Nghiên cứu đặc điểm hình thái giải phẫu và sử dụng ADN mã vạch định danh cây rau rươi lá bắc trồng tại cần thơ

Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 09 - 2020 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI GIẢI PHẪU VÀ SỬ DỤNG ADN MÃ VẠCH ĐỊNH DANH CÂY RAU RƯƠI LÁ BẮC TRỒNG TẠI CẦN THƠ Đỗ Văn Mãi*, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình, Phạm Thành Trọng Trần Cơng Luận** Khoa Dược - Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô (*Email: dvmai@tdu.edu.vn) Ngày nhận: 11/6/2020 Ngày phản biện: 19/8/2020 Ngày duyệt đăng: 10/9/2020 TÓM TẮT Cây Rau rươi bắc sử dụng với tác dụng chống viêm, giảm đau, chống loét, giúp tăng chất nhày niêm mạc dày, giảm tiết acid dày, điều trị nhiều bệnh khác bệnh lý viêm gan, viêm phổi, bệnh lý tiểu đường Những năm gần đây, người dân địa phương biết đến hiệu trị đau dày với tên dân gian “Cỏ bao tử” Một thuốc quý mà chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu nên bước đầu nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu khẳng định tên khoa học cần thiết, làm sở cho nghiên cứu Kết nghiên cứu mô tả chi tiết đặc điểm cấu tạo giải phẫu phận lá, thân, rễ bột thân Rau rươi bắc phương pháp giải trình tự ADN dựa đoạn gen rbcL xác định tên khoa học Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong, thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) Đây báo cáo lần cấu tạo giải phẫu Rau rươi bắc so với nghiên cứu trước Từ khóa: Commelinaceae, đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu, Murdannia bracteate, Rau rươi bắc Trích dẫn: Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình, Phạm Thành Trọng Trần Cơng Luận, 2020 Nghiên cứu đặc điểm hình thái giải phẫu sử dụng ADN mã vạch định danh Rau rươi bắc trồng Cần Thơ Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 09: 221-235 **TTƯT PGS.TS Trần Công Luận – Hiệu trưởng, Trưởng Khoa Dược & ĐD, Trường ĐHTĐ 221 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô ĐẶT VẤN ĐỀ Số 09 - 2020 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cây Rau rươi bắc phân bố Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Trung Quốc Lào, dùng làm thuốc viêm hạch lympho, tiểu đục, tiểu buốt, ghẻ lở (Võ Văn Chi, 2012) Hiện người dân địa phương tỉnh miền Tây Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc Liêu, Vĩnh Long… trồng chủ yếu dùng theo dân gian gia đình để hỗ trợ điều trị bệnh dày Ở số nước, Rau rươi bắc sử dụng với tác dụng chống viêm, giảm đau, chống loét, giúp tăng chất nhày niêm mạc dày, giảm tiết acid dày, điều trị nhiều bệnh khác bệnh lý viêm viêm gan, viêm miệng, viêm phổi, viêm thận, bệnh lý tiểu đường (Ooi, 2015; Wang, 2007; Yam, 2010) Theo điều tra năm gần nhiều người dân địa phương biết đến để trị đau dày hiệu với tên dân gian “Cỏ bao tử” (Mai Long, 2012; Nguyễn Hùng Mạnh ctv., 2019) Tuy nhiên, nghiên cứu loài Việt Nam giới ít, có vài nghiên cứu thành phần hóa học (Nguyễn Hùng Mạnh ctv., 2019), chưa có tài liệu nghiên cứu chi tiết đặc điểm hình thái thực vật Bài viết trình bày số kết nghiên cứu đặc điểm thực vật, bổ sung thêm tư liệu cho việc xác định lồi, từ đặt tảng cho việc nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Rau rươi bắc 2.1 Nguyên liệu Các mẫu nghiên cứu bao gồm toàn Rau rươi bắc thu hái ngày 01 tháng 12 năm 2019 C53 