Chủ Đề Kết Thúc Khuếch Đại Nhanh Chóng Cdna.pdf

lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM - - KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM CÔNG NGHỆ - - KHÓA HỌC CHUYÊN ĐỀ Chủ đề: KẾT THÚC KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA Người hướng dẫn: NGƯT Nguyễn Minh Xuân Hồng Chuyên ngành đào tạo: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (CLC) Lớp: DH20BQC Người thực hiện: Nguyễn Lê Khang – 20125448 Lưu Thị Mỹ Linh – 20125479 Hà Huỳnh Nhi – 20125578 Thủ Đức, tháng năm 2023 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google NHÌ N NHẬN Chúng muốn bày tỏ lịng biết ơn chúng tơi để MRS NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG hướng dẫn cung cấp kiến thức cho chúng em suốt trình học tập nên tơi làm tiểu luận: 'KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG CỦA CDNA KẾT THÚC' Mặc dù cố gắng hết sức, thiếu kiến thức nghiên cứu, tiểu luận cịn sai sót, thiếu xác Vì mong nhận tư vấn bạn giúp cải thiện thời gian tới Xin chân thành cảm ơn chúc quý khách sức khỏe, thành công công việc đường dạy học! Thủ Đức, tháng năm 2023 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google BÌ NH LUẬN Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google MỤC LỤC NHÌ N NHẬN NHẬN XÉT I cDNA LÀ GÌ ? Định nghĩa Tổng hợp Ứng dụng Virus retrotransposon II KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG CỦA CDNA KẾT THÚC (RACE) Định nghĩa số Lịch sử Quy trình Ứng dụng III 3´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC 10 Định nghĩa 10 Phân lập RNA tổng số 10 Tổng hợp cDNA sợi từ RNA tổng số 11 Khuếch đại cDNA mục tiêu 11 Thiết kế đoạn mồi dành riêng cho gen 11 Khuếch đại lồng 12 IV 5´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC 12 Định nghĩa 12 Phân lập RNA tổng số 12 Thiết kế mồi 5' RACE 12 Tổng hợp cDNA sợi thứ từ RNA tổng số 13 Loại bỏ RNA khuôn mẫu RNase Mix 13 TÀI KHOẢN THAM KHẢO 14 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google I CDNA LÀ GÌ ? Xác định Trong di truyền học, DNA bổ sung (cDNA) DNA tổng hợp từ mẫu RNA sợi (ví dụ: RNA thông tin (mRNA) microRNA (miRNA)) phản ứng xúc tác enzyme chép ngược cDNA thường sử dụng để biểu loại protein cụ thể tế bào mà bình thường khơng biểu protein (tức là, biểu khác loại), để giải trình tự định lượng phân tử mRNA cách sử dụng DNA phương pháp dựa (qPCR, RNA-seq) cDNA mã hóa cho loại protein cụ thể chuyển đến tế bào nhận để biểu hiện, thường biểu vi khuẩn nấm men hệ thống cDNA tạo để phân tích hồ sơ phiên mã mô số lượng lớn, tế bào đơn lẻ nhân đơn lẻ xét nghiệm microarrays, qPCR RNA-seq cDNA tạo cách tự nhiên retrovirus (chẳng hạn HIV-1, HIV-2, simian virus gây suy giảm miễn dịch, v.v.) sau tích hợp vào gen vật chủ, nơi tạo provirus Thuật ngữ cDNA sử dụng, điển hình bối cảnh tin sinh học, để trình tự phiên mã mRNA, biểu thị dạng sở DNA (deoxy-GCAT) so với sở RNA (GCAU) Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google Tổng hợp RNA đóng vai trị khn mẫu để tổng hợp cDNA Trong đời sống tế bào, cDNA tạo virus retrotransCPons để tích hợp RNA vào mục tiêu DNA gen Trong sinh học phân tử, RNA tinh chế từ vật liệu nguồn sau DNA gen, protein thành phần