫn thường được nhận diện bằng các đặc tính hình thái bên ngoài hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, mẫu vật chưa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hư hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là không thể Trong những trường hợp này mã vạch DNA đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu mô

bé xíu Hơn nữa, mã vạch DNA còn đóng góp thêm một ý nghĩa khác ngoài ý nghĩa giúp định danh mẫu vật, nó còn giúp quá trình phân tích tiến hóa sinh học của loài vật đó trong tự nhiên

Có thể tóm tắt các bước xây dựng mã vạch DNA trong phân loại thực vật như sau:

(1) Phân lập đoạn DNA được lựa chọn làm chỉ thị nhận diện các loài sinh vật

(2) Xác định trình tự nucleotide của đoạn DNA trên thiết bị tự động Sử dụng phần mềm BioEdit và DNAstar để phân tích, so sánh và thu đoạn DNA mong muốn

(3) Sử dụng phần mềm BLAST trong NCBI để xác định các trình tự tương đồng và đoạn tương đồng của trình tự gốc với các trình tự so sánh

(4) Xác định hệ số tương đồng và phân ly, sơ đồ hình cây để thiết lập mối quan hệ di truyền của sinh vật nghiên cứu

Nguyễn Thị Hải Yến và cs (2022) nghiên cứu sự tương quan giữa chỉ thị DNA và đặc điểm hình thái phục vụ định danh lan Hài Helen (paphiopedilum helenae Aver) của Việt Nam cho thấy việc nhận diện Lan hài Helen bằng hai

chỉ thị trnH-psbA và ITS (Internal transcribed spacer) hoàn toàn phù hợp

với phương pháp so sánh hình thái Sử dụng các mã vạch này cũng thu được độ tương đồng ở mức 99,98% với các loài trong cùng chi, do đó hai

chỉ thị trnH-psbA và ITS được đề xuất là ứng viên mã vạch DNA để nhận

diện nhanh loài Lan Helen [10]

Lê Chí Toàn (2022) Nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của các loài Macrosolen (BLUME) RCHB (Loranthaceae) ở Việt Nam dựa trên dữ liệu

phân tử của 27 mẫu nghiên cứu với 5 vùng DNA bao gồm các gen rbcL, matK,

tnrL-F, SSU rDNA và LSU rDNA bằng phương pháp Maximum likelihood

(ML) và Bayesian inference (BI) để xây dựng cây phát sinh loài Kết quả nghiên

cứu chỉ ra Macrosolen ở Việt Nam có sự tương đồng về dữ liệu hình thái phân tử

và tương đồng di truyền với các mẫu của chi này từ các nước khác [9]

Gen matK nằm trong hệ gen lục lạp (mã hóa cho maturase K) Trong gen