BỆNH ĐỘNG VẬT –QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN PHẦN XX: BỆNH TIÊU CHẢY CÓ MÀNG NHÀY DO VI RÚT Ở BÒ

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-XX : 2020 (Dự thảo 2) BỆNH ĐỘNG VẬT –QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN PHẦN XX: BỆNH TIÊU CHẢY CÓ MÀNG NHÀY DO VI RÚT Ở BÒ Animal diseases–Diagnostic procedure – Part XX: Bovine viral diarrhoea/mucosal disease HÀ NỘI – 2019 TCVN XXXX: 2019 Lời nói đầu TCVN 8400-XX : 2020 Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn sở tham khảo tài liệu Tổ chức Thú y giới (OIE) báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 47 phần: - TCVN 8400-1 : 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh vi khuẩn Streptococcus suis gây lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi Aspergillus gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ thương hàn gà; - TCVN 8400-13 : 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm Brucella; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù lợn vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh Staphylococcus aureus gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn; TCVN 8400 -XX : 2020 - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 phần 22: Bệnh giả dại lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán; - TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử Clostridium perfringens; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn lợn sau cai sữa Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy lợn Coronavirus; - TCVN 8400-39 : 2016: phần 39: Bệnh viêm đường hơ hấp mãn tính gà; - TCVN 8400-40 : 2016: phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết thủy cầm vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây - TCVN 8400-41 : 2019: phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi - TCVN 8400-42 : 2019: phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ; - TCVN 8400-43 : 2019: phần 43: Bệnh lưỡi xanh; - TCVN 8400-44 : 2019: phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis; - TCVN 8400-45 : 2019: phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò; TCVN XXXX: 2019 - TCVN 8400-46 : 2019: phần 46: Bệnh dại; - TCVN 8400-47 : 2019: phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển; TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-xx : 2020 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đốn – Phần XXXX: Bệnh tiêu chảy có màng nhày vi rút bò Animal diseases– Diagnostic procedure –Part XX: Bovine viral diarrhoea/mucosal disease CẢNH BÁO  Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất cả vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh tiêu chảy có màng nhày vi rút bị Tài liệu viện dẫn TCVN 8402 : 2010 Bệnh động vật – Quy trình mổ khám Thuật ngữ, định nghĩa từ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Bệnh tiêu chảy có màng nhày vi rút bị Là bệnh truyền nhiễm Pestivirus thuộc họ Flaviridae gây Động vật mắc bệnh có đặc điểm điển sốt cao, tăng tiết dịch mũi nước