Thực hành vi sinh

Chuẩn bị dụng cụ- Đèn cồn và tủ cấy.- Bình xịt sát khuẩn tay.- Que cấy trang que cấy tam giác: Là que bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tamgiác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC



BÁO CÁO THỰC HÀNH

SINH HỌC VI SINH

Nhóm 1 – Thứ 6 ca 3Lớp: DH21SHB

Giảng viên hướng dẫn : TS Trương Phước Thiên Hoàng

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Lan Anh - 21126009 Nguyễn Thị Lan Anh - 21126014 Ngô Ngọc Hải - 21126324

Phạm Thị Mỹ Hạnh - 21126054

Lý Gia Hân - 21126325 Thạch Vinh - 21126259

TP.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2022

MỤC LỤC

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC 2

Bài 1: Các thao tác cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh 3

1.1 Gói đĩa petri 3

1.2 Pha chế môi trường: Môi trường dịch trích khoai tây 4

1.3 Các phương pháp cấy 5

1.3.1 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy trang 5

1.3.2 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy ria 7

1.3.3 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy móc 9

Bài 4: Quan sát nấm sợi 11

4.1 Tổng quan Trichoderma 11

4.2 Tổng quan Aspergillus 13

Bài 6: Nhuộm Gram 14

6.1 Nhuộm E coli 14

6.2 Nhuộm Bacillus subtilis 15

6.3 Nhuộm Staphylococcus 17

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

Nguyễn Lan Anh

Bài 1: Các thao tác cơ bản trong phòng thí nghiệm vi

Bước 1: Trải báo và đặt các đĩa petri nằm ngang với mặt bàn

Bước 2: Kéo tờ báo lên khoảng hai phần ba, lấy ngón trỏ đẩy các đĩanằm không đều vào Bẻ hai mép giấy hai bên vào trong, dùng haingón trỏ và ngón giữa giữ lại

Bước 3: Cầm nguyên cụm tay, đẩy đĩa lên một tí, vuốt mép bằng bangón tay và ép sát vào vành đĩa (tạo ra một cái nếp) và gấp xéo mộtphần ba đĩa, không vuông góc

Bước 4: Tiếp tục đẩy đĩa lên, gấp thêm một nếp ép sát vào vành đĩanhư nếp gấp trước Bên kia cũng làm tương tự, cũng tạo nếp gấpxong đẩy đĩa lên và tạo tiếp nếp gấp mới

Bước 5: Khi thấy cuộn gói còn lỏng, ép chặt nó vào và làm tương tựnhư lúc nãy cho đến hết

1.1.3 Kết quả

Buổi đầu Buổi sau

1.2 Pha chế môi trường: Môi trường dịch trích khoai tây

Bước 6: Đem tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút

1.2.3 Kết quả

Môi trường dịch trích khoai tây

1.3 Các phương pháp cấy

- Các phương pháp cấy: Cấy bằng que cấy trang, cấy móc và cấy ria

- Mục đích: Phân lập vi khuẩn thành các khuẩn lạc đơn phù hợp với mục đích nuôi cấy

vi khuẩn

- Môi trường: Môi trường dịch trích giá đậu, môi trường dịch trích khoai tây,…

1.3.1 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy trang

- Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (giá đậu)

- Đĩa petri đã có sẵn vi sinh

- Dung dịch có độ pha loãng 1/1000

Lưu ý:

- Trước khi tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy bằng dung dịch cồn, rửa tay bằng dungdịch cồn trước khi để tay vào trong tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trong quá trình cấy)

- Đối với cấy trang:

+ Cấy đều, nhanh tay

+ Cấy vào vành đĩa.