tế bào khác bị loại bỏ cDNA tổng hợp thông qua phiên mã ngược in vitro Ứng dụng DNA bổ sung thường sử dụng nhân gen làm đầu dò gen tạo thư viện cDNA Khi nhà khoa học chuyển gen từ tế bào vào tế bào khác để biểu vật liệu di truyền dạng protein tế bào nhận, cDNA thêm vào tế bào nhận (chứ khơng phải tồn gen), DNA tồn gen bao gồm DNA khơng mã hóa cho gen protein làm gián đoạn trình tự mã hóa protein (ví dụ: intron) phần trình tự cDNA thường thu dạng thẻ trình tự biểu thị Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google cDNA sử dụng để nghiên cứu biểu gen thông qua phương pháp RNA-seq RT qPCR Để giải trình tự, RNA phải phân mảnh kích thước tảng giải trình tự hạn chế Ngoài ra, cDNA tổng hợp chuỗi thứ hai phải nối với điều hợp cho phép đoạn cDNA khuếch đại PCR liên kết với trình tự tế bào dòng chảy Các phương pháp phân tích gen cụ thể thường sử dụng microarrays RT qPCR để định lượng mức cDNA thông qua phép đo huỳnh quang phương pháp khác Vào ngày 13 tháng năm 2013, Tòa án Tối cao Hoa Kỳ phán trường hợp Hiệp hội cho Bệnh học phân tử v Myriad Genetics mà người xuất tự nhiên gen cấp sáng chế, cDNA đủ điều kiện cấp sáng chế khơng xảy cách tự nhiên Virus retrotransposon Một số virus sử dụng cDNA để biến RNA virus chúng thành mRNA (RNA virus cADN mARN) MRNA sử dụng để tạo protein virus để chiếm lấy vật chủ tế bào Một ví dụ bước từ RNA virus đến cDNA nhìn thấy HIV chu kỳ lây nhiễm Tại đây, màng tế bào chủ gắn vào virus' vỏ lipid cho phép capsid virus có hai RNA gen virus để vào máy chủ Bản cDNA sau thực thơng qua phiên mã ngược RNA virus, trình hỗ trợ CypA kèm capsid virus phiên mã ngược liên kết cDNA tạo retrotransposon gen sinh vật nhân chuẩn Retrotransposon yếu tố di truyền di động tự di chuyển bên gen thông qua trung gian RNA Cơ chế chia sẻ với virus với việc loại trừ việc tạo hạt truyền nhiễm Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google II KHAI THÁC NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC (RACE) Xác định Khuếch đại nhanh đầu cDNA (RACE) kỹ thuật sử dụng phân tử sinh học để có trình tự đầy đủ phiên mã RNA tìm thấy tế bào RACE dẫn đến việc tạo cDNA trình tự RNA quan tâm, tạo thông qua phiên mã ngược, khuếch đại PCR cDNA Sau đó, cDNA khuếch đại giải trình tự đủ dài, nên ánh xạ tới vùng gen RACE thường theo sau nhân trước giải trình tự ban đầu phân tử RNA riêng lẻ MỘT thay thơng lượng cao hơn, hữu ích cho việc xác định tiểu thuyết cấu trúc phiên mã, xếp thứ tự sản phẩm RACE theo hệ cơng nghệ giải trình tự số Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google Lịch sử Ý tưởng kết hợp RACE với giải trình tự thơng lượng cao lần xuất giới thiệu vào năm 2009 dạng Deep-RACE để thực ánh xạ vị trí bắt đầu Phiên âm (TSS) 17 gen dịng tế bào Ví dụ: Trong nghiên cứu từ năm 2014 đến lập đồ xác vị trí phân cắt RNA đích điều khiển siRNA tổng hợp, cách tiếp cận đặt tên RACE-seq Hơn nữa, phương pháp sử dụng để mô tả phần chưa biết có độ dài đầy đủ tiểu thuyết hợp ung thư đại trực tràng Trong nghiên cứu khác nhằm đặc trưng hóa bảng điểm chưa biết cấu trúc lncRNA, RACE sử dụng kết hợp với bán dài 454 trình tự Quy trình RACE cung cấp trình tự phiên mã RNA từ phân tử nhỏ biết