Trang 2 Nhắc lại về phản ứng chuỗi trựng hợp – PCR Polymerase Chain Reaction• Nguyờn tắc của PCR?oDNA mẫu templateo2 đoạn mồi primeroTaq pol tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus/ Pfu poltá
11/7/2014 Khoa Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội Bộ môn Y Dược học sở PCR chẩn đoán phân tử ThS Phạm Thị Hồng Nhung Những phát minh có ý nghĩa cách mạng Sinh học phân tử Kary Mullis 11/7/2014 Nhắc lại phản ứng chuỗi trùng hợp – PCR (Polymerase Chain Reaction) • Khỏi nim v PCR Phản ứng nhân đoạn DNA nhê enzyme polymerase in vitro với đoạn mồi trªn máy PCR ã Nguyờn tc ca PCR? Mỏy PCR Prime (Anh) o DNA mẫu (template) o đoạn mồi (primer) o Taq pol (t¸ch tõ vi khuÈn Thermus aquaticus)/ Pfu pol (tách từ vi khuẩn Archaea)/ o Bốn loại deoxirinucleotide triphotphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) o Dung dịch đệm (Pol Buffer) o (Ion Mg2+) Phương pháp tiến hành PCR 11/7/2014 Ứng dụng PCR nghiên cứu di truyền học người • Chẩn đốn bệnh o Các bệnh nhiễm trùng virut, vi khuẩn, nấm o HIV/AIDS,… o Chẩn đốn ung thư q trình theo dõi bệnh • Tư vấn di truyền y học o Chẩn đoán nhanh bệnh di truyền dị tật bẩm sinh o Chẩn đốn sớm sinh gái/trai khơng cần chọc ối • Khoa học hình o Xác định danh tính tội phạm, nạn nhân dựa vào vết máu khô, sợi tóc, nước bọt, tinh dịch o Xác định huyết thống Ứng dụng PCR nghiên cứu di truyền học người • Di truyền dược lý o Tiên lượng khả đáp ứng thuốc cá thể, từ lựa chọn loại thuốc liều lượng thuốc thích hợp 11/7/2014 Ứng dụng chẩn đốn • Ưu điểm o Chỉ cần lượng DNA nhỏ để chẩn đoán Người lớn: tế bào máu, niêm mạc Bào thai: lượng nhỏ lông tơ màng đệm o Độ nhạy cao o Thời gian thực nhanh (~3 giờ) o Đơn giản tốn • Nhược điểm o Giới hạn độ dài đoạn gen đích nhân lên thường khơng q 1.5 kb o Ngoại nhiễm o Sai sót Taq pol Ứng dụng chẩn đoán Real-time PCR (Q-PCR) o Phát định lượng (quantitative) sản phẩm khuếch đại phản ứng diễn dựa sở phát huỳnh quang o Hai tác nhân phát huỳnh chính: Tác nhân gắn vào DNA mạch đơi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ) 11/7/2014 Ứng dụng chẩn đoán Real-time PCR (Q-PCR) Đường (baseline): số chu kỳ PCR tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần chưa đạt ngưỡng nhận biết thiết bị Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): số chu kỳ PCR tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu Số lượng trình tự đích mẫu ban đầu cao số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát nhỏ, nghĩa giá trị Ct thấp Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang xanh SYBR cho năm mẫu, mẫu làm lần qPCR lặp lại Ứng dụng chẩn đoán Real-time PCR (Q-PCR) o Phát định lượng tác nhân gây bệnh người virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán theo dõi điều trị o Phát HCV, H.pylori, chẩn đoán sớm HIV trẻ em, phát thai nhi nhiễm Rubella, lao: o Trong bệnh phẩm sử dụng cặp mồi thiết kế để nhân vùng gene IS6110 IS6110 trình tự gắn chèn đặc trưng cho chủng vi khuẩn lao (Mycobacterium complex) diện với số lượng lớn DNA gene Mycobacterium xem đối tượng thích hợp để phát vi khuẩn lao Mẫu xét nghiệm kết luận dương tính kết phân tích “đường cong nóng chảy” cho thấy Tm sản phẩm PCR thu tương ứng với Tm vùng gene IS6110 nhân 11/7/2014 Ứng dụng chẩn đốn Reverse-Transcription PCR (RT-PCR) • Phát tác nhân gây bệnh virus có hệ gen RNA (retrovirus) • Phát sớm xác virus Dengue máu bệnh sốt xuất huyết vòng ngày mắc bệnh Chỉ thị RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA Nguyên tắc RAPD = PCR + cặp mồi nhẫu nhiên Chỉ thị RAPD có số đặc tính sau: Khơng cần biết trước trình tự ADN Kích thước đoạn mồi: 9-12 Nu, tối thiểu Nu Số lượng mồi không hạn chế Ứng dụng • Phân tích tính đa hình phân biệt hình thái khơng hiệu • Định loại tác nhân gây bệnh (sán gan….) 