Chủ Đề Kết Thúc Khuếch Đại Nhanh Chóng Cdna.pdf

được chuyển đến tế bào nhận để biểu hiện, thường là biểu hiện của vi khuẩn hoặc nấm menbiểu hiện một loại protein cụ thể trong một tế bào mà bình thường không biểu hiện protein đó tức là

- - -

-KHÓA HỌC CHUYÊN ĐỀ

Lưu Thị Mỹ Linh – 20125479 Lớp: DH20BQC

Hà Huỳnh Nhi – 20125578 Người thực hiện: Nguyễn Lê Khang – 20125448

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

Người hướng dẫn: NGƯT Nguyễn Minh Xuân Hồng

Chuyên ngành đào tạo: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (CLC)

NHÌ N NHẬN

rằng tôi có thể làm một bài tiểu luận: 'KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG CỦA CDNA KẾT THÚC'

giúp chúng tôi cải thiện trong thời gian tới.

Xin chân thành cảm ơn và chúc quý khách sức khỏe, thành công trong công việc Mặc dù đã cố gắng hết sức, nhưng do thiếu kiến thức và nghiên cứu, chúng tôi

con đường dạy học!

tiểu luận còn sai sót, thiếu chính xác Vì vậy rất mong nhận được sự tư vấn của các bạn

Chúng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn của chúng tôi để MRS NGUYỄN MINH XUÂN

Thủ Đức, tháng 4 năm 2023 HỒNG đã hướng dẫn và cung cấp kiến thức cho chúng em trong suốt quá trình học tập nên

2

BÌ NH LUẬN

II KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG CỦA CDNA KẾT THÚC (RACE) 8

2 Tổng hợp 6

1 Định nghĩa 10

3 Thiết kế mồi 5' RACE 12

2 Phân lập RNA tổng số 10

3 Ứng dụng 6

4 Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất từ RNA tổng số 13

4 Ứng dụng 9

I cDNA LÀ GÌ ? 5

1 Định nghĩa 12

IV 5´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC 12 2 Phân lập RNA tổng số 12

1 Định nghĩa 5

III 3´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC 10 NHÌ N NHẬN 2

1 Định nghĩa số 8 NHẬN XÉT 3

3 Quy trình 9

5 Thiết kế đoạn mồi dành riêng cho gen 11

2 Lịch sử 9

6 Khuếch đại lồng nhau 12

5 Loại bỏ RNA khuôn mẫu bằng RNase Mix 13 TÀI KHOẢN THAM KHẢO 14

4 Virus và retrotransposon 7

3 Tổng hợp cDNA sợi đầu tiên từ RNA tổng số 11

MỤC LỤC 4 Khuếch đại cDNA mục tiêu 11

4

được chuyển đến tế bào nhận để biểu hiện, thường là biểu hiện của vi khuẩn hoặc nấm men

biểu hiện một loại protein cụ thể trong một tế bào mà bình thường không biểu hiện protein đó (tức là,

Thuật ngữ cDNA cũng được sử dụng, điển hình trong bối cảnh tin sinh học, để chỉ trình tự của bản phiên mã mRNA, được biểu thị dưới dạng các cơ sở DNA (deoxy-GCAT) chứ không phải

biểu hiện khác loại), hoặc để giải trình tự hoặc định lượng các phân tử mRNA bằng cách sử dụng DNA

virus gây suy giảm miễn dịch, v.v.) và sau đó được tích hợp vào bộ gen của vật chủ, nơi nó

mẫu RNA sợi (ví dụ: RNA thông tin (mRNA) hoặc microRNA (miRNA)) trong

một phản ứng được xúc tác bởi enzyme sao chép ngược cDNA thường được sử dụng để

tạo ra một provirus

1 Xác định

các hệ thống cDNA cũng được tạo ra để phân tích hồ sơ phiên mã trong mô số lượng lớn,

Trong di truyền học, DNA bổ sung (cDNA) là DNA được tổng hợp từ một

cDNA cũng được tạo ra một cách tự nhiên bởi các retrovirus (chẳng hạn như HIV-1, HIV-2, simian

tế bào đơn lẻ hoặc nhân đơn lẻ trong các xét nghiệm như microarrays, qPCR và RNA-seq

phương pháp dựa trên (qPCR, RNA-seq) cDNA mã hóa cho một loại protein cụ thể có thể được

so với các cơ sở RNA (GCAU)

I CDNA LÀ GÌ ?