bọt, tiêu chảy có màng nhày với sợi tơ huyết, biểu triệu trứng đường hô hấp rối loạn sinh sản CHÚ THÍCH: Vi rút gây bệnh tiêu chảy có màng nhày có nhân ARN sợi đơn, bao bọc lớp vỏ nucleocapsid có quan hệ gần gũi với vi rút dịch tả lợn (CSF) vi rút bệnh biên giới (border disease virus -BDV) Vi rút BVDV có type gây bệnh chính: type type 3.2 Các từ viết tắt - CPE (Cytopathic effect): Biến đổi bệnh lý tế bào; TCVN XXXX: 2019 - DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium): Môi trường DMEM dùng cho nuôi cấy tế bào; - MDBK (Madin -Darby Bovine Kidney): tế bào thận bò; - FCS (Fetal calf serum): huyết thai bê; - ELISA (Enzyme -Linked Immunosorbent Assay): phản ứng miễn dịch liên kết enzyme; - Realtime RT-PCR (Realtime Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction): phản ứng phiên mã ngược trùng hợp chuỗi thời gian thực; - VNT (Virus neutralisation test): phản ứng trung hòa tế bào; - PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phosphat; - ARN (Acid ribonucleic): axit ribonucleic; - PI (Persistent Infection): thể mang trùng; - BVDV (Bovine viral diarrhea virus): vi rút gây tiêu chảy bò; - BDV (border disease virus): vi rút bệnh biên giới Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích,sử dụng nước cất, nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 4.1 Thuốc thử vật liệu cho lấy mẫu 4.1.1 Ethanol, từ 70 % (thể tích) đến ethanol tuyệt đối 4.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2 4.1.3 Ống nghiệm sạch, vơ trùng có chất chống đơng EDTA 4.2 Nguyên liệu thuốc thử dùng cho phân lập vi rút phản ứng trung hòa vi rút 4.2.1 Tế bào MDBK 4.2.2 Vi rút BVDV 4.2.3 Dung dịch DMEM 4.2.4 Huyết thai bê (FCS) TCVN 8400 -XX : 2020 4.2.5 Dung dịch trypan blue, 0,4 % 4.2.6 Trypsine 4.2.7 Dung dịch kháng sinh Penicycline/Streptomycine 4.2.8 DPBS, khơng có canxi magie 4.3 Thuốc thử vật liệu thử dùng cho PCR, Realtime RT-PCR 4.3.1 Kít tách chiết ARN 4.3.2 Kít nhân gen RT-PCR 4.3.3 Mồi xi, mồi ngược mẫu dị 4.3.4 Mẫu chuẩn dương, chứng nhận dương tính, RNA chuẩn dương tách chiết từ vi rút BVDV có giá trị Ct (Chu kỳ ngưỡng biết trước) 4.3.5 Nước tinh khiết, khơng có Rnase DNase 4.3.6 Dung dịch TBE (10X) 4.3.7 Bột agarose 4.3.8 Thang đo kích thước sản phẩm PCR (Ladder, Marker), độ phân dải 100 bp, dải đo (100 bp1000 bp), pha sẵn với loading dye việc sử dụng 4.3.9 Chất nhuộm màu ADN Ví dụ Gel red SYBR safe 4.4 Nguyên liệu vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym) 4.4.1 Kít ELISA Hiện kít ELISA thương mại có sẵn thị trường dùng để phát kháng thể BVDV, sử dụng phương pháp ELISA cần theo hướng dẫn nhà sản xuất 4.4.2 Nước cất khử ion Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường phòng thử nghiệm sinh học, bao gồm thiết bị, dụng cụ sau: 5.1 Thiết bị, dụng cụ chung 5.1.1 Tủ lạnh âm sâu, trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C TCVN XXXX: 2019 5.1.2 Tủ lạnh, trì nhiệt độ từ °C đến °C 5.1.3 Buồng cấy an toàn sinh học cấp II 5.1.4 Máy lắc trộn 5.1.5 Máy nghiền mẫu cối chày sứ vô trùng 5.1.6 Pank, kéo, vô trùng 5.1.7 Tăm bông, vô trùng 5.1.8 Xy lanh kim tiêm loại 18 G 5.1.9 Ống nghiệm đáy hình nón, vơ trùng, loại 15 ml 50 ml 5.