Nghiên cứu trồng thử nghiệm lan kim tuyến (anoectochilus roxburghii (wall ) lindl ) nuôi cấy in vitro tại bán đảo sơn trà, thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TRỒNG THỬ NGHIỆM LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) NUÔI CẤY IN VITRO TẠI BÁN ĐẢO SƠN TRÀ, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG TRẦN THỊ ANH PHƯƠNG Đà Nẵng, năm 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TRỒNG THỬ NGHIỆM LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) NUÔI CẤY IN VITRO TẠI BÁN ĐẢO SƠN TRÀ, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG Ngành : Công nghệ sinh học Khóa : 2019-2023 Sinh viên : Trần Thị Anh Phương Người hướng dẫn : TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tơi thực hướng dẫn TS Võ Châu Tuấn chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Đà Nẵng, tháng năm 2023 Sinh viên Trần Thị Anh Phương i LỜI CẢM ƠN Qua năm học tập rèn luyện Khoa Sinh – Môi Trường - Đại học Sư Phạm Đà Nẵng, với bảo giảng dạy nhiệt tình Thầy Cơ giúp cho em tiếp thu kiến thức lý thuyết thực hành vơ hữu ích Khóa luận kết việc tiếp thu, vận dụng kiến thức học cố gắng nỗ lực thân em Khoa Sinh – Môi Trường - Đại học Sư Phạm Đà Nẵng phịng Cơng nghệ Nuôi cấy mô Tế bào Thực vật Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Võ Châu Tuấn trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để em nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại Học Sư Phạm – Đại Học Đà Nẵng thầy cô Bộ môn công nghệ Sinh Học tạo môi trường thuận lợi, cung cấp đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ cho em thực đề tài cách thuận tiện Đây hành trang vơ q giá để em bước vào nghiệp tương lai Sau em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người theo sát động viên, quan tâm tạo điều kiện thời gian em thực khóa luận Trong q trình nghiên cứu đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp q báu Thầy Cơ để khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan Kim tuyến .4 1.1.1 Đặc điểm phân bố 1.1.2 Đặc điểm hình thái .4 1.1.3 Thành phần hóa học 1.2 Giới thiệu nuôi cấy mô thực vật nhân giống in vitro 1.2.1 Các giai đoạn nhân giống in vitro thực vật .7 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống vô tính in vitro thực vật 1.3 Một số yếu tố ươm trồng ảnh hưởng đến sinh trưởng trồng .12 1.3.1 Giá thể trồng 12 1.3.2 Phân bón 13 1.4 Các nghiên cứu lan Kim tuyến 15 1.4.1 Nghiên cứu nước 15 1.4.2 Nghiên cứu Thế Giới 17 1.5 Giới thiệu sơ lược điều kiên tự nhiên bán đảo Sơn Trà – Đà Nẵng 20 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 iii 2.2 Phạm vi nghiên cứu 21 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp tạo giống lan Kim tuyến nuôi cấy in vitro điều kiện vườn ươm bán đảo Sơn – Đà Nẵng 22 2.4.2 Phương pháp trồng sản xuất lan Kim tuyến từ giống nuôi cấy in vitro điều kiện nhà lưới bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng 23 2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng số 24 2.4.5 Phương pháp xử lý thống kê 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .26 