Bài giảng Phân tích gen và sản phẩm của gen một số kỹ thuật

Trang 1 SINH HỌC PHÂN TỬ & DI TRUYỀN HỌC Phõn tớch gen và sản phõ̉m của gen Trang 2 Phõn tích gen và sản phõ̉m của gen CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC Đinh Đoàn Long Bộ mụn Y

Trang 1

SINH HỌC PHÂN TỬ & DI TRUYỀN HỌC

Phân tích gen và sản phẩm của gen

(Một số kỹ thuật SHPT

ứng dụng trong y học)

Trang 2

Phân tích gen và sản phẩm của gen

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH AXIT NUCLEIC

Tách chiết và tinh sạch ADN

Sử dụng quang phổ để xác định nồng độ ADN và ARN

Điện di phân tích axit nucleic

Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN

Các phương pháp lai axit nucleic và mẫu dò

Tổng hợp hóa học và sử dụng các đoạn oligonucleotide

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

Giải trình tự ADN

Xác định vai trò và chức năng gen

Trang 3

CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN

Chuẩn bị tế bào để tinh sạch protein

Trang 4

Tách chiết và tinh sạch ADN

ADN, ARN vµ protein trong pha n-íc

Phenol

Bæ sung Phenol

L¾c m¹nh

Ly t©m

ADN vµ ARN trong n-íc

Protein trong phenol

Dùng phenol loại protein khỏi dịch chiết ADN và ARN

Trang 5

Sử dụng quang phổ để xác định nồng độ ADN và ARN

Định lîng ADN và ARN dùa trªn ph¬ng ph¸p ®o quang

phæ ë c¸c bíc sãng 260 vµ 280 nm

 1,0 A 260nm  50 g / ml dsADN

 1,0 A 260nm  40 g / ml ssADN / ARN

 1,0 A 260nm  33 g / ml dNTP / oligonucleotide

Trang 6

Điện di phân tích axit nucleic

ADN kiÓu d¹i

DGGE vu«ng gãc DGGE song song

Kỹ thuật điện di xung trường

Trang 7

a) Enzym cắt đầu bằng (vd: RsaI)

b) Enzym cắt đầu dính – lệch về phía đầu 5’ (vd: EcoRI)

c) Enzym cắt đầu dính – lệch về phía đầu 3’ (vd: KpnI)

Phần đầu 5’ nhô ra Phần đầu 3’ nhô ra

Trang 8

Cách tính kích thước đoạn giới hạn trung bình

1 Xác suất một vị trí giới hạn gồm 4 bp được tìm

thấy trong một hệ gen là

1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/256

2 Xác suất một vị trí giới hạn gồm 6 bp được tìm

thấy trong một hệ gen là

1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/4096

Trang 9

Ví dụ về các vị trí giới hạn trong hệ gen người

4 bp

6 bp

8 bp

Trang 10

CÂU HỎI VẬN DỤNG

Nếu các nucleotit phân bố ngẫu nhiên trên một

phân tử ARN dài 10 6 nucleotit, chứa 20% A, 25% C, 25% U và 30% G Số lần trình tự 5’-GUUA-3’

trung bình xuất hiện trong đoạn phân tử ARN nêu

trên là bao nhiêu?

A từ 1 đến 2 lần

B từ 3 đến 4 lần

C từ 4 đến 5 lần

D nhiều hơn 5 lần

Trang 11

Điện di trên gel agarose

Làm nguội về ~50oC rồi đổ vào khuôn Lược tạo

giếng Gel sau khi

hoàn thành Các giếng

Đun chảy gel bằng lò vi sóng Cho agarose vào dung dịch đệm

Trang 12

Điện di trên gel agarose

Các phân tử ADN khác nhau về kích thước sẽ phân tách khỏi nhau Các phân tử càng ngắn di chuyển càng nhanh trên trường điện di

http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/red/gel.html

Trang 13

Gel được nhuộm với ethidium bromide

Log kích thước của ADN tỉ lệ nghịch với khoảng cách di chuyển (X)

Trang 15

Hỗn hợp ADN (ADNts, cADN mẫu,…)