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào phản ứng trung hịa vi rút 5.2.1 Kính hiển vi đảo ngược 5.2.2 Tủ ấm có chứa % CO2, trì 37 °C 5.2.3 Chai nuôi tế bào 25 cm2, 75 cm2 5.2.4 Đĩa nuôi tế bào 96 giếng 5.2.5 Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,2 m 5.2.6 Màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm 5.2.7 Buồng đếm hồng cầu 5.2.8 Bể điều nhiệt, trì nhiệt độ 37 °C 5.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp RT-PCR, realtime RT-PCR 5.3.1 Máy nhân gen (realtime-PCR; PCR) 5.3.2 Máy ly tâm, đạt tốc độ ly tâm 900 rpm; 000 rpm 20 000 rpm 5.3.3 Máy lắc trộn 5.3.4 Máy ly tâm lắng 5.3.5 Hệ thống điện di (bể điện di, khay đổ thạch, lược máy chụp gel) 5.3.6 Lị vi sóng TCVN 8400 -XX : 2020 5.3.7 Ống PCR, 0.2 ml 5.3.8 Ống eppendorf, khơng có Rnase DNase 5.4 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA 5.4.1 Máy đọc ELISA, đọc đĩa bước sóng 450 nm 5.4.2 Máy ủ nhiệt, trì nhiệt độ 37 °C Ngồi cịn có loại pipet đầu típ, ống nghiệm, đĩa petri vật tư tiêu hao phù hợp cho trình thực biện pháp kỹ thuật tiêu chuẩn Chẩn đoán lâm sàng 6.1 Đặc điểm dịch tễ Bò lứa tuổi cảm nhiễm với bệnh Tuy nhiên, loài động vật guốc chẵn khác dê, cừu, lợn có khả nhiễm bệnh Triệu chứng biểu rõ thường thấy bò từ tháng đến năm tuổi Vi rút BVDV thường lây lan qua 02 đường: tiếp xúc trực tiếp lây lan gián tiếp - Tiếp xúc trực tiếp: động vật mẫn cảm tiếp xúc trực tiếp với động vật mắc bệnh động vật mang trùng - Lây lan gián tiếp: bò mang thai nhiễm vi rút BVDV (loại không gây bệnh tích tế bào) thai kỳ truyền vi rút qua thai sang Bê sinh sống mang trùng suốt đời (Persitent infection-PI) thải vi rút ngồi mơi trường làm lây lan dịch bệnh Bê mang trùng nhiễm phải BVDV có độc lực cao vi rút BVDV thể tự biến đổi thành chủng có độc lực gây bệnh tiêu chảy có màng nhày, loét niêm mạc đường tiêu hóa chết Tỷ lệ động vật mang trùng (PI) dao động từ % - % Vi rút lây lan qua côn trùng, tinh dịch, sản phẩm sinh học khác 6.2 Triệu chứng lâm sàng 6.2.1 Thể cấp tính Triệu chứng lâm sàng biểu khác tùy theo độc lực vi rút động vật mẫn cảm Bị mắc bệnh có biểu sốt cao 40 °C, bỏ ăn, ủ rũ, tăng tiết dịch mũi, mắt nước bọt, giảm sản lượng sữa, khó thở, tiêu chảy Thời kỳ ủ bệnh thường từ ngày - 12 ngày có trường hợp muộn tới tháng có dấu hiệu lâm sàng bệnh - Bò giai đoạn động dục: dẫn tới vơ sinh TCVN XXXX: 2019 - Bị đực: nhiễm vi rút BVDV giảm chất lượng sản lượng tinh, thải vi rút qua tinh dịch - Bò mang thai: nhiễm vi rút trình mang thai dễ bị sảy thai, thai chết lưu Bê sinh cịn sống cịi cọc, chậm lớn khuyết tật dị hình Trường hợp, bò mang thai bị nhiễm vi rút giai đoạn từ 30 – 90 ngày thai kỳ, bê sinh mang trùng suốt đời 6.2.2 Thể mạn tính Có thể kéo dài vài tuần vài tháng triệu chứng chủ yếu tiêu chảy, số có tượng què 6.3 Bệnh tích - Thể cấp tính: bị mắc bệnh có biểu loét miệng, giảm bạch