+ Cấy khô

1.3.1.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Hơ nóng miệng đĩa trên ngọn lửa (không để quá sát), sau đó mở nắp đĩa dùngpipet 0,1 ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trên đĩa petri

Bước 2: Nhúng đầu thanh gạt vào cồn và hơ qua ngọn lửa để khử trùng

Bước 3: Mở đĩa petri, đưa thanh gạt chà vào mặt đĩa không có môi trường thạch đểlàm nguội sau đó nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri Dùng đầu thanhgạt trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch, trong quá trình thực hiện thì luôn đểnắp đĩa hở và hơ gần ngọn lửa để môi trường mau khô (Chú ý: Không để quá gần ngọnlửa sẽ làm chết vi khuẩn)

Bước 4: Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt

1.3.1.3 Kết quả

a Nếu thực hiện đúng thao tác, không bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như các hình sau:

=> Tạo ra các khuẩn lạc đơn và đồng nhất (những khuẩn lạc thuần)

b Nếu môi trường chưa khô sẽ tạo ra kết quả như những hình dưới đây:

Môi trường chưa khô

- Hình trái: Môi trường chưa khô và còn ướt nên tạo ra một mảng sinh vật nên khôngxuất hiện những khuẩn lạc đơn

- Hình phải: Mặc dù vẫn tạo ra các khuẩn lạc đơn nhưng phần giữa vẫn chưa được khô

và chưa cấy vào vành đĩa

c Nếu môi trường bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như những hình dưới đây:

Môi trường bị tạp nhiễm

- Hình trái: Tuy vẫn ra những khuẩn lạc đơn nhưng vẫn xảy ra tình trạng tạp nhiễm(những con lớn hơn)

- Hình phải: Môi trường khô và xuất hiện các khuẩn lạc đơn nhưng chưa cấy vào vànhđĩa

1.3.1.4 Khắc phục

- Tập luyện thành thạo các thao tác ở bên ngoài

- Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người

1.3.2 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy ria

cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp đểđược vô trùng trước khi sử dụng.

- Trước khi tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy bằng dung dịch cồn, rửa tay bằng dungdịch cồn trước khi để tay vào trong tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trong quá trình cấy)

- Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn,ngọn lửa đèn cồn có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thờicòn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nútbông, nắp nhựa…

- Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, cần mang găng tay hoặc tiến hành sáttrùng tay bằng cồn 70° hoặc các dung dịch diệt khuẩn

1.3.2.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Dùng que cấy vòng đã được vô trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn,làm nguội và nhúng vào dịch mẫu để có được các vi khuẩn cần phân lập

Bước 2: Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp

+ Cấy vùng 1: Dùng que cấy có vi khuẩn, ria đều trên đĩa thạch theo đường ziczac vớidiện tích chiếm 1/3 diện tích đĩa thạch

+ Cấy vùng 2: Xoay đĩa 120 độ, tiến hành cấy vùng 2 bằng cách di chuyển que cấytheo đường ziczac thưa hơn so với vùng 1 và vùng 2 cũng chiếm 1/3 đĩa

+ Cấy vùng 3: Xoay đĩa 120 độ và cấy tương tự như cấy vùng 2 Sao cho đường cấy ởvùng 3 cũng phải chạm vào vùng 2 và đường cấy thưa hơn so với vùng 2 Diện tíchcấy là 1/3 đĩa thạch cuối cùng

Bước 3: Các đường cấy ở vùng sau phải chạm vào đường cấy ở vùng trước để đảm bảo

vi khuẩn mọc được ở tất cả các vùng và tạo khuẩn lạc riêng lẻ

Bước 4: Sau khi kết thúc các đường ria, cần đốt tiệt trùng que cấy

Bước 5: Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm

Bước 6: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn 24-48h

1.3.2.3 Kết quả

a Nếu thực hiện đúng thao tác sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

=> Tạo ra các khuẩn lạc đơn và đồng nhất (những khuẩn lạc thuần)

b Nếu thực hiện thao tác không đúng sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

- Tập luyện thành thạo các thao tác ở bên ngoài

- Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người

1.3.3 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy móc

1.3.3.1 Chuẩn bị dụng cụ

- Đèn cồn và tủ cấy.