khu dân cư Thạnh Mỹ, phường Lê Bình, quận Cái Răng, Thành phố Cần Thơ (vĩ độ 10.002459, kinh độ 105.757905) Mẫu tiêu khô gồm rễ, thân, cành, lá, hoa, lưu lại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược – Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô PGS.TS Trương Thị Đẹp giám định so sánh với số tài liệu tham khảo (Võ Văn Chi, 2012) Mẫu non tươi để chiết phân tích ADN giải trình tự gen Trường Đại học Cần Thơ Công ty Phù Sa Biochem (Thành phố Vĩnh Long) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật thực địa phịng thí nghiệm, mô tả đặc điểm theo hướng dẫn (Trần Văn Ơn, 2012) Mô tả vi phẫu: Thân, rễ Cắt, tẩy nhuộm tiêu theo phương pháp nhuộm kép Soi bột thân lên tiêu bột theo phương pháp giọt ép Quan sát cấu tạo giải phẫu đặc điểm bột dược liệu kính hiển vi, mô tả chụp ảnh máy ảnh kỹ thuật số (Nguyễn Viết Thân, 2003) 222 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Phương pháp giải trình tự ADN dựa đoạn gen rbcL Tách chiết ADN tổng số tinh ADN toàn phần tách từ tươi theo quy trình tách chiết phương pháp CTAB có cải tiến (Doyle, 1990) Trước tiên cân 100 mg mẫu cho vào cối nghiền mịn mL dung dịch CTAB 2X ủ 65 oC 15 phút Cho mẫu nghiền CTAB vào tuýp cho thêm CTAB, chuẩn lên vạch 1,5 mL Trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Sau ly tâm xong, rút tuýp 1000 µL lớp dịch bên cho vào Sau thêm vào 10 µL βmercaptoethanol/tp Tiến hành ủ nhiệt độ 65 oC 60 phút (mỗi 10 phút trộn mẫu lần) Tiếp theo cho thêm vào tuýp 500 µL chloroform, trộn đem ly tâm 13000 vòng 10 phút Hút 750 µL phần dung dịch bên cho vào mới, sau tiếp tục thêm vào 500 µL chloroform, trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Chuyển 550 µL dung dịch bên cho vào mới, sau thêm 500 µL chloroform vào tuýp ly tâm 13000 vòng 10 phút Rút 350 µL lớp dịch bên cho vào tuýp mới, sau thêm µL RNase vào tp, lắc ủ mẫu nhiệt độ 37 oC Sau ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 µL CTAB 2X 500 µL chloroform vào tuýp Đem mẫu ly tâm 13000 vòng 10 phút Tiếp theo rút tuýp 400 µL lớp dịch bên cho Số 09 - 2020 vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 µL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn ủ lạnh nhiệt độ -20 oC 30 phút Đem mẫu ly tâm 13000 vòng phút, tiến hành đổ bỏ cẩn thận phần dung dịch bên trên, giữ lại phần kết tủa lắng tụ bên Thêm 500 µL ethanol 70% vào tuýp ly tâm 13000 vòng phút để rửa mẫu, sau đổ bỏ phần cồn chừa lại kết tủa Thêm tiếp tục 500 µL ethanol 70% vào tuýp để rửa mẫu lần hai ly tâm 13000 vịng phút Sau đổ bỏ phần cồn lơng che chở đa bào gồm - tế bào hình chữ nhật Ở biểu bì có nhiều cụm mơ dày trịn Mô mềm vỏ mỏng, chiếm khoảng 1/5 - 1/6 bán kính vi phẫu, gồm khoảng 12 13 lớp tế bào hình bầu dục hay đa giác, kích thước nhỏ không đều, vách mỏng thẳng hay uốn lượn, xếp chừa đạo hay khuyết nhỏ Vịng mơ cứng gồm Số 09 - 2020 vài lớp tế bào hóa mơ cứng vách mỏng Mơ mềm tủy có khoảng 13 - 14 lớp tế bào, kích thước lớn nhỏ khơng đều, hình bầu dục hay đa giác, vách mỏng thẳng, có uốn lượn, xếp chừa đạo hay khuyết nhỏ Có nhiều chất nhựa màu nằm rải rác mô mềm vỏ, mơ mềm tủy Bó libe-gỗ kiểu bó chồng, bó libe chồng lên bó gỗ, xếp tập trung từ vịng mô cứng vào tủy tập trung tâm vi phẫu, kích thước bó khơng Bó gỗ gồm vài mạch tiền mộc - mạch hậu mộc to hình trịn hay bầu dục Bó