RNA đóng vai trò là khuôn mẫu để tổng hợp cDNA Trong đời sống tế bào, cDNA là

được tổng hợp thông qua phiên mã ngược in vitro

tạo thư viện cDNA Khi các nhà khoa học chuyển một gen từ một tế bào vào

tế bào khác để biểu hiện vật liệu di truyền mới dưới dạng protein trong

được tạo ra bởi virus và retrotransCPons để tích hợp RNA vào mục tiêu

bởi vì DNA của toàn bộ gen có thể bao gồm DNA không mã hóa cho gen đó

3 Ứng dụng

tế bào nhận, cDNA sẽ được thêm vào tế bào nhận (chứ không phải toàn bộ gen),

protein hoặc làm gián đoạn trình tự mã hóa của protein (ví dụ: intron) một phần

DNA bộ gen Trong sinh học phân tử, RNA được tinh chế từ vật liệu nguồn sau khi

DNA bổ sung thường được sử dụng trong nhân bản gen hoặc làm đầu dò gen hoặc trong

2 Tổng hợp

DNA bộ gen, protein và các thành phần tế bào khác bị loại bỏ khi đó cDNA là

trình tự cDNA thường thu được dưới dạng các thẻ trình tự được biểu thị

6

gen không thể được cấp bằng sáng chế, cDNA đủ điều kiện cấp bằng sáng chế vì nó không xảy ra qPCR để định lượng mức cDNA thông qua phép đo huỳnh quang và các phương pháp khác

Một ví dụ về bước đầu tiên này từ RNA virus đến cDNA có thể được nhìn thấy trong HIV

với virus với việc loại trừ việc tạo ra các hạt truyền nhiễm

chu kỳ lây nhiễm Tại đây, màng tế bào chủ được gắn vào virus'

Vào ngày 13 tháng 6 năm 2013, Tòa án Tối cao Hoa Kỳ đã ra phán quyết trong trường hợp Hiệp hội

cADN mARN) MRNA được sử dụng để tạo ra các protein của virus để chiếm lấy vật chủ

bộ điều hợp cho phép các đoạn cDNA được khuếch đại PCR và liên kết với trình tự

Retrotransposon là các yếu tố di truyền di động tự di chuyển bên trong và

cDNA cũng được tạo ra bởi retrotransposon trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn

đôi khi giữa các bộ gen thông qua trung gian RNA Cơ chế này được chia sẻ

tế bào dòng chảy Các phương pháp phân tích gen cụ thể thường sử dụng microarrays và RT

tế bào.

qPCR Để giải trình tự, RNA phải được phân mảnh do kích thước nền tảng giải trình tự

một cách tự nhiên.

hạn chế Ngoài ra, cDNA tổng hợp chuỗi thứ hai phải được nối với

Một số virus cũng sử dụng cDNA để biến RNA virus của chúng thành mRNA (RNA virus

RNA của virus, một quá trình được hỗ trợ bởi CypA đi kèm và capsid của virus

4 Virus và retrotransposon

phiên mã ngược liên kết

cho Bệnh học phân tử v Myriad Genetics mà trong khi con người xuất hiện tự nhiên

vỏ lipid cho phép capsid của virus có hai bản sao RNA bộ gen của virus

cDNA cũng được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện gen thông qua các phương pháp như RNA-seq hoặc RT

để vào máy chủ Bản sao cDNA sau đó được thực hiện thông qua phiên mã ngược của

RACE dẫn đến việc tạo ra một bản sao cDNA của trình tự RNA quan tâm,

II KHAI THÁC NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC (RACE)

nhân bản trước khi giải trình tự những gì ban đầu là các phân tử RNA riêng lẻ MỘT

các công nghệ giải trình tự

sinh học để có được trình tự đầy đủ của bản phiên mã RNA được tìm thấy trong một tế bào

nên ánh xạ tới một vùng gen duy nhất RACE thường được theo sau bởi

Khuếch đại nhanh các đầu cDNA (RACE) là một kỹ thuật được sử dụng trong phân tử

cấu trúc phiên mã, là sắp xếp thứ tự các sản phẩm RACE theo thế hệ tiếp theo

bản sao cDNA Sau đó, các bản sao cDNA được khuếch đại sẽ được giải trình tự và nếu đủ dài, được tạo ra thông qua phiên mã ngược, tiếp theo là khuếch đại PCR của

1 Xác định

thay thế thông lượng cao hơn, hữu ích cho việc xác định tiểu thuyết

số 8

cấu trúc của lncRNA, RACE đã được sử dụng kết hợp với bán dài 454

cách tiếp cận đầu tiên được đặt tên là RACE-seq Hơn nữa, phương pháp này được sử dụng để