3.1 Nghiên cứu tạo giống lan Kim tuyến nuôi cấy in vitro điều kiện vườn ươm bán đảo Sơn – Đà Nẵng 26 3.1.1 Ảnh hưởng chiều cao lan Kim tuyến nuôi cấy in vitro đến khả sinh trưởng giống ươm trồng vườn ươm 26 3.1.2 Ảnh hưởng tuổi lan Kim tuyến nuôi cấy in vitro đến khả sinh trưởng giống ươm trồng vườn ươm 30 3.2 Nghiên cứu trồng sản xuất lan Kim tuyến từ giống nuôi cấy in vitro điều kiện nhà lưới bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng 33 3.2.1 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng lan Kim tuyến trồng điều kiện nhà lưới 33 3.2.2 Ảnh hưởng phân bón đến sinh trưởng lan Kim tuyến trồng điều kiện nhà lưới 35 3.3 Đánh giá hàm lượng flavonoid tổng số tích lũy lan Kim tuyến trồng điều kiện nhà lưới bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 Kết luận 39 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 Tiếng Việt 40 Tiếng Anh 43 iv DANH MỤC VIẾT TẮT BAP 6-Benzyl Amino Purine ĐHST Điều hòa sinh trưởng KIN Kinetin GA3 Gibberellin MS Murashige – Skoog NAA Napthalene Acetic Acid PBLs Protocorm like body Cs Cộng v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Tên bảng Khả sinh trưởng in vitro có kích thước - 2,5 cm sau 30, 45, 60 ngày ươm trồng điều kiện vườn ươm Trang 28 Ảnh hưởng in vitro kích thước – 3,5 cm sau 30, 45, 60 3.2 ngày ươm trồng đến khả tạo giống in vitro điều 29 kiện vườn ươm Ảnh hưởng tuổi in vitro đến tỷ lệ sống sót sinh 3.3 trưởng giống lan Kim tuyến giá thể xơ dừa sau 60 31 ngày trồng điều kiện vườn ươm 3.4 3.5 3.6 Ảnh hưởng loại giá thể đến sinh trưởng lan Kim tuyến điều kiện nhà lưới sau 60 ngày trồng Ảnh hưởng số loại phân bón đến sinh trưởng phát triển lan Kim tuyến điều kiện nhà lưới Sinh khối tươi khô mẫu lan Kim tuyến sau tháng trồng nhà lưới Bán đảo Sơn Trà vi 34 36 38 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình trang 2.1 Chồi lan Kim tuyến ni cấy in vitro 22 3.1 Lan kim tuyến nuôi cấy in vitro phịng thí nghiệm 27 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Chồi in vitro lan kim tuyến hình thành rễ sau tuần nuôi cấy Cây giống lan Kim tuyến in vitro kích thước - 2,5 cm ươm trồng điều kiện vườn ươm Cây giống lan Kim tuyến ươm trồng vườn ươm từ in vitro kích thước lớn (3 - 3,5 cm) Cây lan kim tuyến in vitro (45 ngày tuổi) sinh trưởng điều kiện vườn ươm Giống lan Kim tuyến ươm trồng sau tháng vườn ươm từ in vitro độ tuổi khác 28 29 29 31 32 Sinh trưởng lan Kim tuyến sau 60 ngày trồng 3.7 chất tốt (xơ dừa : đất cát : Phân chuồng ủ hoai : 33 :2 :1) 3.8 3.9 3.10 Lan kim tuyến sau 60 ngày trồng điều kiện nhà lưới loại chất khác Lan kim tuyến sau 60 ngày trồng điều kiện nhà lưới với loại phân bón khác Sinh khối lan Kim tuyến 34 36 37 vii TÓM TẮT Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii) dược liệu quý sử dụng thuốc cổ truyền cộng đồng dân tộc thiểu số Việt Nam Các loài lan Kim tuyến phân bố rộng số lượng cá thể tự nhiên không nhiều khả tái sinh chậm, địi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo, ngồi ra, lan Kim tuyến bị khai thác mức có nhiều dược tính quý Nghiên cứu tiến hành