Chản đoán phân tử và Phòng ngừa Thalssemia ở Singapore. TS.Samuel S. Chong

Ch n đốn phân t Phị ng a Thalssemia Phòng Th l i Singapore g p TS.Samuel S Chong Khoa Nhi, Tr ng Y D c Yong Loo Lin, i h c Qu c g gia Singapore g p Trung tâm ch n đốn phân t , Khoa Thí Nghi m Y khoa, H th ng s c kh e i h c Qu c gia Trung tâm ch n đoán phân t , Vi n Y h c Nhi , H th ng s c kh e i h c Qu c gia Thalassemia • Các b nh di truy n đ n gen ph bi n nh t – l n • Ph bi n nh t: α- and β- thalassemia • Nh ng m khuy t di truy n gây suy gi m t ng h p chu i globin: α- β-globin • Xu t phát t m t t Hy l p (θαλασσα) - “bi bi n n”, ngu n g c t Trung H i • Phân b t p trung ơng Nam Á Á • Liên quan đ n m t lo t nh ng bi u hi n lâm sàng a Trung H i, Trung a ông, ti u l c đ a n – α-thalassemia - Hb Bart’s: Thai ch t l u – β-thalassemia – tr máu • ng thành: truy n máu tùy m c đ thi u Khi m khuy t phân t t đ t bi n m đ n m t đo n n α Thalassemia α-Thalassemia • α-thalassemia – Sai h ng c m gen α-globin NST 16p13.3 μ – Ph bi n nh h t d m t đo đ n t ê m t hay h t t c gen α-globin (HBA2/α2 globin HBA1/α1 globin), gen HBZ (ζ globin) – t bi n m không ph bi n Nh ng m t đo n α-Thalassemia ph h bi n IZ-HVR 3’-HVR μ -α3.7 -α4.2 SEA SEA -(α)20.5 MED FIL FIL THAI Quan h ki u hình – ki u gen g Ki u hình Bình th Ki u gen ng / D h pα α-thalassemia thalassemia “silent carrier” -α/αα / D h p α-thalassemia “α-thal trait” // ng h p α-thalassemia “α α-thal thal trait trait” -α/-α Hb H disease (β4) /-α Bart’s hydrops fetalis (γ4) / S phân b nh ng đ t bi n αTh l Thalassemia i Si Singapore SEA (70.6%) Thai (0 9%) (0.9%) Fil ((0.4%)) Unk (0.6%) Other (1.2%) αCd59α ((0.6%)) αCd30α (0.1%) -α3.7 (19.1%) αQSα 42 -α4.2 (4.3%) αCSα (1.5%) (1 1%) (1.1%) N=3056 National Thalassemia Registry Gap-PCR: Phát hi n nh ng m t đ nl n đo M i xuôi M i ng M i ng c 5’ c 3’ 0.5kb M t đo n 20kb 0.5kb PCR PCR o n 1.5 kb PCR n kb PCR Gap-PCR: Gap PCR: Phát hi n đ t bi n SEA M t đo n SEA SEA-F ζζ2 M / SEA-R1 μ ψα1 ψ SEA-R2 α2 θ1 / SEA // SEA SEA/ 851 bp p 602 bp Allele không g b m t đo n Allele b m t đo n SEA Multiplex Gap-PCR: Phát hi n đ ng th i m t đo n α-Globin THAI-F 4.2-F FIL-F SEA-F α2-R 4.2-R α2/3.7-F 3.7-R THAI-R FIL-R SEA-R μ IZ-HVR -α3 α3.7 -α4.2 SEA -(α)20.5 ( ) MED FIL THAI 3’-HVR kb 2.5 kb kb 1.5 kb kb 75 kb 5 kb αα α/-α3.7 -α3.7 /-α3.7 αα α/-α4.2 -α3.7 /-α4.2 αα α/ SEA -α3.7 / SEA -α4.2 / SEA SSEA / SEA αα α/ THAI -α3.7 / THAI αα α/-(α)20.5 αα α/ MED MED / MED D M -(α α)20.5 / MEED αα α/ FIL SSEA / FIL Multiplex Gap-PCR: Nh ng m t đo n α-Globin đ Gl bi M αα α LIS1 -α3.7 α22 -α4.2 SEA THAI -(α)20.5 MED FIL Nh ng đ t bi n gen β β-Globin Globin Thompson & Thompson Genetics in Medicine, 7th Ed., 2007 S phân b nh ng đ t bi n βThalassemia Singapore Cds41/42 (ΔTCTT) (27 3%) (27.3%) IVS2,654 (C→T) (22 3%) (22.3%) Unknown (0.6%) HbE (20 5%) (20.5%) -28 (A→G) (6 6%) (6.6%) 42 mutations (9.1%) IVS1,1 (G→T) (1.3%) Cds71/72 (+A) (1.2%) IVS1,5 (G→C) (6.4%) Cd17 (A→T) (4.9%) N=2409 National Thalassemia Registry Gi i ttrình ì h t gen β-Globin β Gl bi β-globin gene ~1700 bp CCAAT ATAAA Exon ~800 bp Exon Exon ~600 bp Gi i trình t gen: cd41/42 ΔTCTT Codon 39 40 41 42 43 44 S Sense sequence nl: CAG AGG TTC TTT GAG TCC mt: CAG AGG TTG AGT CC A ti Antisense sequence nl: GGA CTC AAA GAA CCT CTG mt: GGA CTC AAC CTC TG +/Δ sense e C/T antise ense Gi i trình t g gen: IVS II,654 C→T G/A Minisequencing / Single Base E Extension i (SBE) Primer Template 5’ 3’ CCATGACTGATTCC NNNNNNAGCCTGGTACTGACTAAGGCNNNNNNN Mutation site ddTTP + ddCTP + ddATP + ddGTP Extend and Terminate dd CCATGACTGATTCC G NNNNNNAGCCTGGTACTGACTAAGGCNNNNNNN Applied Biosystems Minisequencing: q g IVS II,654 , C→T 654-F PCR: 5’ 3’ TTAAGG C/T AATAGC 654-R SBE SBE: Wild-type allele (C) TA SNP 654 3’ CE: C G C AATTCC G TTATCG C normal Mutant allele (T) A G SNP 654 5’ C T carrier 3’ T AATTCC A TTATCG T affected 5’ Multiplex Minisequencing (II) Applied Biosystems Multiplex u t p e Minisequencing seque c g ((III)) Applied Biosystems Các primer c a Multiplex Minisequencing Cd0-F Cd30-F HBA2 panel G C G C T A SD-F QS-F CS-F T A T A T A A T Cd59-R Ps-R -29-F Cd41/42-F HBB panel A aa tt A T G C g c C G Cd71/72-F InII 654-F G C c g InI 5-R -28-R Cd17-R Cd19-F Cd26-R Cd27/28-F Cd35-F HBB panel B Cd0-F T A A A T T T A g c C G InI 1-R Cd8/9-R Δ619-F G C Cd43-R 5’ Δ619 breakpoint S n ph m Multiplex Minisequencing: i n di mao qu n t i v trí t í c a b đ t bi n A Normal Cd41-42 / IVSIInt654 compound heterozygote ΔTCTT InI5 Cd41/42 -29 C→T Cd26 -28 Cd17 IVSII654 Cd71/72 S n ph m Multiplex Minisequencing: i n di mao qu n t i v trí t í c a b đ t bi n B Normal Cd43 / β heterozygote G→A InI1 Cd0 Cd43 Δ619 Cd19 Cd27/28 Cd8/9 Cd35 HBA2 Gene Multiplex Minisequencing – GeneScan™ Chromatograms / T→C αCSα / SEA T→A αPsα / Cd0 CS Cd30 Ps SD QS Cd59 HBB HBA2 Minisequencing q g Các b sàng l c đ t bi n HBB B A • IVS1,5 G→C,T,A • Cd41 ΔC • Cd41/42 ΔTCTT • -29 A→G • Cd26 G→A • -28 A→G,C • Cd17 A→T • Cd71/72 ∇A • IVS2,654 C→T HBB B B • IVS1,1 G→T,A • Cd0 T→G,C • Cd43 G→T • Cd19 A→G • Cd27/28 ∇C • Cd8/9 ∇G • Cd35 ΔC • Δ619bp B • • • • • • • HBA2 Cd0 ΔG Cd142 T→C (Const Sprg) Cd30 ΔGAG Cd142 A→T (Pakse) Cd109 T→G (Suan Dok) Cd125 T→C (Quong Sze) Cd59 G→A G A • Cám n ... HBB (gen β globin) – M t ? ?o n không ph bi n Nh ng đ t bi n gen β β-Globin Globin Thompson & Thompson Genetics in Medicine, 7th Ed., 2007 S phân b nh ng đ t bi n ? ?Thalassemia Singapore Cds41/42... m t ? ?o n n α Thalassemia α -Thalassemia • α -thalassemia – Sai h ng c m gen α-globin NST 16p13.3 μ – Ph bi n nh h t d m t ? ?o đ n t ê m t hay h t t c gen α-globin (HBA2/α2 globin HBA1/α1 globin),... ng m t ? ?o n α-Globin đ Gl bi M αα α LIS1 -α3.7 α22 -α4.2 SEA THAI -(α)20.5 MED FIL Gi i ttrình ì h t gen α2-Globin Gl bi CCAAT ATAAA Cap Exon Exon α2-globin l bi gene ~850 850 b bp Exon Gi