trình tự phiên mã đến đầu 5' (5' RACE-PCR) đầu 3' (3' RACE PCR) RNA Kỹ thuật gọi PCR phía kỹ thuật neo PCR Bước RACE sử dụng phiên mã ngược để tạo cDNA vùng phiên mã RNA Trong trình này, phần kết thúc khơng xác định bảng điểm chép cách sử dụng trình tự biết từ trung tâm bảng điểm Các vùng chép giới hạn trình tự biết, đầu 5' 3' Ứng dụng RACE sử dụng để khuếch đại phần 5' (5'-RACE) 3' (3'-RACE) chưa biết Các phân tử ARN phần trình tự ARN gen xác định nhắm mục tiêu mồi cụ thể Kết hợp với trình tự thơng lượng cao để mơ tả đặc tính sản phẩm RACE khuếch đại này, áp dụng phương pháp để mô tả đặc điểm loại phân tử RNA mã hóa khơng mã hóa Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google III 3´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC Xác định Quy trình 3´ RACE tóm tắt sau Tổng hợp cDNA chuỗi bắt đầu đuôi poly(A) mRNA cách sử dụng đoạn mồi tiếp hợp (AP) sau lần chuỗi cDNA, khuôn mẫu mRNA ban đầu bị phá hủy RNase H, đặc trưng cho phân tử dị vòng RNA:DNA khuếch đại thực hiện, khơng có chiết xuất hữu trung gian kết tủa ethanol, sử dụng hai đoạn mồi: GSP người dùng thiết kế gắn vào vị trí nằm phân tử cDNA; lại mồi khuếch đại phổ quát nhắm vào mARN cADN bổ sung vào đầu 3´ mARN hai phổ quát mồi khuếch đại cung cấp với hệ thống khuếch đại phổ quát mồi (UAP) thiết kế để nhân nhanh chóng hiệu sản phẩm RACE sử dụng phương pháp nhân uracil DNA glycosylase (UDG) (13–16) rút gọn mồi khuếch đại phổ quát (AUAP) tương đồng với trình tự điều hợp sử dụng để tổng hợp chuỗi cDNA Phân lập RNA tổng số Một yếu tố quan trọng trước tổng hợp đầy đủ đáng kể chiều dài cDNA cô lập RNA nguyên vẹn Chất lượng RNA định lượng thơng tin trình tự tối đa chuyển đổi thành cDNA Như vậy, điều quan trọng tối ưu hóa việc phân lập RNA từ nguồn sinh học định để ngăn chặn đời ngẫu nhiên RNase chất ức chế đảo ngược phiên mã muối guanidinium, SDS EDTA Phương pháp khuyến nghị cho 3´ RACE guanidine isothiocyanate/axit phương pháp phenol ban đầu mô tả Chomzynski Sacchi TRIzol Phương pháp thuốc thử cải tiến phương pháp bước ban đầu Chomczynski Sacchi sử dụng để điều chế RNA từ 103 tế bào số lượng miligam mô 10 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google Tổng hợp cDNA sợi từ RNA tổng số Phản ứng tổng hợp chuỗi cDNA xúc tác Invitrogen SuperScript II RT Enzyme đột biến M-MLV RT thiết kế để giảm hoạt động RNase H, dẫn đến sản lượng cao tổng hợp đầy đủ Các enzyme thể ổn định nhiệt tăng lên sử dụng nhiệt độ lên đến 50°C Ngồi ra, SuperScript II RT khơng bị ức chế đáng kể ribosome RNA vận chuyển sử dụng để tổng hợp chuỗi cDNA từ RNA tổng số chuẩn bị Mẫu RNA loại bỏ khỏi phân tử lai cDNA:RNA cách tiêu hóa với RNase H sau tổng hợp cDNA để tăng độ nhạy PCR AP khởi đầu trình tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên, thiết kế để chứa ba trang web endonuclease hạn chế nửa trang web Không phải Bao gồm trình tự đoạn mồi tạo điều kiện thuận lợi cho trình nhân sau khuếch đại cách sử dụng hạn chế dựa endonuclease phương pháp dựa T4 DNA polymerase Bởi AP bắt đầu trình tổng hợp cDNA vùng poly(A) mRNA, có hiệu chọn cho mRNA polyadenylated; đó, trình chọn lọc oligo(dT) cho poly(A)+ RNA thường không cần thiết việc kết hợp