11/7/2014 Chỉ thị RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA Băng điện di RAPD dòng ngô A&B; primer 2, cho thấy khác biệt dÊu chn RAPD cđa chóng Chỉ thị SSR - Simple sequence repeates Nguyên tắc SSR = PCR + cặp mồi trình tự vùng biên vùng lặp lại Chỉ chị SSR thường chuẩn bị qua bước sau: Tách đoạn DNA mang trình tự lặp lại đơn giản [GATA], [CGA], [GC] Xác định trình tự vùng biên trình tự lặp lại Thiết kế mồi tương ứng với trình tự vùng biên PCR với Nu đánh dấu phóng xạ Đánh giá tính đa dạng trình tự lặp lại sở sản phẩm thu từ phản ứng PCR( dùng phương pháp phóng xạ tự chụp) 11/7/2014 Nghiên cứu trường hợp: Chẩn đốn Hungtinton • Gen IT15/Hungtingtin nằm vị trí 4p16.3 nhân dịng năm 1993 • Đột biến gây bệnh mở rộng đoạn CAG exon • Protein huntingtin 348 kD đích tác động caspase 3- protease liên quan đến trình apoptosis tế bào thần kinh • Chuẩn đốn bệnh cách: Xác định kích thước đoạn lặp => xác định độ lặp lại [CAG] 17 24 46 41 A B C D A,B B,D A,C A,D B,C B,D C,D A,B 220 20 180 160 140 120 100 80 11/7/2014 Chỉ thị AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism Nguyên tắc AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu ADN hƯ gen tỉng sè C¾t b»ng enzym giới hạn Gắn đoạn nối (adaptor) Gắn đoạn mồi Thực hiƯn ph¶n øng PCR DÊu chn ADN 11/7/2014 Chỉ thị AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism Nguyên tắc AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu Ứng dụng - In dấu DNA, lập đồ DNA marker có hiệu so với marker khác (Vos ctv., 1995) - Tạo nhóm liên kết di truyền giống - Đánh giá mức độ liên hệ di truyền khác giống - Là công cụ hiệu để phát tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết khác biệt cá thể Chỉ thị RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism Nguyên tắc RFLP = PCR + cặp mồi đặc hiệu +enzym cắt giới hạn 10 11/7/2014 Nghiên cứu trường hợp: Sử dụng PCR- RFLP để xác định SNP liên quan đến đáp ứng thuốc www.themegallery.c Nghiên cứu trường hợp: Sử dụng PCR- RFLP để xác định SNP liên quan đến đáp ứng thuốc Y học Di truyền học Dược học Phân tích đa hình di truyền gen: mã hóa cho protein đích tác dụng thuốc mã hóa cho enzym chuyển hóa thuốc chất ngoại lai từ môi trường vào thể Xây dựng pháp đồ phòng điều trị bệnh hiệu cho cá nhân 11 11/7/2014 Nghiên cứu trường hợp : Sử dụng PCR- RFLP để xác định SNP liên quan đến đáp ứng thuốc Acetyl hố q trình thêm nhóm acetyl (CH3-C(=O)) vào hợp chất hữu Ví dụ phản ứng tổng hợp asipirin: Salicylic acid Acetylsalicylic acid (aspirin) Bằng cách acetyl hóa, phân tử acetyl hố tăng khả qua hàng rào máu não, hàng rào mạch Thuốc vận chuyển lên não nhanh hơn, làm tăng hiệu tác dụng chúng Sơ lược enzym N-Acetyltransferase người Acetyl hoá thuốc enzym N-acetyltransferase (NAT) bước chuyển hố vơ quan trọng giúp thể tránh khỏi phản ứng q khích với thuốc mơi trường Mã hố cho protein phân bố rải rác tất mơ NAT Mã hố cho protein hoạt động chủ yếu gan Khả chuyển hóa thuốc chất độc Giảm nguy mắc chứng bệnh ung thư, dị ứng 12 11/7/2014 SNP G857A có vai trị dược lý quan trọng Giảm hoạt tính enzym NAT2 Biến đổi cấu hình lập thể trung tâm xúc tác enzym G857A Gen NAT2 LOGO Tỉ số OD260/280 mẫu: 1,6 – 2,0 Hàm lượng ADN: 35 ng/µl – 400 ng/µl ADN đủ hàm lượng tinh cho phản ứng nhân PCR 23kb ADN tổng số tách chiết từ mẫu máu bảo quản EDTA LOGO 13 11/7/2014 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen NAT2 mang SNP quan tâm Mồi xuôi: 5’-GGAACAAATTGGACTTGG-3’ Mồi ngược: 5’-TCTAGCATGAATCACTCTGC-3’ 1093 bp Thành phần phản ứng ADN khuôn [Mg2+] dNTP Taq polymerase 100 – 250 ng mM 0,3 mM 1u/ 25 µl Mồi 0,3 mM Nồng độ Sản phẩm điện di gel agarose 1% Làn – 7: sản phẩm nhân dịng M: thang ADN chuẩn kích thước 1kb M LOGO 1093 bp 819 bp 238 bp Sản phẩm PCR cắt BamHI gel agarose 2% M: ADN chuẩn kích thước 100bp Các – 3, 5, 6: Đồng hợp tử GG Các 7, 8: Đồng hợp tử AA Làn 4: Dị hợp tử AG LOGO 14 11/7/2014 Quy trình PCR nhân dịng gen NAT2 Thành phần Nồng độ gốc Template Nồng độ hoạt Thể tích phản động ứng (20 µl) 100 – 250 ng µl mM 1.6 µl Mg2+ ? dNTP mM ? µl Buffer 10 X 1X µl ? 0.3 µM 1.5 µl 1u/µl ? Primer (x2) Taq DDW Chu trình nhiệt: Biến tính: 940C (4 min) 30 chu kỳ: 940C (30 sec) 570C (45 sec) 720C (90 sec) Kéo dài: 720C (10 min) µl 8.4 µl LOGO Báo cáo thực hành • Phần bắt buộc: báo cáo kết điện di sản phẩm PCR/ sản phẩm cắt • Phần tự chọn: chọn hình thức Trả lời câu hỏi: - Nêu vai trò thành phần phản ứng PCR? - Nêu nguyên tắc phương pháp PCR khác mà bạn biết (Assembly PCR (PCA), Inverse PCR, Nested PCR, Hot Start PCR…) Tìm báo có nội dung: sử dụng PCR để xác định bệnh 15