libe gồm tế bào kích thước nhỏ Hình Vi phẫu thân Cutin; Mô dày; Mơ mềm vỏ; Bó gỗ; Biểu bì; Mơ mềm tủy; Bó libe; Vịng mơ cứng; Mạch hậu mộc Vi phẫu rễ Vi phẫu tiết diện trịn Từ ngồi vào có vêt tích tầng lơng hút, lớp tế bào, có cịn lơng hút, bong tróc nhiều Tầng hóa bần có vài lớp tế bào hình đa giác, kích thước khơng đều, lớp tế bào ngồi to nhất, vách tẩm bần mỏng hay cellulose dày, xếp khít nhau, xuyên tâm hay không Mô mềm vỏ dày, chiếm 2/3 bán kính vi phẫu, tế bào hình đa giác trịn hay trịn, vách mỏng, uốn lượn, khơng đều, xếp lộn xộn chừa khuyết to hay nhỏ Chất màu nằm rải rác mơ mềm Nội bì khung hình chữ u, gồm lớp tế bào hình đa giác hay bầu dục nằm Trụ bì gồm lớp tế bào hình đa giác, vách cellulose, xếp xen kẽ với nội bì Tám bó libe xếp xen kẽ bó gỗ vịng Libe tế bào hình đa giác, vách mỏng thẳng, uốn lượn, kích thước nhỏ Mỗi bó gỗ gồm - mạch hình trịn, mạch to nằm 229 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô bên (phân hóa hướng tâm) Mơ mềm tủy hẹp, bị chiếm vài mạch hậu Số 09 - 2020 mộc có kích thước to Hình Vi phẫu rễ Lơng che chở; Tần hóa bần; Mơ mềm vỏ; Libe; Mạch hậu mộc; Gỗ; Nội bì; Khối nhựa màu Đặc điểm bột dược liệu tế bào hình chữ nhật vách mỏng thẳng (2), lơng che chở đa bào (3), mạch vịng (4), mạch vạch (5) Tinh thể calci oxalat hình kim nằm rải rác hay tụ thành bó (6), tinh thể calci oxalat hình khối (7), tinh thể calci oxalat hình cầu gai (8), tinh bột (9), chất nhựa màu nằm rải rác (10) Bột thân Bột thân có màu khơ, khơng mùi, khơng vị Soi kính hiển vi thấy đặc điểm (hình 5): Mảnh mơ mềm tế bào vách mỏng, uốn lượn (1); mảnh biểu bì 2 Hình Đặc điểm bột thân 230 10 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Tách chiết ADN tổng số thực phản ứng nhân gen PCR ADN tổng số sau tách điện di gel agarose 1% cho vạch ADN rõ, không bị đứt gãy, băng điện di sạch, không lẫn ARN ADN tổng số sau Số 09 - 2020 thực phản ứng nhân gen với đoạn rbcL điện di so sánh với thang ladder chuẩn 1000 bp, cho thấy kích thước đoạn trình tự thu vào khoảng 600 bp, sản phẩm PCR tiếp tục tinh để thực phản ứng giải trình tự Hình Điện di sản phẩm PCR Hình Điện di ADN tổng số Trình tự đoạn gen rbcL Mẫu ADN sau giải trình tự thu 554 bp có 518 bp rõ (Hình 7), đưa vào để so sánh với trình tự cơng bố, tỷ lệ G-C 40 %, tỷ lệ A-T 60 % Công cụ NCBI/Blast sử dụng để so sánh kết trình tự mẫu nghiên cứu với trình tự công bố ngân hàng gen giới Kết cho thấy trình tự gen thu tương đồng với trình tự lồi Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong (mã hiệu ngân hàng gen: MH748823.1) công bố với số nucleotid tương đồng 518/519 (tương ứng tỷ lệ tương đồng 99,81%) Hình Kết giải trình tự đoạn gen rbcL mẫu Rau rươi Bắc máy ABI 3100 (Applied Biosystem, USA) đọc phần mền Bioedit 231 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 09 - 2020 Hình So sánh trình tự đoạn gen rbcL mẫu nghiên cứu với trình tự lồi cơng bố giới Kết trình bày Hình thể trình tự đoạn gen rbcL mẫu nghiên cứu với trình tự lồi cơng bố giới Trong đó, Query trình tự mẫu nghiên cứu Sbjct trình tự lồi Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong công bố ngân hàng gen giới (mã hiệu ngân hàng gen: MH748823.1) Kết giải trình tự gen so sánh trình tự gen Rau rươi bắc với trình tự gen loài Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong sở tin cậy để khẳng định tên khoa học Rau rươi bắc trồng quận Cái Răng, Thành Phố Cần Thơ là: Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) THẢO LUẬN Cây Rau rươi bắc thuộc họ Thài lài, họ có khoảng 40 chi 650 lồi, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, vùng cận nhiệt đới ơn đới Ở Trung quốc có 15 chi (2 lồi nghiên cứu) 59 loài (12 loài đặc hữu, loài nghiên cứu) (Hong Deyuan, 1997) Cây Rau rươi bắc phân bố Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Trung Quốc Lào, dùng làm thuốc viêm hạch lympho, tiểu đục, tiểu buốt, ghẻ lở (Võ Văn Chi, 2012) Hiện phân bố khu vực Đồng Sơng Cửu 232 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Long nói chung Thành phố Cần Thơ nói riêng có đặc điểm hình thái tương tự so với mô tả Từ điển thuốc Võ Văn Chi Kết nghiên cứu cung cấp thêm giải phẫu phận thân, lá, rễ, hoa, quả, hạt đặc điểm bột thân Rau rươi bắc Để góp phần hỗ trợ xác định tên khoa học thu hái lồi này, ngồi phương pháp phân tích đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu, so sánh tài liệu tham khảo chúng tơi cịn kết hợp sử dụng ADN mã vạch, – phương pháp tiên tiến sử dụng thành cơng định danh lồi giới để tiến hành giám định ADN mẫu Đối với Rau rươi bắc trồng Thành phố Cần Thơ, lần công bố kết sử dụng ADN mã vạch kết hợp đặc điểm hình thái, cấu trúc giải phẫu soi bột để định danh loài so với nghiên cứu trước chủ yếu dựa vào hình thái xác định ADN Kết tiền đề tạo sở giúp cho việc nhận diện dễ dàng, xác sử dụng lồi Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong, đặc biệt loài Rau rươi bắc trồng Thành phố Cần Thơ cho nghiên cứu sâu KẾT LUẬN Qua mô tả chi tiết đặc điểm hình thái (cơ quan dinh dưỡng quan sinh sản) phương pháp giải trình tự ADN dựa đoạn gen rbcL, nhóm tác giả xác định Rau rươi bắc trồng quận Cái Răng, Thành phố Cần thơ có tên khoa học Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex Số 09 - 2020 D.Y.Hong, thuộc họ Thài Lài Các đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu, đặc điểm bột thân lồi mơ tả đầy đủ Kết nghiên cứu cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu sâu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, giá trị sử dụng khả nhân giống trồng trọt loài TÀI LIỆU THAM KHẢO Doyle J.J., Doyle J.L., 1990 Isolation of Plant DNA from fresh tissue Focu 12(6) Pp.13 – 15 Hall T.A., 1999 BioEdit: a userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp Ser Pp 41:95-98 Hong Deyuan (1997) Commelinaceae In: Wu Kuo-fang, ed., Fl Reipubl Popularis Sin 13(3): 69133 Levin R.A., Wagner W.L., Hoch P.C., Nepokroeff M, Pires J.C, Zimmer E.A, Sytsma K.J., 2003 Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcLa and ndhF data, American Journal of Botany 90 p.107115 Mai Long, 2012 Dứt bao tử với thuốc lạ Báo pháp luật Việt Nam (26/6/2012) http://baophapluat.vn/noi-bat-tren-baoin/dut-con-dau-bao-tu-voi-cay-thuoc-la157242.html&prev=edir Ngày truy cập ngày 16 tháng năm 2020 233 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 09 - 2020 Nguyễn Hùng Mạnh, Chử Văn Mến, Vũ Đức Lợi Trần Xuân Linh, 2019 Chiết xuất, phân lập số hợp chất từ bao tử (Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong) Tạp chí Y dược lâm sàng 108 Tập 14 (6) Tr 116-122 11 Trần Văn Ơn, 2012 Thực vật nhận biết thuốc Trung tâm thông tin – Thư Viện – Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Viết Thân, 2003 Kiểm nghiệm dược liệu phương pháp hiển vi NXB Hà Nội 13 Wang G.J., Chen S.M., Chen W.C., Chang Y.M., and Lee T.H.,, 2007 Selective inducible nitric oxide synthase suppression by new bracteanolides from Murdannia bracteata Journal of Ethnopharmacology 112 Pp 221-227 Ooi K.L., Loh S.I., Tan M.L., Muhammad T.S.T., and Sulaiman S.F., , 2015 Growth inhibition of human liver carcinoma HepG2 cells and αglucosidase inhibitory activity of Murdannia bracteata (C.B.Clarke) Kuntze ex J.K Morton extracts Journal of Ethnopharmacology 162 Pp 55-60 Sanger S., Nicklen S., and Coulson A.R., 1977 DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74 (12) Pp 5463– 5467 12 Võ Văn Chi, 2012 Từ điển thuốc Việt Nam, tập NXB Y học, Hà Nội 14 Yam M.F., Ang L.F., Lim C.P., Ameer Q.Z., Salman I.M., Ahmad M., Mohammed M.A., Asmawi M.Z., Abdulkarim M.F., and Abdullah G.Z., 2010 Antioxidant and hepatoprotective effects of Murdannia bracteata methanol extract Journal of Acupuncture and Meridian Studies 3(3) Pp 197- 202 10 Takhtajan, A., 2009 “Flowering Plants”, Springer Science and Business Media, pp 472-478 234 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 09 - 2020 STUDY ON BOTANICAL CHARACTERISTICS AND DNA SEQUENCE-BASED CLASSIFICATION OF MURDANNIA BRACTEATE CULTIVATED IN CAN THO CITY Do Van Mai*, Thieu Van Duong, Vu Thi Binh, Pham Thanh Trong and Tran Cong Luan Faculty of Pharmacy and Nursery, Tay Do University (*Email: dvmai@tdu.edu.vn) ABSTRACT Murdannia bracteata is used as anti-inflammatory, analgesic, anti-ulcerative herbs,which helps to increase mucus in gastric mucosa, redu ces gastric acid secretion, treats many other diseases in inflammatory diseases such as hepatitis, Stomatitis, pneumonia, nephritis, diabetes In recent years, Murdannia bracteata has acted effectively to treat stomach aches, and therefore, many local people have named it as “stomach-grass” Although Murdannia bracteata has been popular as medicinal plant, research on this plant was rare Therefore, it is necessary to study the characteristics of its morphology, anatomy and to confirm its scientific name as the basis for further studies The results of the study have described in detail the anatomical characteristics of leaf, stem, root and powder parts of the leaves of Murdannia bracteata The scientific name of this plant was determined using DNA sequencing method based on the DNA code - rbcL gene fragment This is the first report on the anatomical structure of this plant compared to previous studies Keywords: Commelinaceae, Microscopical characteristic, Morphological characteristic, Murdannia bracteate 235 ... Thành phố Cần Thơ, lần công bố kết sử dụng ADN mã vạch kết hợp đặc điểm hình thái, cấu trúc giải phẫu soi bột để định danh loài so với nghiên cứu trước chủ yếu dựa vào hình thái xác định ADN Kết... phẫu, so sánh tài liệu tham khảo chúng tơi cịn kết hợp sử dụng ADN mã vạch, – phương pháp tiên tiến sử dụng thành cơng định danh lồi giới để tiến hành giám định ADN mẫu Đối với Rau rươi bắc trồng. .. dàng, xác sử dụng lồi Murdannia bracteata (C.B.Clarke) J.K.Morton ex D.Y.Hong, đặc biệt loài Rau rươi bắc trồng Thành phố Cần Thơ cho nghiên cứu sâu KẾT LUẬN Qua mô tả chi tiết đặc điểm hình thái