Phương pháp chung dùng để nghiên cứu các trình tự ADN đặc hiệu

Nhân dòng (DNA cloning)

Nhân dòng

bằng

tế bào

Nhân dòng invitro (PCR)

1) Chọn tế bào chủ

thích hợp

2) Tạo véctơ nhân

dòng phù hợp

3) Gắn ADN ngoại lai

vào véctơ, rồi chuyển

vào tế bào chủ

1) Sử dụng ADN polymerase bền nhiệt

2) Thông tin về trình

tự ADN cho phép tổng hợp các đoạn mồi đặc hiệu để nhân dòng các đoạn ADN đích

Phương pháp

Các yêu cầu tối thiểu

Phát hiện đặc hiệu

Các kỹ thuật lai axit nucleic

1) Sử dụng các mẫu

dò ADN/ARN được đánh dấu

2) Phát hiện các phân đoạn liên kết mẫu dò

Trang 16

Các phương pháp lai axit nucleic và mẫu dò

Biến tính

ADN đích

(Hỗn hợp gồm nhiều phân đoạn ADN khác nhau)

Mẫu dò ADN

(Thường là đồng nhất và được đánh dấu)

Trang 17

Các phương pháp lai axit nucleic

Các loại

mẫu dò

Các loại mẫu dò

Loại

ADN được nhân dòng bằng tế bào hoặc PCR

Phiên mã từ đoạn ADN cài Tổng hợp hóa học

Nguồn gốc

Thường dạng sợi kép:

0,1 – vài trăm kb với mẫu dò nhân dòng tế bào; 0,1 – 20 kb với mẫu dò nhân dòng PCR

Dùng phản ứng tổng hợp ADN nhờ ADN polymerase

Kỹ thuật

đánh dấu

Phiên mã từ ADN được nhân dòng

Đánh dấu đầu cuối (vd: dùng kinase)

Trang 18

Các phương pháp

lai axit nucleic

Bắt cặp hoàn toàn

Mẫu dò truyền thống

Mẫu dò oligonucleotide

Bắt cặp sai đơn nucleotide (vd: các alen)

Trang 19

Ví dụ về Technical Notes

Trang 20

Trang 21

Trang 22

Trang 23

Trang 24

Trang 25

Ứng dụng để nghiên cứu các mẫu Việt Nam

Trang 26

Trang 27

Trang 28

Mẫu dò đánh dấu phóng xạ

ADN liên kết vào màng qua khung đường - phosphate

Khuẩn lạc/Tế bào được

chuyển lên màng lai (màng

nylon hoặc nitrocellulose)

Trang 29

Xác định tế bào / khuẩn lạc dương tính

Màng được rửa rồi chụp

bằng phim tia X

Mẫu dò phóng xạ

Rửa

Phim tia X

Màng

Chuyển tế bào / vi khuẩn sang môi trường nuôi cấy để tiếp tục phân tích hoặc dùng cho nghiên cứu khác

Ảnh phóng xạ tự chụp

cho biết tế bào/ khuẩn lạc mang

ADN tái tổ hợp được quan tâm

Cấy chuyển khuẩn lạc/tế bào mang ADN tái

tổ hợp lai với mẫu dò

Trang 30

CÁC KỸ

THUẬT PHÂN

TÍCH AXIT

NUCLEIC

Chip microarray Một phân ô

của chip Điểm chứa các bản sao của một phân

đoạn ADN duy nhất

Một phần của phân đoạn ADN

Bazơ nitơ

a) Cấu trúc của chip ADN

b) Phát hiện sản phẩm lai ADN - cADN

c) Phân tích bằng phần mềm máy tính để xác định gen đáp ứng với thuốc

Phá vỡ tế bào, rồi tách chiết ARN; từ đó tổng hợp nên cADN được đánh dấu huỳnh quang

cADN từ

tế bào không được xử lý

cADN Kết cặp

cADN

từ tế bào được

xử lý

ADN chip

Các kiểu phản ứng

Gen biểu hiện tăng lên ở

tế bào được xử lý Gen biểu hiện giảm đi ở

tế bào được xử lý Gen biểu hiện ở mức giống tế bào đối chứng Gen không biểu hiện ở cả hai nhóm tế bào

