Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử cơ do vi rút gây ra ở tôm. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: Bệnh hoại tử cơ do vi rút ở tôm (Infectious myonecrosis) Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút thuộc họ Totiviridae có vật chất di truyền là RNA mạch đôi, kích thước khoảng 7560 bp. Thể vi rút có dạng hình cầu hai mươi mặt, đường kính khoảng 40 nm.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-8 : 2012 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN - PHẦN 8: BỆNH HOẠI TỬ CƠ Ở TÔM Aquatic animal disease Diagnostic procedure - Part 8: Infectious myonecrosis Lời nói đầu TCVN 8710-8 : 2012 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN - PHẦN 8: BỆNH HOẠI TỬ CƠ Ở TÔM Aquatic animal disease Diagnostic procedure - Part 8: Infectious myonecrosis CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử vi rút gây tôm Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: Bệnh hoại tử vi rút tôm (Infectious myonecrosis) Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây vi rút thuộc họ Totiviridae có vật chất di truyền RNA mạch đơi, kích thước khoảng 7560 bp Thể vi rút có dạng hình cầu hai mươi mặt, đường kính khoảng 40 nm Phương pháp chẩn đoán 3.1 Chẩn đoán lâm sàng 3.1.1 Dịch tễ học Vi rút gây bệnh IMNV cảm nhiễm chủ yếu tôm thuộc họ Tôm he (Penaeidae): Penaeus vannamei, Ρ.stylirostris, Ρ.monodon… gây tỉ lệ chết cao Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh ao, bể lên đến 100 %, tỷ lệ gây chết khoảng 40 % đến 70 % Bệnh lan truyền từ bố mẹ truyền vi rút gây bệnh cho thơng qua q trình sinh sản Hoặc bệnh lan truyền thông qua sinh vật mang mầm bệnh vào vùng nuôi chim ăn tôm bệnh tôm chết thải phân ngồi mơi trường ni, thơng qua kí chủ trung gian mang mầm bệnh vào ao bể nuôi, qua dùng chung dụng cụ, nguồn nước nhiễm bệnh Bệnh xuất quanh năm, đặc biệt mùa xuân đầu hè thời tiết biến đổi nhiều biên độ ngày biến thiên lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm 3.1.2 Triệu chứng lâm sàng Giai đoạn cấp tính bệnh IMNV: vân tơm vùng bụng kéo dọc đến phần bị hoại tử, có màu trắng đục Tôm bơi lờ đờ, dạt bờ chết Tôm chết nhiều liên tiếp vài ngày, tỉ lệ tôm chết lên đến 40 % đến 70 % ao nhiễm CHÚ THÍCH: Trong số trường hợp, tôm bị stress yếu tố môi trường tôm bị bệnh trắng đuôi thể dấu hiệu bệnh lý tương tự 3.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 3.2.1 Phương pháp RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymer phiên mã ngược) 3.2.1.1 Nguyên tắc Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa hoạt động DNA polymerase tổng hợp nên mạch từ mạch khn, có tham gia mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn DNA đích thơng qua chu trình nhiệt Để thực phản ứng khuếch đại DNA đích cần có q trình: biến tính, bắt cặp kéo dài mạch tổng hợp mạch RT-PCR phương pháp PCR mà axit nucleic đích RNA Để thực PCR trước hết RNA đích phải phiên mã ngược (RT - reverse transcription) thành cDNA mồi đặc hiệu cho phản ứng Giai đoạn phiên mã ngược RT, enzym sử dụng Reverse Transcriptase Đây loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA mạch khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA) có tham gia mồi, dNTP dung dịch đệm cho phản ứng Có hai phương pháp thực RT-PCR, RT-PCR bước RT-PCR hai bước Trong quy trình này, phương pháp RT-PCR hai bước thực để khuếch đại RNA đích 3.2.1.2 Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương khơng có RNAase, trừ có quy định khác - Trizol; - Cloroform; - Isopropanol; - Etanol 75 % 95 %; - Dung dịch TBE 1X Chuẩn bị dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): hòa tan 108 g Tris 55 g axit boric 600 ml nước, thêm 40 ml EDTA 0,5 M thêm nước cho đủ lít Bảo quản nhiệt độ phòng Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X - Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M Hòa tan 93,05 g EDTA 350 ml nước, chỉnh đến pH 8,0 dung