Nhận diện mẫu lan kim tuyến (anoectochilus) tại việt nam dựa trên đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự nucleotit gen phân loại

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, không trùng lặp với nghiên cứu khác Đặc biệt trình tự gen rpoC1 gen ITS lồi lan kim tuyến Thanh Hóa Sơn La kết đƣợc cơng bố bổ sung hữu ích Việt Nam góp phần xây dựng sở liệu mã vạch ADN cho loài lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume Việt Nam Thanh Hóa, ngày 10 tháng 11 năm 2019 Tác giả HV Lê Thị Ánh ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS Lê Đình Chắc Trƣởng Bộ mơn Sinh học, ngƣời thầy tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với tơi suốt thời gian thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Bộ môn Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trƣờng Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tơi xin cảm ơn giúp đỡ Phòng Quản lý Sau đại học Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ quý báu tất anh, chị em bạn lớp K10 cao học Thực vật học Cuối cùng, muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất ngƣời thân gia đình ln sát cánh bên tơi, quan tâm, động viên tạo điều kiện để hồn thành luận văn này! Thanh Hóa, ngày 10 tháng 11 năm 2019 HV Lê Thị Ánh iii MỤC LỤC Trang Contents LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 1.1.1.Vị trí phân loại chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 1.1.2 Giá trị dƣợc học chi Kim tuyến 1.2 Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 1.2.1 Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến Việt Nam 1.3 Thành phần hóa học có lan kim tuyến 1.4 Mã vạch ADN 10 1.4.1 Giới thiệu mã vạch ADN 10 1.4.2 Các đặc điểm trình tự mã vạch ADN 11 1.4.3 Một số trình tự đƣợc sử dụng mã vạch ADN thực vật 12 1.4.3.1 Vùng gen nhân mã hóa ribosome 12 1.4.3.2 Gen lục lạp 13 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 iv 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 16 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất, thiết bị máy móc 16 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu 16 2.2.2 Phƣơng pháp lập tiêu giải phẫu lá, thân, rễ 16 2.2.3 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 17 2.2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 17 2.2.3.2 Phƣơng pháp nhân gen rpoCl, ITS kĩ thuật PCR 18 2.2.3.3 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 19 2.2.3.4 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1, ITS 20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Đặc điểm hình thái, phân bố chi Kim tuyến Việt Nam 21 3.1.1 Đặc điểm hình thái 21 3.1.2 Kết so sánh hình thái hai mẫu lan kim tuyến thu Sơn La Thanh Hóa 22 3.2 Kết so sánh giải phẫu hai mẫu lan kim tuyến thu Sơn La Thanh Hóa 25 3.2.1 Kết so sánh giải phẫu 25 3.2.2 Kết so sánh giải phẫu thân 26 3.2.3 Kết so sánh giải phẫu rễ 27 3.3 Kết phân tích gen phân loại hai mẫu lan kim tuyến thu Sơn La Thanh Hóa 28 3.3.1 Kết phân tích gen rpoC1 28 3.3.1.1 Đặc điểm trình tự rpoC1 phân lập từ mẫu lan kim tuyến thu Sơn La Thanh Hóa 28 3.3.1.2 Kết phân tích trình tự gen rpoC1 thu đƣợc với trình tự gen rpoC1 cơng bố gen banks 30 v 3.3.2 Kết phân tích trình tự gen ITS 33 3.3.2.1 Kết phân tích trình tự mẫu gen ITS