- Bình xịt sát khuẩn tay

- Que cấy móc (que cấy đầu vuông): Đây là que cấy có đầu vuông góc, dùng để cấy vikhuẩn có tạo khuẩn ty

- Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (PDA)

- Đĩa petri đã có sẵn vi sinh

Lưu ý:

- Trước khi tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy bằng dung dịch cồn, rửa tay bằng dungdịch cồn trước khi để tay vào trong tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trong quá trình cấy)

- Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, cần mang găng tay hoặc không tập trung

ở nơi đông người

a Nếu thực hiện đúng thao tác, không bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

=> Nấm có bào tử, sợi tơ nấm phát triển rất đều

b Nếu thực hiện không đúng thao tác, sẽ bị tạp nhiễm sẽ tạo ra kết quả như hình sau:

- Tập luyện thành thạo các thao tác ở bên ngoài

- Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người

Bài 4: Quan sát nấm sợi

4.1 Tổng quan Trichoderma

4.1.1 Trichoderma là gì?

- Đây là tên gọi của chủng nấm có tên đầy đủ là Trichoderma spp, thường sống trong

đất tập trung nhiều ở khu vực rễ cây Chủng nấm này có đến 33 loài, hầu hết đều có lợicho cây trồng Một số giúp cố định đạm trong đất, số khác phân giải lân hoặc tấn côngtiêu diệt các loài nấm bệnh gây hại cho cây trồng Do tính chất đối kháng với nấm

bệnh, nên bà con thường nghe tên gọi của Trichoderma mà là “Nấm đối kháng

trên tiêu, bệnh lở cổ rễ ở cà phê, bệnh xì mủ sầu riêng, thối rễ ở cây bơ… và các bệnhtương tự liên quan đến rễ ở các giống cây trồng khác.

- Ngoài cơ chế tiêu diệt trực tiếp khi tiếp xúc, Trichoderma còn có cơ chế sinh ra các

“kháng thể” được cấy truyền đi khắp các bộ phận, giúp tiêu diệt nấm hại ở cả lá, cànhcây, ngọn cây, quả… mà không cần tiếp xúc

- Trichoderma còn giúp tạo môi trường thuận lợi cho các vi sinh vật cố định đạm

(khuẩn lạc), phân giải lân… Nói chung Trichoderma cộng sinh tốt với tất cả các loài sinh vật có ích trong đất, giúp tăng độ tơi xốp cho đất Một số chủng Trichoderma còn

tiết ra enzym giúp phân hủy mùn, rễ cây, các loại phân hữu cơ, giúp chuyển hóa thànhcác dạng chất mà cây có thể hấp thu được Ví dụ enzym cellulase, chitinase, protease,pectinase, amlylase

- Trong quá trình ủ phân chuồng, ủ phân hữu cơ từ xác động thực vật Việc trộn chung

Trichoderma vào thành phần ủ giúp giảm mùi hôi, đẩy nhanh tiến trình phân giải, tiết

kiệm được thời gian ủ phân Đồng thời còn có thể kết hợp với biolactyl, subtyl… đểtổng hợp nên các chế phẩm sinh học khác

4.1.3 Ưu điểm

+ Không gây hại cho người và vật nuôi, phát triển nhanh trong đất

+ Sử dụng nhiều cơ chế để kháng lại các vi sinh vật gây bệnh

+ Tồn tại lâu dài trong đất nhờ khả năng tự sản sinh ra bào tử

+ Đẩy nhanh quá trình hấp thu chất dinh dưỡng và kích thích tăng trưởng cây trồng

Trichoderma sp.

4.2 Tổng quan Aspergillus

4.2.1 Aspergillus là gì?

- Nấm sợi Aspergillus thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, không có hình thức

sinh sản hữu tính, hệ sợi có vách ngăn, bào tử vôi tính là bào tử trần, phần lớn sốnghoại sinh trong đất

- Bộ phận sinh bào tử của Aspergillus có cấu trúc đặc biệt gồm đính bào đài mọc từ tế

bào chân, ngọn đỉnh bào đài, tiểu bào đài, trên tiểu bào đài sinh ra các bào tử có kíchthước nhỏ, nhìn trông giống như bông hoa cúc

4.2.2 Vai trò gây bệnh của Aspergillus

- Aspergillus có thể gây rất nhiều bệnh cho người và động vật Nấm có thể gây độc

(nhiễm độc tố nấm trong thức ăn ô nhiễm), gây bệnh (dị ứng, nấm phát triển tại chỗ

không xâm nhập và bệnh nấm xâm nhập) Aspergillus chủ yếu gây bệnh ở phổi, đôi

khi gây bệnh ngoài phổi

4.2.3 Điều trị

- Thể dị ứng: Điều trị như điều trị hen

- Bướu nấm: Phẫu thuật nếu điều kiện bệnh nhân cho phép, thường chống chỉ định dobệnh phổi cũ, thuốc không có tác dụng

- Nấm xâm nhập: Nấm đáp ứng với thuốc kém Có thể dùng amphotericin B phối hợpflucytosine hoặc rifampicin, nhóm azole có thể dùng itraconazole Hiện nay đang hyvọng vào các thuốc mới như voriconazole, caspofungin có tác dụng tốt với

Aspergillus.