nhằm xây dựng quy trình trồng thử nghiệm lan Kim tuyến nuôi cấy in vitro điều kiện nhà lưới Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng Kết nghiên cứu cho thấy: Lan Kim tuyến nuôi cấy in vitro (chiều cao khoảng - 3,5 cm, 45 ngày tuổi) trồng điều kiện nhà lưới loại giá thể trồng: Đất cát: xơ dừa: phân chuồng (2:2:1); bón bổ sung phân hữu vi sinh sông Gianh (200 g/m2) phân đạm cá (2,5ml/m2) Sau tháng trồng lan Kim tuyến sinh trưởng tốt, đạt chiều dài thân khoảng 7,90 – 8,93 cm với số - lá/cây ; có khỏe, có màu xanh pha hồng sẫm Các lan Kim tuyến có nguồn gốc ni cấy in vitro tháng tuổi cho khả tích lũy hàm lượng flavonoid tồng số đạt 5,198 ± 0,0028 (mg/g bột dược liệu khô) Đây sở cho việc chủ động sản xuất nhanh, liên tục, quy mô lớn nguồn giống lan Kim tuyến có chất lượng tốt Đà Nẵng Giúp mở rộng trồng sản xuất nguyên liệu dược liệu khu vực miền Trung để đáp ứng nhu cầu nguyên liệu làm thuốc Vì cần khảo sát thêm số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển giống lan Kim tuyến ni cấy mơ điều kiện ngồi tự nhiên (dưới tán rừng) Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng Từ khóa: lan Kim tuyến, họ Lan, giống, tiêu chuẩn, in vitro, nuôi cấy mô, bán đảo Sơn Trà viii Hình 3.5 Cây lan Kim tuyến in vitro (45 ngày tuổi) sinh trưởng điều kiện vườn ươm Số liệu phân tích Bảng 3.3 cho thấy tuổi in vitro có ảnh hưởng đến phát triển sinh trưởng lan Kim tuyến điều kiện vườn ươm Ớ in vitro 30 ngày tuổi có chiều dài thân 5,76 cm Khi độ tuổi từ 45 – 60 ngày tốc độ tăng trưởng mạnh chiều cao 6,40 7,09 Q trình tiến hành thí nghiệm thấy rằng, 30 ngày tuổi việc ươm trồng thường dễ làm tổn thương rễ, dẫn đến vi sinh vật gây hại xâm nhập làm thối chết Mặt khác, độ tuổi nhỏ, dẫn đến q trình chăm sóc thường làm giá thể bám dính vào gây ảnh hưởng đến q trình hơ hấp quang hợp, làm giảm khả thích nghi Phân tích số rễ/cây nhận thấy, số rễ/ thấp 30 ngày (1,50) Giá trị khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với 60 ngày không khác biệt mặt thống kê với 45 ngày (Bảng 3.3) Đánh giá điện tích cho thấy, thí nghiệm 45 60 ngày có diện tích cao so với 30 ngày tuổi Diện tích 30,45 60 ngày tuổi 3,32; 3,85; 4,45 Dựa vào bảng số liệu cho thấy, 60 ngày vượt trội 45 ngày tuổi Tuy nhiên chọn 60 ngày tuổi để làm giống, gặp phải số khó khăn ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Điều cho thấy 60 ngày tuổi đạt độ tuổi lớn gặp khó khăn việc thích nghi với mơi trường sản xuất khó khăn việc thiết lập hệ rễ hệ lá, đó, tốc độ sinh trưởng bị ảnh hưởng Ngồi ra, 60 ngày tuổi có khả chịu đựng so với 45 ngày tuổi môi trường sản xuất Cây q già khơng đáp ứng tốt với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm môi trường điều kiện khác q trình chăm sóc phát triển Do đó, việc chọn 60 ngày tuổi làm giống không đảm bảo hiệu khả sinh trưởng cao mong đợi Vì vậy, để đảm bảo tốc độ sinh 31 trưởng tốt khả thích nghi môi trường sản xuất, lựa chọn 45 ngày tuổi hợp lý Cây 45 ngày tuổi đủ trưởng thành để phát triển hệ rễ hệ tốt, đủ nhỏ để khơng gặp phải vấn đề tổn thương khó khăn q trình