lan kim tuyến thu đƣợc Sơn La Thanh Hóa 33 3.3.2.2 Kết phân tích trình tự vùng ITS thu đƣợc với trình tự vùng ITS mang mã số GQ382774 công bố ngân hàng gen quốc tế 35 3.3.3 Phân tích mối quan hệ loài lan kim tuyến thuộc chi Anoectochilus 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 Kết luận 45 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BioEdit DNAstar: Phần mềm Tin sinh học phân tích liệu ADN Blast : Basic Local Alignment Search Tool CTAB : Cetyl trimethyllammonium Bromide rpoC1 : RNA polymerase C gen PCR : Polymerase chain reaction ITS : Internal Transcribed Spacer LKTTH : Lan kim tuyến Thanh Hóa LKTSL : Lan kim tuyến Sơn La LKT : Lan kim tuyến DANH MỤC BẢNG Nội dung Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1 18 Bảng 3.1 Nồng độ độ tinh mẫu 28 Bảng 3.2 Kết so sánh trình tự gen rpoC1 mẫu thu đƣợc với gen rpoC1 gen bank mã số LC057212 32 Bảng 3.3 Kết so sánh trình tự gen ITS mẫu thu đƣợc với gen ITS gen bank mã số GQ328774 37 Bảng 3.4 Kết so sánh trình tự vùng ITS phân lập đƣợc với trình tự vùng ITS cơng bố ngân hàng gen mã số GQ328774; KM451731; KM451732; LT899899 42 vii DANH MỤC HÌNH Nội dung Trang Hình 3.1 Ảnh chụp mẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa 22 Hình 3.2 Mẫu lan kim tuyến thu Sơn La 23 Hình 3.3 Ảnh chụp mặt lan kim tuyến 23 Hình 3.4 Ảnh chụp mặt dƣới lan kim tuyến 24 Hình 3.5 Ảnh chụp lát cắt ngang lan kim tuyến thu 25 Thanh Hóa Sơn La Hình 3.6 Ảnh chụp lát cắt ngang thân mẫu lan kim tuyến 26 Hình 3.7 Ảnh chụp giải phẫu rễ hai mẫu lan kim tuyến nghiên 27 cứu Hình 3.8 Kết khuếch đại đoạn gen rpoC1 PCR 28 Hình 3.9 Kết so sánh hai trình tự gen rpoC1 thu đƣợc gen banks 31 Hình 3.10 Sơ đồ dựa trình tự nucleotide gen rpoC1 mẫu thu đƣợc với trình tự gen rpoC1 lồi 32 Anoectochilus emeiensis mã số LC057212 Hình 3.11 Kết khuếch đại vùng ITS PCR 33 Hình 3.12 Kết so sánh hai trình tự gen ITS thu đƣợc gen banks 37 Hình 3.13 Sơ đồ dựa trình tự gen ITS mẫu thu đƣợc với trình tự gen ITS lồi Anoectochilus setaceus Blume, mang mã số GQ328774 Hình 3.14 Kết so sánh hai trình tự gen ITS thu đƣợc với 38 số trình tự cơng bố gen banks 41 Hình 3.15 Sơ đồ dựa trình tự nucleotide vùng ITS mẫu thu đƣợc với trình tự vùng ITS công bố ngân hàng gen mã số GQ328774; KM451731; KM451732; LT899899 43 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) thuộc họ Lan (Orchidaceae Juss.), giới có khoảng 45 lồi Ở Việt Nam, theo Nguyễn Tiến Bân cộng (2005) chi Kim tuyến có 12 lồi [4] Trong năm lồi có tên Sách đỏ Việt Nam, là: Anoectochilus acalcaratus Aver., Anoectochilus calcareus Aver., Anoectochilus chapaensis Gagnep., Anoectochilus setaceus Blume, Anoectochilus tridentatus Seidenf ex Aver Theo Averyanov L (2008), chi Anoectochilus Blume Việt Nam có tổng số 30 lồi khu vực châu Á nhiệt đới [11] Chi nằm danh mục thực vật rừng nguy cấp, quý (nhóm IA) Nghị định số 32/2006/NĐ- CP ngày 30/3/2006 Chính phủ nghiêm cấm khai thác, sử dụng mục đích thƣơng mại Mặt khác, chi lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), có nhiều lồi nguồn ngun liệu dƣợc liệu quý, có giá trị sử dụng cao (đặc biệt dùng làm thuốc) nhƣ: Anoectochilus koshunensis, Anoectochilus sandvicensis, Anoectochilus zhejiangensis, Anoectochilus setaceus…đang đứng trƣớc