Trang 31

bản sao của một phân đoạn ADN duy nhất

Một phần của phân đoạn ADN

Bazơ nitơ

Lai axit nucleic là nền tảng của

công nghệ ADN chip microarray

a) Cấu trúc của chip ADN

Trang 32

b) Phát hiện sản phẩm lai ADN - cADN

cADN

Kết cặp

cADN

từ tế bào được

xử lý ADN

chip

Các kiểu phản ứng

Trang 33

c) Phân tích bằng phần mềm máy tính để xác định gen đáp ứng với thuốc / gen ung thư, v.v

Gen biểu hiện tăng lên ở

tế bào được xử lý

Gen biểu hiện giảm đi ở

tế bào được xử lý

Gen biểu hiện ở mức

giống tế bào đối chứng

Gen không biểu hiện ở cả

hai nhóm tế bào

Trang 34

Nhãm khãa

®Çu C5’-OH

Nucleotide tiÕp theo nèi vµo ®©y

Deoxyribose

Phosphoamidite

Nhãm diisopropylamino

Phosphoamidine - tiÒn chÊt tæng hîp c¸c oligonucleotide

Nhãm DMT (dimethoxytrityl) cã vai trß khãa ®Çu C5'-OH vµ chØ

ph¶n øng víi nhãm phosphoamidite theo chiÒu 3'  5'

Trang 35

Hai phương ph¸p tæng hîp hãa häc c¸c gen hoµn chØnh

Tæng hîp c¸c oligonucleotide

Sù liªn kÕt gi÷a c¸c

®o¹n oligonucleotide

Nèi bëi ADN ligase

Tæng hîp c¸c oligonucleotide

Sù liªn kÕt gi÷a c¸c

®o¹n oligonucleotide

C¸c ®o¹n rçng ®-îc tæng hîp bëi ADN pol

Nèi bëi ADN ligase

§o¹n tæng hîp bëi ADN pol

a) Tæng hîp ADN hoµn

chØnh trªn c¶ 2 m¹ch

b) Tæng hîp tõng phÇn råi tæng hîp b»ng ADN pol

Trang 36

Phản ứng PCR giúp phân lập nhanh các đoạn ADN đích

• Số lượng bản sao phân đoạn ADN đích được nhân

gấp đôi sau mỗi chu kỳ PCR

– Dựa trên trình tự ADN biết trước (toàn bộ hoặc

một phần), các đoạn oligonucleotide ngắn có trình tự bổ sung tương ứng với hai đầu của trình

tự ADN đích được tổng hợp

– Các đoạn oligonucleotide này được dùng làm mồi

để sao chép ADN theo cơ chế tổng hợp của ADN polymerase

Trang 37

Các đoạn mồi oligonucleotide

bắt đầu sao chép ADN

Mồi xuôi

Mồi ngược Đoạn ADN đích

Trang 38

Sau mỗi chu kỳ lượng ADN đích

tăng gấp đôi

Tách chiết và tinh sạch ADN từ mẫu,

bổ sung ADN polymerase, cặp mồi oligonucleotide và bốn loại dNTP (dATP, dGTP, dCTP và dTTP)

Cặp mồi bắt cặp ở hai vùng biên của trình tự đích

Phản ứng trùng hợp kéo

dài bắt đầu tự vị trí của mồi

Lặp lại chu kỳ mới

1 94 o C trong

3 – 5 phút (chu kỳ đầu) hoặc 30’ (các chu kỳ sau)