cầu, xuất huyết kết mạc mắt, niêm mạc miệng, mũi âm hộ Có thể xảy tượng máu khó đơng vết tiêm Xung huyết xuất huyết bề mặt mạc nội tạng Sưng hạch lâm ba, lở loét đường tiêu hóa Hoại tử hạch lympho, niêm mạc mảng Peyer bị xuất huyết hoại tử Giảm bạch cầu tiểu cầu - Thể mạn tính: bệnh tích tương tự thể cấp tính hoại tử rõ ràng Các tổn thương nhìn thấy loét khu trú niêm mạc manh tràng, đại tràng trực tràng 6.4 Chẩn đoán phân biệt Bệnh Lưỡi xanh: mắc tất động vật nhai lại, với tỷ lệ chết tới 30 % Con vật sốt, chảy nước mắt, nước mũi, khó thở, có xuất mụn nước vết loét quanh miệng, niêm mạc bị hoại tử bong tróc Lưỡi bị tím tái nhơ khỏi miệng Vành móng bị bong tróc xung huyết, vật đau móng bị què Bệnh sốt Catar ác tính: bệnh xảy chủ yếu lồi nhai lại, chủ yếu bệnh gia súc, trâu nước, bò rừng Mỹ hươu với tỷ lệ tử vong cao Bệnh có tính hệ thống tổn thương tìm thấy quan Các tổn thương viêm hoại tử biểu mơ đường hơ hấp, tiêu hóa tiết niệu; thâm nhiễm tế bào lympho biểu mô Xuất huyết có nhiều quan nhu mơ, đặc biệt hạch bạch huyết Chẩn đoán phịng thí nghiệm 7.1 Lấy mẫu bảo quản mẫu 7.1.1 Lấy mẫu 7.1.1.1 Mẫu dịch tiết: 10 TCVN XXXX: 2019 A.5 Trypsin-EDTA 1X A.5.1 Thành phần Trypsin –EDTA 10X PBS (Xem A.1) 100 ml 900 ml A.5.2 Cách chuẩn bị Lắc Trypsin PBS, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.2.6), sau chia nhỏ lượng ống bảo quản nhiệt độ –20 °C Sử dụng tốt tháng Phụ lục B (Quy định) Phương pháp cấy chuyển nuôi tế bào 22 TCVN 8400 -XX : 2020 B.1 Nguyên vật liệu Chai nuôi tế bào 25 cm2 phát triển thành lớp đạt 90 % bề mặt chai Môi trường nuôi tế bào (Xem A.4) Trypsin - EDTA 1X DPBS (Xem A.3) CHÚ Ý: Tất môi trường phải cân 37 oC tất vật tư dùng cho tế bào phải sấy vô trùng trước sử dụng B.2 Cách tiến hành - Hút bỏ môi trường chai tế bào 25 cm2 nuôi MDBK cell lớp 80 % bề mặt chai - Rửa bề mặt thảm tế bào ml DPBS 1X, tráng qua hút bỏ DPBS -Thêm 5ml Trypsin 1X-EDTA vào chai tế bào 25 cm láng lên bề mặt tế bào cho bề mặt tế bào phủ trypsin Ủ thời gian từ đến 10 tủ ấm 37 oC (5.2.2) Chú ý: Không để tế bào trypsin 15 Khi tế bào tách hết, bổ sung ml DMEM có 10 % FBS vào chai để vơ hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml - Ly tâm huyễn dịch tế bào gia tốc 200 rpm Loại bỏ phần dung dịch trên, giữ cặn tế bào - Hoàn nguyên cặn với ml DMEM bổ sung 10 % FBS, chuyển vào chai nuôi cấy 25 cm2 Nuôi chai tế bào tủ ấm 37 oC có % CO2 Theo dõi phát triển hàng ngày tế bào kính hiển vi soi ngược Sau ngày lại thay môi trường nuôi cấy Đến tế bào phát triển thành lớp bao phủ 90 % đĩa ni cấy lại tiến hành cấy chuyển lặp lại quy trình Phụ lục C (Quy định) Phương pháp xác định số lượng tế bào cách sử dụng Haemocytometer 23 TCVN XXXX: 2019 C.1 Các bước thực - Làm buồng đếm nắp kính - Nhẹ nhàng khuấy chai ni tế bào để trộn đồng - Hút 200 µl dung dịch tế bào vào ống eppendorf mới, bổ sung 200 µl Trypan Blue 0,4 %, trộn - Hút 100 µl dung dịch tế bào trypan blue vào buồng đếm- nhỏ dung dịch vào cạnh buồng đếm dung dịch theo mao dẫn vào đầy ngăn - Đếm