nguy bị tuyệt chủng tự nhiên Ngày nay, với phát triển nhảy vọt hoạt động khoa học, đánh giá tầm quan trọng giá trị dƣợc liệu lồi Kim tuyến Từ nâng cao nhận thức việc bảo vệ, phát triển nguồn gen khai thác hợp lý loài Kim tuyến Tuy nhiên, Việt Nam nay, nghiên cứu chi Kim tuyến cịn hạn chế Vì việc cung cấp thêm liệu khoa học cho chi cần thiết cấp bách, góp phần vào việc bảo tồn, phát triển nguồn gen khai thác hợp lý nguồn dƣợc liệu q Do đó, chúng tơi chọn “Nhận diện mẫu lan Kim Tuyến (Anoectochilus) Việt Nam dựa đặc điểm hình thái, giải phẫu trình tự nucleotit gen phân loại” Mục tiêu nghiên cứu Phân tích đƣợc đặc điểm hình thái, giải phẫu, trình tự gen rpoC1 vùng ITS nhằm xác định mối quan hệ chủng loài hai mẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa Sơn La, góp phần việc tƣ liệu hóa phục vụ bảo tồn, lƣu giữ nguồn gen loài lan kim tuyến Việt Nam Nội dung nghiên cứu i) Nghiên cứu so sánh đặc điểm hình thái ii) Nghiên cứu so sánh đặc điểm giải phẫu lá, thân, rễ lan kim tuyến thu Thanh Hóa Sơn La iii) Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide gen rpoC1 vùng ITS mẫu nghiên cứu so sánh với số trình tự nucleotide gen rpoC1 ITS lan kim tuyến công bố Ngân hàng gen quốc tế Chƣơng 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 1.1.1.Vị trí phân loại chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Chi Kim tuyến (Anoectochilus) đƣợc Carlvon Blume mô tả lần năm 1825, chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidaceae) Trên giới, chi có khoảng 45 lồi [32]; [33] Danh sách loài thuộc chi Kim tuyến (nguồn: https://www.theplantlist.org) Anoectochilus albolineatus E.C.Parish & Rchb.f Anoectochilus albomarginatus Loudon Anoectochilus annamensis Aver Anoectochilus baotingensis (K.Y.Lang) Ormerod Anoectochilus brevilabris Lindl Anoectochilus burmannicus Rolfe Anoectochilus calcareus Aver Anoectochilus chapaensis Gagnep Anoectochilus daoensis Gagnep 10 Anoectochilus dewildeorum Ormerod 11 Anoectochilus elatus Lindl 12 Anoectochilus emeiensis K.Y.Lang 13 Anoectochilus falconis Ormerod 14 Anoectochilus flavescens Blume 15 Anoectochilus formosanus Hayata 16 Anoectochilus geniculatus Ridl 17 Anoectochilus grandiflorus Lindl 18 Anoectochilus hainanensis H.Z Tian, F.W Xing& L.Li 19 Anoectochilus imitans Schltr 20 Anoectochilus insignis Schltr 21 Anoectochilus integrilabris Carr 22 Anoectochilus kinabaluensis (Rolfe) J.J.Wood & Ormerod 23 Anoectochilus klabatensis (Schltr.) S Thomas 43 Để kiểm tra quan hệ di truyền mẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa, Sơn La lồi cơng bố ngân hàng gen quốc tế, chúng tơi tiếp tục lập sơ đồ (hình 3.15) Sự sai khác quan hệ di truyền trình tự vùng ITS nói đƣợc thể sơ đồ mẫu thu đƣợc trình tự cơng bố ngân hàng gen Quốc tế (hình 3.15) Hình 3.15 Sơ đồ dựa trình tự nucleotide vùng ITS mẫu thu với trình tự vùng ITS cơng bố ngân hàng gen mã số GQ328774; KM451731; KM451732; LT899899 Kết hình 3.15 cho thấy, trình tự ITS mẫu lan kim tuyến thu đƣợc Thanh Hóa, Sơn La trình tự ITS mã số LT899899 có nhành quan hệ di truyền Ba trình tự vùng ITS mang mã số GQ328774; KM451731; KM451732 thuộc hai nhành khác nhau, nhiên sai khác quan hệ di truyền không cao (0,2) Trong đó, trình tự mang mã số LT899899; GQ328774 