Bài giảng PCR và chẩn đoán phân tử

Trang 2 Nhắc lại về phản ứng chuỗi trựng hợp – PCR Polymerase Chain Reaction• Nguyờn tắc của PCR?oDNA mẫu templateo2 đoạn mồi primeroTaq pol tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus/ Pfu poltá

Khoa Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội

Bộ môn Y Dược học cơ sở

PCR và chẩn đoán phân tử

ThS Phạm Thị Hồng Nhung

Những phát minh có ý nghĩa cách mạng trong

Sinh học phân tử

Kary Mullis

Nhắc lại về phản ứng chuỗi trựng hợp – PCR

(Polymerase Chain Reaction)

• Nguyờn tắc của PCR?

o DNA mẫu (template)

o 2 đoạn mồi (primer)

o Taq pol (tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus)/ Pfu pol

(tách từ vi khuẩn Archaea)/

o Bốn loại deoxirinucleotide triphotphate (dATP, dTTP,

dGTP, dCTP)

o Dung dịch đệm (Pol Buffer)

o (Ion Mg 2+ )

Mỏy PCR Prime (Anh)

• Khỏi niệm về PCR

Phản ứng nhân bản đoạn DNA nhờ

enzyme polymerase in vitro với 2

đ oạn mồi trên máy PCR

Phương phỏp tiến hành PCR

Ứng dụng của PCR trong nghiên cứu di truyền học người

• Chẩn đoán bệnh

o Các bệnh nhiễm trùng do virut,

vi khuẩn, nấm

o HIV/AIDS,…

o Chẩn đoán ung thư và quá trình

theo dõi bệnh

• Tư vấn di truyền y học

o Chẩn đoán nhanh các bệnh di

truyền và dị tật bẩm sinh

o Chẩn đoán sớm sinh con

gái/trai không cần chọc ối

• Khoa học hình sự

o Xác định danh tính tội phạm,

nạn nhân dựa vào vết máu khô,

sợi tóc, nước bọt, tinh dịch

o Xác định huyết thống

Ứng dụng của PCR trong nghiên cứu di truyền học người

• Di truyền dược lý

o Tiên lượng khả năng đáp ứng thuốc của từng cá thể, từ đó lựa

chọn loại thuốc và liều lượng thuốc thích hợp

Ứng dụng trong chẩn đoán

• Ưu điểm

o Chỉ cần lượng DNA nhỏ để chẩn đoán Người lớn:

các tế bào máu, niêm mạc Bào thai: lượng nhỏ lông

tơ màng đệm

o Độ nhạy cao

o Thời gian thực hiện nhanh (~3 giờ)

o Đơn giản và ít tốn kém

• Nhược điểm

o Giới hạn của độ dài đoạn gen đích được nhân lên

thường không quá 1.5 kb

o Ngoại nhiễm

o Sai sót của Taq pol

Ứng dụng trong chẩn đoán

Real-time PCR (Q-PCR)

o Phát hiện và định lượng (quantitative) sản phẩm

khuếch đại khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở

phát huỳnh quang

o Hai tác nhân phát huỳnh chính:

Tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide,

SYBR Green, EvaGreen )

Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ).

Ứng dụng trong chẩn đoán

Real-time PCR (Q-PCR)

Đường nền (baseline): là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh

quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của

thiết bị

Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): là số chu kỳ PCR ở đó tín hiệu

đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền Số lượng trình tự đích trong mẫu ban

đầu càng cao thì số chu kỳ cần để vượt ngưỡng phát hiện càng nhỏ,

nghĩa là giá trị Ct càng thấp.

Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang xanh SYBR cho năm mẫu,

mỗi mẫu làm 3 lần qPCR lặp lại

Ứng dụng trong chẩn đoán

Real-time PCR (Q-PCR)

o Phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người

như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và

theo dõi điều trị

o Phát hiện HCV, H.pylori, chẩn đoán sớm HIV ở trẻ em,

phát hiện thai nhi nhiễm Rubella, lao:

o Trong bệnh phẩm sử dụng một cặp mồi được thiết kế để nhân

bản vùng gene IS6110 IS6110 là những trình tự gắn chèn đặc

trưng cho các chủng vi khuẩn lao (Mycobacterium complex)

và hiện diện với số lượng lớn trong DNA bộ gene của

Mycobacterium và được xem là đối tượng thích hợp nhất để

phát hiện vi khuẩn lao Mẫu xét nghiệm được kết luận là

dương tính khi kết quả phân tích “đường cong nóng chảy” cho

thấy Tm của sản phẩm PCR thu được tương ứng với Tm của

vùng gene IS6110 được nhân bản.

Reverse-Transcription PCR (RT-PCR)

Ứng dụng trong chẩn đoán

• Phát hiện các tác nhân gây

bệnh là virus có hệ gen là

RNA (retrovirus)

• Phát hiện sớm và chính

xác virus Dengue trong

máu bệnh sốt xuất huyết

trong vòng 3 ngày đầu tiên

mắc bệnh

Chỉ thị RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA

Nguyên tắc

Chỉ thị RAPD có một số đặc tính sau:

1 Không cần biết trước trình tự ADN

2 Kích thước các đoạn mồi: 9-12 Nu, tối thiểu là 4 Nu

3 Số lượng mồi không hạn chế

RAPD = PCR + các cặp mồi nhẫu nhiên

Ứng dụng chính

hiệu quả

• Định loại tác nhân gây bệnh (sán lá gan….)

B¨ng ®iÖn di RAPD 2 dßng ng« A&B; c¸c primer 2, 4 vµ 5

cho thÊy sù kh¸c biÖt vÒ dÊu chuÈn RAPD cña chóng

Chỉ thị RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA

Chỉ thị SSR- Simple sequence repeates

Nguyên tắc

Chỉ chị SSR thường được chuẩn bị qua các bước sau:

[GATA], [CGA], [GC]

3 Thiết kế mồitương ứng với các trình tự vùng biên

5 Đánh giá tính đa dạngvề các trình tự lặp lại trên cơ sở các

sản phẩm thu được từ phản ứng PCR( dùng phương pháp

phóng xạ tự chụp)

SSR = PCR + cặp mồi tại trình tự vùng biên các vùng lặp lại

• Gen IT15/Hungtingtin nằm ở vị trí

4p16.3 được nhân dòng năm 1993

• Đột biến gây bệnh mở rộng đoạn

CAG ở exon 1

• Protein huntingtin 348 kD là đích tác

động của caspase 3- một protease liên

quan đến quá trình apoptosis ở tế bào

thần kinh

• Chuẩn đoán bệnh bằng cách: Xác

định kích thước đoạn lặp => xác định

độ lặp lại của [CAG]

Nghiên cứu trường hợp: Chẩn đoán Hungtinton

220

20

180

160

140

120

100

80

A,B B,D A,C A,D B,C B,D C,D A,B

A

B

C

D

17 24 46 41

Nguyên tắc

AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu

Chỉ thị AFLP- Amplified Fragment Length Polymorphism

ADN hÖ gen tæng sè C¾t b»ng enzym giíi h¹n

G¾n ®o¹n nèi (adaptor)

G¾n ®o¹n måi

Thùc hiÖn ph¶n øng PCR

Nguyên tắc

Ứng dụng

- In dấu DNA, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so

với những marker khác (Vos và ctv., 1995)

- Tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống

- Đánh giá mức độ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa

các giống

- Là công cụ hiệu quả để phát hiện tính chất đa hình nên dễ

dàng nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể

AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu

Chỉ thị AFLP- Amplified Fragment Length Polymorphism

Chỉ thị RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism

Nguyên tắc

RFLP = PCR + cặp mồi đặc hiệu +enzym cắt giới hạn

Nghiên cứu trường hợp: Sử dụng PCR- RFLP để

xác định các SNP liên quan đến đáp ứng thuốc

Phân tích các đa hình di truyền các gen:

mã hóa cho các protein là đích tác dụng

của thuốc

mã hóa cho các enzym chuyển hóa thuốc

cùng các chất ngoại lai từ môi trường vào

cơ thể.