Bước 1: Nhỏ 1 giọt nước lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy mẫu vi khuẩn đã chuẩn

bị từ trước cho vào giọt nước (Xác định rõ vùng để trải đều mẫu, ghi tên và đánh dấulên lame nếu cần thiết)

Bước 2: Dàn vi khuẩn đều lên lame bằng que cấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khilame khô

Bước 3: Nhuộm:

- Nhỏ 2 giọt dung dịch Crystal violet và trải đều lên vùng đã xác định, để khoảng 1phút Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ (Lưu ý: Khi rửa thì không để tia nước chiếuthẳng vô vùng đã chứa mẫu)

- Nhỏ dung dịch Lugol và trải đều lên vùng chứa mẫu để cố định màu, để khoảng 1phút Rửa dưới vòi nước

- Tẩy màu bằng cồn 90° và rửa lại nhanh bằng nước

- Nhỏ dung dịch đỏ Safranin, trải đều, để khoảng 1 phút Rồi tiếp tục rửa dưới vòinước

- Để khô tự nhiên

Bước 4: Soi mẫu dưới kính hiển vi

6.1.3 Kết quả

- Vi khuẩn Gram (-): Lớp peptidoglycan mỏng và lớp màng lipopolysaccharide nênkhông thể giữ lại màu tím Do đó sau khi nhuộm Safranin thì tế bào bắt màu đỏ (hoặchồng)

+ Nhuộm Crystal violet: Nhuộm tất cả vi khuẩn gram dương thành màu tím

Bước 1: Nhỏ 1 giọt nước lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy mẫu vi khuẩn đã chuẩn

bị từ trước cho vào giọt nước (Xác định rõ vùng để trải đều mẫu, ghi tên và đánh dấulên lame nếu cần thiết)

Bước 2: Dàn vi khuẩn đều lên lame bằng que cấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khilame khô

Bước 3: Nhuộm:

- Nhỏ 2 giọt dung dịch Crystal violet và trải đều lên vùng đã xác định, để khoảng 1phút Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ (Lưu ý: Khi rửa thì không để tia nước chiếuthẳng vô vùng đã chứa mẫu)

- Nhỏ dung dịch Lugol và trải đều lên vùng chứa mẫu để cố định màu, để khoảng 1phút Rửa dưới vòi nước

- Tẩy màu bằng cồn 90° và rửa lại nhanh bằng nước

- Nhỏ dung dịch đỏ Safranin, trải đều, để khoảng 1 phút Rồi tiếp tục rửa dưới vòinước

+ Nhuộm Crystal violet: Nhuộm tất cả vi khuẩn gram dương thành màu tím

+ Dung dịch Crystal Violet.

Bước 5: Rửa nhanh với dung dịch cồn sau đó rửa lại với nước

Bước 6: Phủ dung dịch Safranin trong vòng 1 phút sau đó rửa lại với nước

Bước 7: Soi mẫu dưới kính hiển vi

6.3.3 Kết quả

- Vi khuẩn Gram (+): Do lớp peptidoglycan dày, sau khi bắt màu tím của thuốc nhuộmCrystal violet và được cố định màu bởi dung dịch Lugol nên màu tím không mất saukhi tẩy cồn

Staphylococcus sp.

=> Staphylococcus là vi khuẩn gram dương nên có màu tím.

6.3.4 Ý nghĩa

- Là phương pháp giúp nhận định sơ bộ hình thể, kích thước, tính bắt màu, cách sắpxếp của vi khuẩn và giúp phân biệt nhanh nhất vi khuẩn gram âm và gram dương.+ Nước: Giúp cố định vi khuẩn

+ Nhuộm Crystal violet: Nhuộm tất cả vi khuẩn gram dương thành màu tím