PCR

các sản phẩm RACE được khuếch đại này, có thể áp dụng phương pháp này để mô tả đặc điểm

Bước đầu tiên trong RACE là sử dụng phiên mã ngược để tạo ra bản sao cDNA

mô tả các phần chưa biết có độ dài đầy đủ của bản sao tiểu thuyết và bản sao hợp nhất trong

trình tự trong bản phiên mã đến đầu 5' (5' RACE-PCR) hoặc đầu 3' (3' RACE

(TSS) của 17 gen trong một dòng tế bào Ví dụ: Trong một nghiên cứu từ năm 2014 đến

Các phân tử ARN trong đó một phần của trình tự ARN được một gen xác định và nhắm mục tiêu RACE có thể được sử dụng để khuếch đại các phần 5' (5'-RACE) hoặc 3' (3'-RACE) chưa biết của

mồi cụ thể Kết hợp với trình tự thông lượng cao để mô tả đặc tính của

lập bản đồ chính xác các vị trí phân cắt của RNA đích được điều khiển bởi siRNA tổng hợp,

PCR) của RNA Kỹ thuật này đôi khi được gọi là PCR một phía hoặc kỹ thuật neo

Ý tưởng kết hợp RACE với giải trình tự thông lượng cao lần đầu tiên xuất hiện

trình tự

RACE có thể cung cấp trình tự phiên mã RNA từ một phân tử nhỏ đã biết được giới thiệu vào năm 2009 dưới dạng Deep-RACE để thực hiện ánh xạ các vị trí bắt đầu Phiên âm

vùng được sao chép được giới hạn bởi trình tự đã biết, ở đầu 5' hoặc 3'

3 Quy trình

4 Ứng dụng

ung thư đại trực tràng Trong một nghiên cứu khác nhằm đặc trưng hóa bảng điểm chưa biết

của một vùng phiên mã RNA Trong quá trình này, một phần kết thúc không xác định của một

2 Lịch sử

bảng điểm được sao chép bằng cách sử dụng trình tự đã biết từ trung tâm của bảng điểm Các

phân tử cDNA; cái còn lại là mồi khuếch đại phổ quát nhắm vào

đặc trưng cho các phân tử dị vòng RNA:DNA khuếch đại là

được sử dụng để tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên

phương pháp phenol ban đầu được mô tả bởi Chomzynski và Sacchi TRIzol

như 103 tế bào hoặc số lượng miligam mô

2 Phân lập RNA tổng số được thực hiện, không có chiết xuất hữu cơ trung gian hoặc kết tủa ethanol,

Phương pháp thuốc thử là một cải tiến của phương pháp một bước ban đầu của

sử dụng phương pháp nhân bản uracil DNA glycosylase (UDG) (13–16) rút gọn

được bắt đầu ở đuôi poly(A) của mRNA bằng cách sử dụng đoạn mồi tiếp hợp (AP) sau lần đầu tiên

phiên mã như muối guanidinium, SDS và EDTA

để ngăn chặn sự ra đời ngẫu nhiên của RNase và các chất ức chế đảo ngược

Phương pháp được khuyến nghị cho 3´ RACE là guanidine isothiocyanate/axit

chuỗi cDNA, khuôn mẫu mRNA ban đầu bị phá hủy bằng RNase H,

mồi khuếch đại phổ quát (AUAP) tương đồng với trình tự bộ điều hợp

1 Xác định

mARN của cADN bổ sung vào đầu 3´ của mARN hai phổ quát

mồi (UAP) được thiết kế để nhân bản nhanh chóng và hiệu quả các sản phẩm RACE

Quy trình 3´ RACE được tóm tắt như sau Tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên

lượng thông tin trình tự tối đa có thể được chuyển đổi thành cDNA Như vậy,

mồi khuếch đại được cung cấp với hệ thống khuếch đại phổ quát

điều quan trọng là tối ưu hóa việc phân lập RNA từ một nguồn sinh học nhất định và

Chomczynski và Sacchi và có thể được sử dụng để điều chế RNA từ rất ít

sử dụng hai đoạn mồi: một là GSP do người dùng thiết kế gắn vào một vị trí nằm trong

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trước khi tổng hợp đầy đủ đáng kể

III 3´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC

chiều dài cDNA là sự cô lập của RNA nguyên vẹn Chất lượng của RNA quyết định

10

bằng cách tiêu hóa với RNase H sau khi tổng hợp cDNA để tăng độ nhạy của PCR.