bước tạo thuận lợi cho việc phát phiên mã mRNA Khuếch đại cDNA đích Q trình khuếch đại cDNA đích yêu cầu mồi với hai oligonucleotide Taq DNA polymerase Đoạn mồi khuếch đại cảm giác người dùng cung cấp GSP, đặc trưng cho gen trình tự quan tâm cụ thể thiết kế để bao gồm yếu tố trình tự tạo thuận lợi cho bước nhân Thiết kế Primer dành riêng cho gen Khuếch đại PCR hiệu cụ thể phụ thuộc nhiều vào thiết kế mồi Điều đặc biệt ứng dụng RACE PCR thực với có GSP Nói chung, mồi hiệu hình thành song công ổn định với 11 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google trình tự đích, có tính đặc hiệu cao trình tự đích chúng khơng có cấu trúc thứ cấp vịng kẹp tóc điều chỉnh độ sáng Ngoài ra, tính bổ sung primer 3´-termini phải giảm thiểu tạo tác primer-dimer làm giảm đáng kể hiệu PCR Khuếch đại lồng AP thiết kế để tổng hợp chuỗi cDNA từ tất mARN Quy trình 3´ RACE tạo dải nhất, bật gel agarose Khi thực 3´ RACE với đoạn mồi lồng nhau, trình tự cụ thể để nhân phải thiết kế vào GSP lồng IV 5´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC Xác định Hệ thống 5' RACE tập hợp thuốc thử kiểm định sơ nhằm mục đích tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên, tinh chế sản phẩm chuỗi đầu tiên, đuôi homopolyme chuẩn bị cDNA mục tiêu để khuếch đại PCR kiểm soát ARN, DNA mồi cung cấp để theo dõi hiệu suất hệ thống Phân lập RNA tổng số Chất lượng RNA quy định lượng thơng tin trình tự tối đa chuyển đổi thành cDNA Vì vậy, điều quan trọng phải tối ưu hóa lập RNA để ngăn chặn đời RNase chất ức chế RT guanidin phương pháp isothiocyanate/axit-phenol, ban đầu mô tả Chomzynski Sacchi, phương pháp đề xuất để phân lập RNA Thiết kế mồi RACE 5' Độ nhạy độ đặc hiệu trình tổng hợp chuỗi PCR phụ thuộc vào thiết kế mồi tốt Tối thiểu hai antisense đoạn mồi dành riêng cho gen (GSP) bắt buộc 5' RACE phải cung cấp người dùng 12 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google - GSP1 khởi đầu trình tổng hợp cDNA chuỗi Thiết kế mồi để ủ 300 bp từ đầu 5' mRNA để cDNA dễ dàng tinh sử dụng cột SNAP - Đoạn mồi lồng thứ hai, GSP2, gắn với trình tự nằm vị trí 3' (với cDNA mRNA) GSP1 cần thiết cho PCR GSP2 ủ liền kề với GSP1 trình tự nằm thượng nguồn GSP1 sản phẩm cDNA Các GSP lồng khác cần thiết tùy thuộc vào hiệu tính đặc hiệu phản ứng PCR sơ cấp Tổng hợp chuỗi cDNA sợi từ RNA tổng số Việc nắm bắt đầu 5' mRNA phụ thuộc vào trình tổng hợp cDNA hồn chỉnh Các việc sử dụng RNase H-RT để tổng hợp chuỗi dẫn đến cDNA có chiều dài đầy đủ lớn tổng hợp suất chuỗi cDNA cao so với thu từ RT khác Loại bỏ mẫu RNA RNase Mix Việc sử dụng Hỗn hợp RNase sau hoàn thành trình tổng hợp chuỗi quan trọng hiệu phản ứng nối TdT thể ưu tiên rõ rệt chất sợi đơn 13 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com) lOMoARcPSD|38183518 Machine Translated by Google REF THAM KHẢO Oladapo Yeku, Michael A Frohman (2010) Khuếch đại nhanh cDNA kết thúc (RACE) SpringerLink, p107 – 122 DNA bổ sung, , 14/4/2023 Quá trình khuếch đại nhanh chóng cDNA kết thúc , 15/4/2023 Hệ thống 3´ RACE để khuếch đại nhanh đầu cDNA , 15/4/2023 Hệ thống 5´ RACE để khuếch đại nhanh đầu cDNA , 15/4/2023 14 Downloaded by mai truong (truongthimai.2902@gmail.com)