chăm sóc thích nghi với môi trường Như vậy, chồi lan Kim tuyến cao khoảng - 3,5 cm, nuôi cấy tạo in vitro khoảng 45 ngày tuổi phù hợp để chuyển sản xuất giống điều kiện vườn ươm tự nhiên Bán đảo Sơn Trà, cho tỷ lệ sống đạt 100% Kết chứng tỏ độ tuổi in vitro tiêu chí quan trọng để lựa chọn giống in vitro lan Kim tuyến đưa vườn ươm trồng cho tỷ lệ sống cao ổn định Tiêu chí lần đề cập xác định Việt Nam đối tượng lan Kim tuyến in vitro Các nghiên cứu trước khơng đề cập đến chất lượng độ tuổi giống đưa vườn ươm, mà trọng đến khảo sát khả thích nghi với điều kiện sinh thái khác Hình 3.6 Giống lan Kim tuyến ươm trồng sau tháng vườn ươm từ in vitro độ tuổi khác (A) in vitro 30 ngày tuổi; (B) in vitro 45 ngày tuổi (C) in vitro 60 ngày tuổi; Thanh bar (-) tương ứng cm Một số nghiên cứu cho thấy, tuổi in vitro ảnh hưởng đến sinh trưởng thực vật Trần Tư Khoa cs (2021) nghiên cứu thành công độ tuổi in vitro đến sinh trưởng Plumbago indica L sau nuôi cấy exvitro Kết cho thấy, phát triển chồi rễ giai đoạn ex vitro in vitro 42 ngày tuổi 49 ngày tuổi cân đối hơn, thể qua tỷ lệ trọng lượng khô chồi/rễ cao so với in vitro 35 ngày tuổi Kết nghiên cứu cho thấy, loài P indica này, ống nghiệm lớn dẫn đến tăng trưởng tốt giai đoạn ống nghiệm Kết rằng, chuyển P indica in vitro sang điều kiện ex vitro sau tuần nuôi cấy in vitro [26] Trong nghiên cứu chúng tôi, lan Kim tuyến in vitro 45 ngày tuổi 32 thích hợp để đưa sản xuất giống điều kiện vườn ươm, cung cấp nguồn giống phục vụ trồng sản xuất nguyên liệu dược liệu lan Kim tuyến quy mô lớn 3.2 Nghiên cứu trồng sản xuất lan Kim tuyến từ giống nuôi cấy in vitro điều kiện nhà lưới bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng 3.2.1 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng lan Kim tuyến trồng điều kiện nhà lưới Giá thể đóng vai trị quan trọng trình sinh trưởng phát triển, chỗ bám vững cho hình thành rễ Giá thể thích hợp giúp rễ hút nước dinh dưỡng thuận lợi, thúc đẩy sinh trưởng phát triển, đảm bảo suất cao Ở giai đoạn này, tiến hành trồng giống lan Kim tuyến giá thể khác nhà lưới: đất cát, xơ dừa phân chuồng hoai mục (2:2:1), đất cát, xơ dừa vỏ trấu: phân chuồng hoai mục (2:2:2:1), đất cát phân chuồng hoai mục (1:1) Sau 60 ngày trồng loại giá thể khác nhau, tiến hành đánh giá tỷ lệ sống, sinh trưởng lan Kim tuyến điều kiện nhà lưới, kết thu trình bày bảng 3.4 Hình 3.7 Sinh trưởng lan Kim tuyến sau 60 ngày trồng chất xơ dừa, đất cát phân chuồng hoai mục (2:2:1) 33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng loại giá thể đến sinh trưởng lan Kim tuyến điều kiện nhà lưới sau 60 ngày trồng Loại giá thể trồng Đất cát phân chuồng hoai mục (1:1) Xơ dừa, đất cát phân chuồng hoai mục (2:2:1) Xơ dừa, vỏ trấu, đất cát phân chuồng ủ hoai : (2:2:2:1) Khả sinh trưởng lan Kim tuyến Tỷ lệ Diện tích Chiều dài sống Số lá/cây (cm2) thân (cm) (%) 100 5,60±0,52b 5,80±0,42ab 7,63±0.50b 100 6,00±0,00a 6,49±0,38a 8,39±0.40a 100 5,60±0.52b 4,69±0,64b 7,28±0.45b Các chữ khác tiêu thể sai khác có ý nghĩa thống kê nghiệm thức theo Fisher’s, với mức ý nghĩa p