tế bào sống (là tế bào khơng bị nhuộm màu trypan blue) hình vng góc C.2 Tính tốn kết quả: Ct = T x Tb x 1/4 x 104 Trong đó: Ct: Số lượng tế bào ban đầu có ml T: Tổng số tế bào góc vng Tb: Hệ số pha loãng dung dịch tế bào với trypan blue 1/4: Hệ số góc vng 104: Hệ số chuyển đổi Ví dụ: Đếm tổng số tế bào góc vng có 480 tế bào, Ct = 480 x x 1/4 x104 = 240 x 104 = 2,4 x 106 tb/ml Phụ lục D (Quy định) Cơng thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm(TCID50) Reed- Muench Cơng thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm (TCID50) Reed-Muench: 24 TCVN 8400 -XX : 2020 TCID50 = 10x Với X tính sau: X  A  50 (a  b)  a A B Trong đó: A B a b tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát 50 %, tính phần trăm (%) tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát 50 %, tính phần trăm (%) nồng độ pha loãng vi rút A (lấy giá trị số mũ) nồng độ pha loãng vi rút B (lấy giá trị số mũ) VÍ DỤ: Nồng độ vi rút pha loãng Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút (a) 10-6 -7 10 10-8 10-9 Phản ứng Giá trị cộng dồn Nhiễm Không nhiễm 5/5 4/5 2/5 0/5 Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút % Nhiễm Không nhiễm Tỷ số 11 11/11 100 6/7 2/6 0/9 86 33 CHÚ THÍCH: a) Số giếng nhiễm vi rút/số giếng gây nhiễm với lượng nhiễm 100 µl/giếng Mũi tên hướng tăng lên số nhiễm số khơng nhiễm Trong 100 µl dung dịch pha lỗng vi rút nhiễm vào giếng có: X 86  50 [( 7)  ( 8)]  ( 7) 7,68 86  33 Vậy TCID50 là: 107,68/ 100 µl dung dịch pha lỗng vi rút CHÚ THÍCH: Cách tính liều gây chết 50 % trứng thí nghiệm (EID 50) hay liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm (LD 50) tương tự Phụ lục E (Tham khảo) Quy trình tách chiết ARN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm có khả gây hại thao tác không cẩn thận Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da hít phải hóa 25 TCVN XXXX: 2019 chất Ln ln đeo găng tay, trang, mặc quần áo bảo hộ thực thao tác Hiện có nhiều loại kít chiết tách khác cung cấp thị trường Ví dụ: sử dụng kít chiết tách Qiagen RNeasy minikit1, bước chiết tách thực sau: E.1 Chuẩn bị Chuẩn bị dung dịch RLT (600 µl/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml vơ trùng Thêm 1/100 β-mercaptoetanol (βME) vào dung dịch RLT (sau bổ sung β-ME, dung dịch RLT giữ tháng nhiệt độ phòng) E.2 Cách tiến hành - Mẫu chuẩn bị (7.1.3) để chiết tách ARN - Nhỏ 200 l mẫu (7.1.3) vào ống eppendorf loại 1.5 ml có với 600 l RLT có % -ME (xem E.1, phụ lục E), lắc máy lắc trộn (5.3.3 ) ly tâm nhẹ (5.3.4) - Thêm 500 l ethanol 70 % vào ống, lắc mạnh máy lắc trộn, ly tâm nhẹ - Chuyển tất dịch sang cột lọc (spin column) đặt ống thu (collection tube), ly tâm 15 s với tốc độ ≥ 8000 rpm nhiệt độ phòng Bỏ ống thu dịch qua ly tâm - Đặt cột lọc vào ống thu Bổ sung 700 l dung dịch rửa (RW1 buffer) vào cột lọc, ly tâm 15 s gia tốc ≥ 8000 rpm, thay ống thu vào cột lọc - Nhỏ 500l dung dịch rửa RPE buffer vào cột lọc ly tâm 15 s tốc độ ≥ 8000 rpm, thay ống thu Rửa lặp lại lần với dung dịch rửa RPE buffer - Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc ống thu gia tốc tối đa, bỏ ống thu - Đặt cột lọc vào ống eppendorf (5.3.8), cho 50 l nước tinh khiết khơng có nuclease vào cột lọc, ủ nhiệt độ phịng Tách ARN cách ly tâm cột lọc tốc độ ≥ 8000 rpm, bỏ cột lọc Mẫu ARN thu sử dụng để tiến hành phản ứng RT-PCR realtime RT-PCR - Bảo quản mẫu ARN thu oC thời gian ngắn trước làm phản ứng, sau 24 h, nên bảo quản mẫu âm 20 oC nhiệt độ thấp Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm thương mại khác cho kết tương đương Khi sử dụng kít khác, cần tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất 26 TCVN 8400 -XX : 2020 Phụ lục F (Tham khảo) Trình tự cặp mồi mẫu dị, thành phần phản ứng chu trình nhiệt cho phương pháp realtime RT-PCR Bảng F.1-Trình tự cặp mồi/mẫu dò cho phản ứng Realtime RT- PCR 27 TCVN XXXX: 2019 Gen đích Kí hiệu TQ-pesti Pestisvirus FAM-TGCYAYGTGGACGAGGGCATGC-TAMRA BVD 190-F GRAGTCGTCARTGGTTCGAC V326 TCAACTCCATGTGCCATGTAC BVDV1 BVDV2 Nguồn tham khảo Trình tự (5’-3’) (Hoffmann et al (2006) Pesti-F CTAGCCATGCCCTTAGTAG Pesti-R CGTCGAACCAGTGACGACT BVDV1 FAM-TAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT-BHQ1 Pesti-F CTAGCCATGCCCTTAGTAG Pesti-R CGTCGAACCAGTGACGACT BVDV2 TxR-TAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC-BHQ1 (Baxi et al 2006) CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi mẫu dị Bảng F.1 tiêu chuẩn khuyến cáo sử dụng Các phịng thí nghiệm sử dụng cặp mồi, mẫu dò khác Tổ chức Thú y giới (OIE) Phịng Thí nghiệm tham chiếu OIE bệnh BVD khuyến cáo sử dụng Bảng F.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR (Sử dụng kít qScriptTMXLM One-step RT-qPCR Tough Mix®, code 95132-100, hãng Quantabio) TT Thành phần nguyên liệu Nồng độ sử dụng Thể tích cho phản ứng (µl) Nước tinh khiết khơng có nuclease 6,0 2X Reaction buffer 12,5 Mồi xuôi 20 µM 0,5 Mồi ngược 20 µM 0,5 Mẫu dị µM 0,5 Mẫu chiết tách (ARN) 5,0 Tởng thể tích cho phản ứng: 25,0 Bảng F.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT- PCR Nhiệt độ Thời gian 50 °C 10 94 °C 94 °C 15 s 60 °C (*) 45 s Số chu kỳ chu kỳ 40 chu kỳ 28 TCVN 8400 -XX : 2020 GHI CHÚ: 1) Nhiệt độ thời gian phù hợp với qScriptTMXLM One-step RT-qPCR Tough Mix ®, code 95132-100, hãng Quantabio2 Việc thực cài đặt nhiệt độ thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn kít sử dụng 2) (*): Ghi nhận tín hiệu huỳnh quang Phụ lục G (Tham khảo) Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng chu trình nhiệt cho phương pháp RT-PCR Bảng G.1 – Trình tự cặp mồi cho phản ứng RT – PCR Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm thương mại khác cho kết tương đương Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo nhà sản xuất thành phần phản ứng realtime RT-PCR chu trình nhiệt 29 TCVN XXXX: 2019 G.2 phần Cặp mồi Kí hiệu Trình tự (5’-3’) Mồi xi UTR-F CAT GCCCAT AGT AGG AC Mồi ngược UTR-R CCA TGTGCC ATGTAC AG Kích thước SP Bảng 288 bp Thành phản ứng RT-PCR Thành phần nguyên liệu trình Nước tinh khiết khơng có nuclease Mồi