MK451731 đƣợc xác định loài Anoectochilus roxburghii, kết luận trình tự ITS chúng tơi thu đƣợc trình tự ITS công bố gen banks mang mã số LT899899; GQ328774 MK451731 loài Vậy, từ kết phân tích đặc điểm hình thái, giải phẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa Sơn La với việc phân tích đặc điểm trình tự vùng gen rpoC1 vùng ITS phân lập từ mẫu lan kim tuyến thu đƣợc, kết luận rằng, mẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa Sơn La thuộc loài Anoectochilus setaceus Blume hay gọi Anoectochilus roxburghii 44 Điều khẳng định độ tin cậy sử dụng thị phân tử phân loại học nói chung, phân loại thực vật học nói riêng 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Về hình thái lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus): rễ ngắn, yếu, dễ gãy mang nhiều lơng tơ, khơng có khả xuyên sâu; thân mọng nƣớc, thƣờng có màu nâu sẫm, gần nhƣ không phân nhánh, dài khoảng 25 35 cm; có phần bẹ ngắn ơm lấy thân, phiến có - đƣờng gân sọc chạy dọc đƣợc phủ lớp nhung mềm, óng ánh, mặt chủ yếu màu xanh tím, mặt dƣới chủ yếu màu nâu tím; Hoa có màu trắng, lơng nhung nhiều, hoa mọc đỉnh thân, cành, cành thân mọc hoa vào tháng 10 -12 1.2 Về giải phẫu lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus): hai mẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa Sơn La bao gồm lớp tế bào: biểu bì trên, mơ dậu, thịt lá, bó dẫn, mơ xốp, biểu bì dƣới; thân bao gồm lớp tế bào: biểu bì, mơ dày; mơ mềm vỏ; vỏ trụ; gỗ sơ cấp, tia ruột; mô mềm ruột; rễ gồm lớp tế bào: lơng hút, biểu bì, mô mềm vỏ, đai caspari, gỗ, libe, mô mềm ruột có cách xếp hình dạng tƣơng tự 1.3 Kích thƣớc đoạn gen rpoC1 phân lập từ lan kim tuyến Thanh Hóa Sơn La 628 bp vùng ITS 667 bp Kết phân tích đặc điểm hình thái, giải phẫu trình tự đoạn gen rpoC1 vùng ITS chứng minh mẫu lan kim tuyến thu Thanh Hóa Sơn La thuộc loài Anoectochilus setaceus Blume Đề nghị 2.1 Cần tiếp tục nghiên cứu đặc điểm thực vật học trình tự gen lục lạp phục vụ thiết lập mã vạch ADN cho loài lan kim tuyến Việt Nam nói chung, Thanh Hóa, Sơn La nói riêng 2.2 Cần tiếp tục nghiên thành phần hóa học lan kim tuyến nhằm khai thác bảo tồn cách khoa học cho lan kim tuyến Việt Nam 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ khoa học Công nghệ, Viện Khoa học công nghệ Việt Nam (2007), Sách Đỏ Việt Nam Phần 2- Thực vật, tr 401- 406, NXB KHTN&CN Hội dƣợc liệu Việt Nam (2013), Tạp chí thuốc q tồn tập, tr 13-15 Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật (Methods of plant research), tr 23-27, NXB ĐH Quốc Gia HN Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) (2005), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập III, tr 516-518, NXB Nông nghiệp Nguyễn Thiện Tịch (2001), Lan Việt Nam Quyển 1, tr 170-189, Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyen Quynh Nga, Pham Thanh Huyen, Phan Van Trung, Hoang Van Toan (2016), Taxonomy of the genus Paris L (Melanthiaceae) in Viet Nam, pp 333-339, Tạp chí Sinh học 38(3) Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam - 2, tập II tr 305 - 306 Viện Điều tra Quy hoạch Rừng (2010), Điều tra đánh giá tình trạng bảo tồn lồi thực vật rừng nguy cấp, quý thuộc danh mục nghị định 32/2006/NĐ-CP theo vùng sinh thái, Báo cáo dự án, Tổng