Xây dựng pháp đồ phòng và điều trị bệnh hiệu quả

cho từng cá nhân Nghiên cứu trường hợp: Sử dụng PCR- RFLP để

xác định các SNP liên quan đến đáp ứng thuốc

Acetyl hoá là quá trình thêm nhóm acetyl (CH3

-C(=O)-) vào một hợp chất hữu cơ Ví dụ như trong phản ứng

tổng hợp asipirin:

Bằng cách acetyl hóa, những phân tử được acetyl hoá

có thể tăng khả năng đi qua được hàng rào máu não,

hàng rào mạch

Thuốc có thể vận chuyển lên não nhanh hơn, làm

tăng hiệu quả tác dụng của chúng.

Salicylic acid Acetylsalicylic acid

(aspirin)

Nghiên cứu trường hợp : Sử dụng PCR- RFLP để

xác định các SNP liên quan đến đáp ứng thuốc

Mã hoá cho protein hoạt động chủ yếu ở gan

NAT

Mã hoá cho protein phân bố rải rác ở tất cả các mô

 Khả năng chuyển hóa thuốc và các chất độc.

 Giảm nguy cơ mắc các chứng bệnh ung thư, dị ứng.

Sơ lược về enzym N-Acetyltransferase 2 ở người

Acetyl hoá các thuốc bởi enzym N-acetyltransferase (NAT)

là một bước chuyển hoá vô cùng quan trọng giúp cơ thể tránh

khỏi các phản ứng quá khích với thuốc và môi trường

SNP G857A có vai trò dược lý quan trọng

Biến đổi cấu hình lập thể tại trung tâm xúc tác của enzym

Giảm hoạt tính của enzym NAT2

G857A

Gen NAT2

ADN tổng số tách chiết được từ các mẫu máu bảo quản trong EDTA

23kb

 Tỉ số OD260/280các mẫu: 1,6 – 2,0

 Hàm lượng ADN: 35 ng/µl – 400 ng/µl

ADN đủ hàm lượng và tinh sạch cho phản ứng nhân bản bằng PCR

Sản phẩm điện di trên gel agarose 1%

Làn 1 – 7: sản phẩm nhân dòng

M: thang ADN chuẩn kích thước 1kb

1093 bp

Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen NAT2 mang các SNP được quan tâm

Thành phần

Taq polymerase 1u/ 25 µ l

Mồi xuôi: 5’-GGAACAAATTGGACTTGG-3’

Mồi ngược: 5’-TCTAGCATGAATCACTCTGC-3’

LOGO

819 bp

Sản phẩm PCR được cắt bằng BamHI trên gel agarose 2%

M: ADN chuẩn kích thước 100bp

Các làn 1 – 3, 5, 6: Đồng hợp tử GG Các làn 7, 8: Đồng hợp tử AA

M 1 2 3 4 5 6 7 8

238 bp

1093 bp

Quy trình PCR nhân dòng gen NAT2

Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ hoạt

động

Thể tích một phản

ứng (20 µl)

Primer

Chu trình nhiệt:

Biến tính: 94 0 C (4 min)

30 chu kỳ: 94 0 C (30 sec)

57 0 C (45 sec)

72 0 C (90 sec) Kéo dài: 72 0 C (10 min)

Báo cáo thực hành

• Phần bắt buộc: báo cáo kết quả điện di sản phẩm

PCR/ sản phẩm cắt

• Phần tự chọn : chọn 1 trong 2 hình thức

1 Trả lời câu hỏi:

- Nêu vai trò của các thành phần trong phản ứng

PCR?

- Nêu nguyên tắc của các phương pháp PCR khác mà

bạn biết (Assembly PCR (PCA), Inverse PCR,

Nested PCR, Hot Start PCR…)

2 Tìm bài báo có nội dung: sử dụng PCR để xác định

một bệnh nào đó