2 50 o C-60 o C trong 1– 2 phút

3 72 o C trong 2– 5 phút

Trang 39

ADN được nhân dòng theo cấp số nhân

Giai đoạn biến tính Giai đoạn bắt cặp Giai đoạn kéo dài chuỗi

Trang 40

1 bản sao

2 bản sao

4 bản sao

Trang 41

Ứng dụng của PCR

• Lập bản đồ gen

• Xác định kiểu gen

• Phân tích các trình tự ADN

• Các nghiên cứu tiến hóa

– So sánh các trình tự tương đồng giữa các loài có quan hệ với nhau

– So sánh trình tự từ các nguồn mẫu khác nhau

– Nghiên cứu đa dạng di truyền

• Chẩn đoán bệnh di truyền / bệnh truyền nhiễm

Trang 42

Phân tích trình tự ADN

 Hầu hết các dự án giải trình tự ADN đến nay đều

dideoxy-ribonucleotide (ddNTP) cuối cùng được biết trước

 Phương pháp Sanger nhanh, hiệu quả và phổ biến hơn cả, đặc biệt dễ tự động hóa

 Các hai kỹ thuật đều đạt độ chính xác 99,9%

Trang 43

Nguyên lý của phương pháp Sanger (1)

Đánh dấu

Chia hỗn hợp vào 4 ống rồi bổ sung mỗi loại ddNTP vào mỗi ống

Trang 44

Sự kết hợp của ddTTP làm dừng phản ứng kéo dài

Trang 45

Nguyên lý của phương pháp Sanger (3)

Phân tích các phân đoạn bằng điện di Mạch ADN được

tổng hợp

Mạch ADN làm khuôn

Trang 46

Giải trình tự ADN tự động (1)

(1) Tập hợp các phân đoạn ADN; mỗi

phân đoạn được đánh dấu huỳnh

quang đặc thù tương ứng với bazơ

nitơ ở tận cùng đầu 3’

(2) Các phân đoạn được phân

tách bằng điện di mao quản

(3) Khi các phân đoạn đi qua

nguồn sáng laze, chúng phát

huỳnh quang và tín hiệu được ghi

lại bằng một thiết bị đo Trình tự

tín hiệu đo được được máy tính

chuyển thành trình tự nucleotide

Máy tính

Nguồn laze

Gel

Trang 47

 Kết quả từ một phản ứng giải trình tự

ADN tự động

 Mỗi làn phản ánh trình tự thu được từ một mẫu ADN với việc sử dụng một mồi nhất định

Trang 48

 Máy tính đọc trình tự bổ sung với mạch khuôn theo chiều từ trái qua phải (tương ứng chiều 5’  3’) Chương trình máy tính tự động suy ra trình tự mạch khuôn Các nucleotide bị “nhiễu”

được ghi là “N” và đôi khi có thể suy luận được bằng các kỹ

thuật bổ trợ hoặc bởi cán bộ nghiên cứu giàu kinh nghiệm

Trang 49

Giải trình tự các phân đoạn dài

 Giải trình tự bắt đầu từ cả hai đầu của đoạn cài trong véctơ nhân dòng

 Trình tự mồi mới sẽ được suy ra từ trình tự

được xác định trong chu kỳ phân tích trước đó

Trang 50

 Phương pháp giải trình tự ngẫu nhiên toàn hệ gen

“phân cắt” thành nhiều phân đoạn nhỏ rồi được nhân dòng riêng biệt

 Xác định trình tự từ tất cả các dòng ADN thu được

tính để xếp các trình tự ngắn thành trình tự dài liên tục và đầy đủ

Giải trình tự ADN hệ gen lớn

Trang 51

Giải trình tự ADN tốc độ cao

 Giải trình tự ngẫu nhiên dư thừa:

 Thông tin về trình tự được xác định gấp 3 – 4 lần so với số

bazơ thực tế có từ dòng gốc, từ đó có thể xác định được trình

tự đầy đủ của trình tự ADN gốc

 Cần có nhiều máy giải trình tự đồng thời

 Phương pháp “bước nối tiếp”

 Không cần giải trình tự dư thừa

tự đều cần tạo được cặp mồi mới

Trang 52

Xác định vai trò và chức năng gen

So sánh trình tự của galactokinase tõ c¸c loµi kh¸c nhau a) Ph¶n øng

xóc t¸c bëi enzym galactokinase b) So sánh một đoạn trình tự axit amin cña

galactokinase giữa c¸c loµi

Hs: Homo sapiens, Sc: Saccharomyces cerevisiae, Ec: Escherichia coli,

Bs: Bacillus subtilis, Ca: Candida albicans, Hi: Haemophilus influenza, St: Salmonella typhimurium, Kl: Kluyveromyces lactis, At: Arabidopsis thaliana