cục Lâm nghiệp, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Tài liệu tiếng Anh Aron J F., Kevin S B., Prasad R K., Sean W G., Steven G N., Brian C H., Diana M P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C H B (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well” PLoS ONE, 3(7), pp 2802 10 Averyanov LV, Averyanova AL, Phan KL, Nguyen TH (2009), Orchid flora of Vietnam: New discoveries and some of their characteristics.Advances in Natural Sciences, 10: 353-365 11 Averyanov, L (2008) The orchids of Vietnam illustrated survey, part Turczaninowia, 11: 5–168 47 12 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 13 Cai JY1, Gong LM, Zhang YH, Ruan HL, Pi HF, Wu JZ (2008) “Studies on chemical constituents from Anoectochilus roxburghii” Zhong Yao Cai 31(3), pp 370-372 14 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and longterm goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 18891895 15 He CN1, Wang CL, Guo SX, Yang JS, Xiao PG (2005), “Study on chemical constituents in herbs of Anoectochilus roxburghii II” Zhongguo Zhong Yao Za Zhi May;30(10),pp 761-763 16 Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PLoS ONE, (5) 17 International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN) (2010), IUCN Red List Categories and Criteria, Version 3.1 [S] Gland, Switzerland, IUCN & United Kingdom: Cambridge, pp: 28–43 18 Kim S, Kim J, Liu J (2009) Genetic discrimination of Catharanthus roseus cultivars by pyrolysis mass spectrometry J Plant Biol 52: 462465 doi:10.1007/s12374-009-9059-1 19 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 20 Sandelius, Anna Stina (2009) The Chloroplast Interactions with the Environment Springer p 18 ISBN 978-3-540-68696-5 21 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 48 22 Shaghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W (1984) Ribosomal DNAsepacer-length polymorphism in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics Proc Natl Acad Sci 81: 8014–8019 23 Paul D N Hebert*, Alina Cywinska, Shelley L Ball and Jeremy R deWaard (2003) Biological identifications through DNA barcodes Proc R Soc Lond B (2003) 270, 313-321 313 Ó 2003 The Royal Society DOI 10.1098/rspb.2002.2218 24 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 25 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 26 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 27 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 28 Wouter G van Doorn (2009), Role of chloroplasts and other plastids in ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva Ageing research reviews, (2) :117-30 DOI: 10.1016/j.arr.2009.08.003 29 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 49 30 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Tài liệu internet 31 http://www.kew.org/barcoding/protocols.html 32 http://www Theplantlist.org 33 http://www Tropicos org 34 http://en.wikipedia.org/wiki/IUCN_Red_List P1 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng so sánh rpoC1 LKT Thanh Hóa, Sơn La gen banks P2 Phụ lục 2: Kết Blats rpoC1 LKT Thanh Hóa, Sơn La gen banks P3 P4 Phụ lục Bảng so sánh ITS LKT Thanh Hóa, Sơn La gen banks P5 Phụ lục 4: Kết Blats ITS LKT Thanh Hóa, Sơn La gen banks P6 P7 P8