50°C Ngoài ra, SuperScript II RT không bị ức chế đáng kể bởi ribosome và

chọn cho các mRNA polyadenylated; do đó, quá trình chọn lọc oligo(dT) cho poly(A)+ RNA là

Khuếch đại PCR hiệu quả và cụ thể phụ thuộc nhiều vào thiết kế mồi

thường không cần thiết mặc dù việc kết hợp bước này có thể tạo thuận lợi cho việc phát hiện

RNA vận chuyển và có thể được sử dụng để tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên từ RNA tổng số

hạn chế dựa trên endonuclease hoặc phương pháp dựa trên T4 DNA polymerase Bởi vì

hoạt động RNase H, dẫn đến sản lượng cao hơn và tổng hợp đầy đủ hơn Các

được thiết kế để bao gồm các yếu tố trình tự tạo thuận lợi cho các bước nhân bản tiếp theo GSP, đặc trưng cho gen hoặc trình tự quan tâm cụ thể và có thể là

5 Thiết kế Primer dành riêng cho gen

AP bắt đầu quá trình tổng hợp cDNA tại vùng poly(A) của mRNA, nó có hiệu quả

enzyme thể hiện sự ổn định nhiệt tăng lên và có thể được sử dụng ở nhiệt độ lên đến

Phản ứng tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên được xúc tác bởi Invitrogen SuperScript

AP khởi đầu quá trình tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên, đã được thiết kế để chứa

II RT Enzyme này là một đột biến của M-MLV RT đã được thiết kế để giảm

các trình tự trong đoạn mồi có thể tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhân bản sau khuếch đại bằng cách sử dụng

Quá trình khuếch đại cDNA đích yêu cầu mồi với hai oligonucleotide và

ba trang web endonuclease hạn chế và một nửa trang web Không phải tôi Bao gồm những

Taq DNA polymerase Đoạn mồi khuếch đại cảm giác là do người dùng cung cấp

sự chuẩn bị Mẫu RNA được loại bỏ khỏi phân tử lai cDNA:RNA

của các bản phiên mã mRNA hiếm

3 Tổng hợp cDNA sợi đầu tiên từ RNA tổng số

4 Khuếch đại cDNA đích

để nhân bản tiếp theo phải được thiết kế vào GSP lồng nhau.

AP được thiết kế để tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên từ tất cả

DNA và mồi được cung cấp để theo dõi hiệu suất của hệ thống

PCR tiếp theo phụ thuộc vào thiết kế mồi tốt Tối thiểu hai antisense

2 Phân lập RNA tổng số mARN Quy trình 3´ RACE sẽ tạo ra một dải duy nhất, nổi bật trên một

đoạn mồi dành riêng cho gen (GSP) là bắt buộc đối với 5' RACE và phải được cung cấp bởi

cDNA chuỗi đầu tiên, tinh chế các sản phẩm chuỗi đầu tiên, đuôi homopolyme và

tạo tác primer-dimer có thể làm giảm đáng kể hiệu quả PCR

3 Thiết kế mồi RACE 5' Sacchi, là phương pháp được đề xuất để phân lập RNA

Độ nhạy và độ đặc hiệu của quá trình tổng hợp chuỗi đầu tiên và

6 Khuếch đại lồng nhau

chuẩn bị cDNA mục tiêu để khuếch đại tiếp theo bằng PCR kiểm soát ARN,

cấu trúc thứ cấp như vòng kẹp tóc và bộ điều chỉnh độ sáng

IV 5´ HỆ THỐNG RACE ĐỂ KHUẾCH ĐẠI NHANH CHÓNG cDNA KẾT THÚC

Ngoài ra, tính bổ sung của primer 3´-termini phải được giảm thiểu vì

Hệ thống 5' RACE là một tập hợp các thuốc thử đã được kiểm định sơ bộ nhằm mục đích tổng hợp

RNA và để ngăn chặn sự ra đời của RNase và chất ức chế RT guanidin

1 Xác định

phương pháp isothiocyanate/axit-phenol, ban đầu được mô tả bởi Chomzynski và

người dùng.

gel agarose Khi thực hiện 3´ RACE với đoạn mồi lồng nhau, các trình tự cụ thể

Chất lượng của RNA quy định lượng thông tin trình tự tối đa trình tự đích, có tính đặc hiệu cao đối với trình tự đích của chúng và không có

có thể được chuyển đổi thành cDNA Vì vậy, điều quan trọng là phải tối ưu hóa sự cô lập của

12