xi ứng Mồi ngược PCR qScript XLT One-Step RT (25X) One-Step Nhiệt độToughMix (2X) GelTrack 50 oC Loading Dyes (50X) G.3 – Thể tích (µM) cho phản ứng Bảng 5,0 nhiệt 20 µM 0,5 phản 20 µM 0,5 RT- Nồng độ sử dụng TT Chu 1,0 Thời gian Số 12,5 chu kỳ 15 0,5 01 o Mẫu94 chiết C tách (ARN) 5,0 01 o cho phản ứng: Tởng thể94 tích C 10 s 25,0 30 50 oC 15 s 72 oC 30 s 72 oC 10 01 CHÚ THÍCH: Nhiệt độ thời gian (*) phù hợp với qScript XLT One-Step RT-PCR Kít Việc thực cài đặt nhiệt độ thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn kít sử dụng Phụ lục H (Tham khảo) Quy trình thực phản ứng ELISA để phát kháng thể kháng protein P80 vi rút gây bệnh tiêu chảy có màng nhày vi rút bị Hiện nay, có nhiều kít ELISA phát kháng thể BVDV có bán sẵn thị trường Khi sử dụng kit ELISA cần thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Ví dụ sử dụng BVDV/MD P80 Protein Antibody Test kít, hãng IDEXX, code 06-00645-124 nhằm phát kháng thể kháng protein P80 vi rút BVDV nhiễm tự nhiên H.1 Chuẩn bị nguyên liệu Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm thương mại khác cho kết tương đương Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo nhà sản xuất thành phần phản ứng RT-PCR chu trình nhiệt Thơng tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Khi sử dụng kít khác, cần tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất 30 TCVN 8400 -XX : 2020 - Ngun liệu kít để nhiệt độ phịng 30 trước làm phản ứng - Pha loãng dung dịch rửa 1X (1:20) ví dụ 15 ml dung dịch nước rửa đặc 20X với 285 ml nước cất khử ion Bảo quản dạng stock (20X) điều kiện nhiệt độ từ 18°C - 26 °C nước rửa (1X) bảo quản ngày với điều kiện nhiệt độ °C - °C Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha tùy theo số lượng mẫu làm xét nghiệm: 300 µl/giếng x lần rửa x bước rửa x số giếng sử dụng - Pha conjugate (100X) thành nồng độ 1X với dung dịch N.1 (tỷ lệ 1:100) Tùy số lượng mẫu mà tính tốn lượng conjugate cần pha Conjugate pha sử dụng vòng h với nhiệt độ 18 °C - 26 °C - Thiết lập sơ đồ bố trí mẫu: sơ đồ bố trí mẫu phải có đối chứng âm (Negative Control – NC), đối chứng dương (Positive Control – PC) H.2 Cách tiến hành H.2.1 Ủ mẫu Thực ủ mẫu thích hợp phương pháp sau: H.2.1.1 Ủ mẫu đơn (huyết huyết tương) thời gian h ± nhiệt độ 18 0C - 26 0C - Nhỏ 50 µl dung dịch pha lỗng N.9 vào tất giếng - Nhỏ 50 µl Negative Control vào hai giếng A1 A2 - Nhỏ 50 µl Positive Control vào giếng B1 - Nhỏ 50 µl mẫu cần kiểm tra (7.1.3.2; 7.1.3.7) vào giếng lại - Sau lắc nhẹ đĩa phủ kín đĩa nắp nhựa - Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ phòng 18 °C - 26 °C 60 ± H.2.1.2 Ủ mẫu đơn (huyết huyết tương) qua đêm thời gian 16 h - 24 h nhiệt độ °C - °C - Nhỏ 90 µl dung dịch pha lỗng N.9 vào tất giếng - Nhỏ 10 µl đối chứng âm vào hai giếng hai giếng A1 A2 - Nhỏ 10 µl đối chứng dương vào giếng B1 - Nhỏ 10 µl mẫu cần kiểm tra (7.1.3.2; 7.1.3.7) vào giếng lại 31 TCVN XXXX: 2019 - Sau lắc nhẹ đĩa phủ kín đĩa nắp nhựa - Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ phịng °C - °C 16 h - 24 h H.2.1.3 Ủ mẫu gộp huyết bò (gộp 10 mẫu đơn thành mẫu xét nghiệm) qua đêm thời gian 16 h - 24 h nhiệt độ °C - °C - Nhỏ 50 µl dung dịch pha loãng N.9 vào tất giếng - Nhỏ 50 µl Negative Control vào hai giếng A1 A2 - Nhỏ 50 µl Positive Control vào giếng B1 - Nhỏ 50 µl mẫu cần kiểm tra (7.1.3.7) vào giếng cịn lại - Sau lắc nhẹ đĩa phủ kín đĩa nắp nhựa - Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ °C - °C 16-24 h H.2.1.4 Ủ mẫu sữa bò đơn nhanh thời gian h ± nhiệt độ 18 °C - 26 °C - Nhỏ 50 µl dung dịch pha loãng N.9 vào giếng A1, A2 B1 - Nhỏ 50 µl Negative Control vào hai giếng A1 A2 - Nhỏ 50 µl Positive Control vào giếng B1 - Nhỏ 100 µl mẫu cần kiểm tra (7.1.3.6) vào giếng cịn lại - Sau lắc nhẹ đĩa phủ kín đĩa nắp nhựa - Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ phịng 18 oC - 26 oC 120 ± H.2.1.5 Ủ mẫu đơn (mẫu sữa tươi) qua đêm thời gian 16 h - 24 h nhiệt độ °C - °C - Nhỏ 100 µl dung dịch pha loãng N.9 vào tất giếng - Nhỏ 100 µl Negative Control vào hai giếng A1 A2 - Nhỏ 100 µl Positive Control vào giếng B1 - Nhỏ 100 µl mẫu cần kiểm tra (7.1.3.6) vào giếng cịn lại (đã có dung dịch pha lỗng N.9) - Sau lắc nhẹ đĩa phủ kín đĩa nắp nhựa - Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ °C - °C 16 h - 24 h 32 TCVN 8400 -XX : 2020 H.2.1.6 Ủ mẫu đơn mẫu gộp huyết thanh, huyết tương cừu (tối đa mẫu đơn thành 01 mẫu xét nghiệm) qua đêm thời gian 16 h - 24 h nhiệt độ °C - °C - Nhỏ 50 µl dung dịch pha lỗng N.9 vào giếng A1, A2 B1 - Nhỏ 75 µl dung dịch pha lỗng N.9 vào giếng cịn lại - Nhỏ 50 µl Negative Control vào hai giếng A1 A2 - Nhỏ 50 µl Positive Control vào giếng B1 - Nhỏ 25 µl mẫu cần kiểm tra (7.1.3.2; 7.1.3.7) vào giếng cịn lại - Sau lắc nhẹ đĩa phủ kín đĩa nắp nhựa - Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ °C - °C 16 h - 24 h H.2.2 Đổ bỏ dung dịch đĩa Rửa đĩa cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào giếng, đổ bỏ Lặp lại từ -5 lần, tránh làm khô đĩa lần rửa H.2.3 Chuẩn bị Conjugate 1X theo mục F.1 H.2.4 Nhỏ 100 µl dung dịch conjugate 1X vào giếng H.2.5 Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ 18 °C - 26 °C 20 ±3 H.2.6 Đổ bỏ dung dịch đĩa Rửa đĩa cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào giếng, đổ bỏ Rửa lặp lại từ -5 lần, tránh làm khô đĩa lần rửa H.2.7 Nhỏ 100 µl dung dịch TMB Subtrate vào giếng; H.2.8 Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ 18-26 °C 20 ±3 phịng tối H.2.9 Nhỏ 100 µl dung dịch Stop solution (dung dịch dừng phản ứng) vào giếng H.2.10 Đo giá trị OD (mật độ quang học) máy đọc (5.4.1) bước sóng 450 nm H.3 Đọc kết quả H.3.1 Tính tốn kết quả Điều kiện phản ứng công nhận khi: 33 TCVN XXXX: 2019 - Mật độ quang học (OD) đối chứng âm ( ) ≥ 0,8 OD đối chứng dương (PCx) < 0,20 Trong trường hợp khơng hợp lệ phải tiến hành xét nghiệm lại Đánh giá kết mẫu dựa vào tỷ số S/N %: H.3.2 Giải thích kết quả H.3.2.1 Mẫu huyết huyết tương đơn Áp dụng cho chẩn đoán BVD/MD cho mẫu huyết huyết tương đơn bị Âm tính S/N ≥ 50 % Nghi ngờ 40 %