Galactokinase

a)

b)

Trang 53

Trang 54

 Không giống ADN vốn giống nhau về cấu trúc và thành phần (chỉ khác nhau về trình tự nucleotide), các protein khác nhau nhiều kích thước, hình dạng, điện tích và chức năng

 Protein rất dễ bị biến tính và phân hủy nhanh sau khi được giải phóng khỏi tế bào Vì lý do này, hầu hết quá trình chuẩn bị các dịch chiết và tinh sạch protein cần được tiến hành ở nhiệt độ lạnh (dưới 4oC)

 Trước khi tách chiết và tinh sạch protein, các tế bào thường được phân giải bằng hóa chất, bằng các biện pháp cơ học hoặc bằng xử lý với dung dịch nhược trương v.v

 Trong nhiều trường hợp, các tế bào được chuyển về trạng thái đông

lạnh, ví dụ: bằng máy cô lạnh chân không, sau đó được nghiền bằng máy nghiền mẫu trước khi tiến hành chiết xuất và tinh sạch protein

Trang 55

Sử dụng sắc ký cột để tinh sạch protein

Sắc ký cột để tinh sạch protein a) Sắc ký trao đổi ion , b) Sắc ký lọc gel

(vẽ theo Watson et al., 2004)

Trang 56

Rửa tách bằng histidine hoặc imidazole

Các protein khác được rửa trôi

Trang 57

Đun với SDS Na+

Protein (cuộn gập)

Protein (biến tính)

Biến tính Protein bởi SDS (điện di SDS – PAGE)

Phân tích protein trên gel acrylamide

Trang 58

Điện di trên gel PAGE-SDS

Trang 59

Hỗn hợp protein

Chạy điện di

Ống đựng

Các băng protein

1) Lấy gel khỏi ống 2) Xử lý SDS 3) Chạy điện

di chiếu 2

Điện di hai chiều (2-D gel electrophoresis)

Trang 60

Hình ảnh điện

di hai chiều

protein thu từ

mô não chuột

Trang 62

Bổ sung kháng thể thứ hai cùng alkaline phosphatase

Bổ sung X-phos

Kháng thể thứ nhất liên kết đặc hiệu protein

Kháng thể thứ hai liên kết với kháng thể thứ nhất

Băng màu xanh cho biết vị trí của protein đặc hiệu

Trang 63

Giải trình tự protein

Phản ứng biến tính Edman

Đánh dấu axit amin đầu N

Giải phóng axit amin đầu N

Đánh dấu axit amin đầu N

Giải phóng axit amin đầu N

Phương pháp biến tính Edman

Trang 64

Tia laser Protein mẫu ở

dạng tinh thể được gắn lên chất mang

Chất mang Protein mẫu

bị ion hóa Lưới tích điện

Vùng chuyển trạng thái

Trang 65

Mao quản dẫn mẫu

Dung dịch

chứa mẫu Giọt dịch

mang mẫu

Hạt ion trần

Vùng chuyển trạng thái

Lưới tích điện

Giải trình tự protein

Trang 66

Phân tích tương tác protein

Gen chỉ thị

Protein

“mồi”

Miền liên kết ADN

Protein

“săn mồi”

Miền hoạt hóa ARNpol

• Hai protein lai được tái tổ hợp với các miền khác nhau của yếu tố phiên mã

• Gen lai được biểu hiện trong tế bào nấm men chứa gen chỉ thị có trình tự

khởi động được điều khiển bởi miền liên kết ADN

Hệ thống lai hai dòng ở nấm men

ARNpol

Tiêu đề	Phân Tích Gen Và Sản Phẩm Của Gen (Một Số Kỹ Thuật SHPT Ứng Dụng Trong Y Học)
Tác giả	Đinh Đoàn Long
Người hướng dẫn	Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở
Trường học	Trường Đại Học
Chuyên ngành	Sinh Học Phân Tử & Di Truyền Học
Thể loại	Bài Giảng

Định dạng
Số trang	69
Dung lượng	2,72 MB