dịch NaOH M Thêm nước cho đủ 500 ml Bảo quản nhiệt độ phòng - Dung dịch DEPC Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn khoảng 10 Sau để qua đêm bình kín, nới lỏng nắp hấp khử trùng 121 oC 15 min, bảo quản nhiệt độ - 20 oC - Dung dịch TE (Tris - EDTA) Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM EDTA 1mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6 - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR - Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc lần (loading dye 6X) - Thang chuẩn DNA (DNA marker) gồm có thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp - Etidi bromua (EtBr) CẢNH BÁO AN TOÀN: Etidi bromua chất độc hại, tránh tiếp xúc tránh hít phải từ dung dịch cịn nóng có chứa EtBr, sử dụng găng tay mặc áo bảo hộ lao động suốt thời gian tiếp xúc với EtBr - Gel agarose 3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm chẩn đốn bệnh cụ thể sau: - Tủ lạnh; - Tủ lạnh âm sâu, hoạt động nhiệt độ - 20 oC; - Máy li tâm, hoạt động với gia tốc 13000 g; - Nồi cách thủy hay block nhiệt khơ, hoạt động nhiệt độ 95 oC; - Máy lắc trộn vortex; - Cân phân tích cân xác đến 0,1 mg; - Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 1000 l đến 10 l, từ l đến 20 l, từ 10 l đến 100 l, từ 100 l đến l; - Giá Eppendorf có kích thước 0,2 ml 1,5 ml; - Máy luân nhiệt (máy PCR); - Bếp điện lị vi sóng; - Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml; - Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml; - Bộ điện di gồm nguồn máng chạy điện di; - Buồng đổ gel; - Bàn đọc gel (UV); - Giấy parafin 3.2.1.4 Lấy mẫu Chọn cá thể có dấu hiệu bệnh lý mô tả Tôm bố mẹ: lấy mẫu phần đuôi tôm bố mẹ Tôm giống (> postlarvae 8, hay hậu ấu trùng lớn ngày tuổi) đến tôm trưởng thành: lấy chân bơi từ đến 10 Tôm nhỏ tôm giống (nhỏ postlarvae 8): lấy phần đầu từ 10 đến 15 Ấu trùng biến thái: lấy con, khoảng 50 Lượng mẫu lấy để tách chiết RNA khoảng 20 mg, dùng tơm cịn sống mẫu tôm, mẫu phân cố định etanol 95 % để tách chiết RNA 3.2.1.5 Cách tiến hành 3.2.1.5.1 Tách chiết RNA CHÚ THÍCH: Có nhiều quy trình tách chiết RNA từ mô động vật theo hướng dẫn nhà sản xuất Hiện có nhiều thuốc thử kit thương mại hữu ích cho việc tách chiết RNA…) Người sử dụng lựa chọn kit thích hợp an tồn theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp tách chiết RNA trizol: Cho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml Nếu mẫu cố định etanol 95 %, cần làm khô etanol cách đổ etanol dốc ngược tờ giấy lọc, để khô tự nhiên Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 l đến 200 l dung dịch trizol (lượng mẫu không 10 % trizol) Nghiền nhỏ mịn chày nghiền, sau thêm vào khoảng 550 l đến 650 l dung dịch trizol nghiền tiếp đến nhuyễn Giữ nhiệt độ phòng đến Ly tâm 12000 g thời gian 10 min, sau chuyển dịch sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 150 l cloroform Lắc cẩn thận tay 15 s Ủ 15 oC đến 30 oC từ đến Ly tâm 12000 g từ oC đến oC 15 min, sau chuyển phần phía sang ống Eppendorf 1,5 ml Thêm 375 l dung dịch isopropanol, ủ 15 oC đến 30 oC 10 Ly tâm 12000 g oC 10 min, sau rút bỏ isopropanol Rửa phần viên 750 l etanol 75 % Trộn máy vortex ly tâm 7500 g oC, sau rút bỏ etanol Làm khơ phần viên Hịa tan RNA nước tinh khiết DEPC (dietyl pyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 100 l đến l tùy thuộc vào lượng RNA tách chiết CẢNH BÁO: Việc tách chiết RNA sử dụng hóa chất nguy hiểm có khả gây hại thao tác không cẩn thận Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da hít phải hóa chất Ln đeo găng tay, trang, mặc quần áo bảo hộ thực thao tác 3.2.1.5.2 Tiến hành phản ứng RT-PCR 3.2.1.5.1 Cặp mồi sử dụng phản ứng RT-PCR Phản ứng khuếch đại thực máy luân nhiệt theo phương pháp RT-PCR hai bước khuếch đại đoạn gen đặc hiệu vi rút IMNV sử dụng cặp mồi 4587F/4914R 4725NF/4863NR (Bảng 1) Bảng - Trình tự cặp mồi Mồi Trình tự nucleotit 4587F CGA-CGC-TGC-TAA-CCA-TAC-AA 4914R ACT-CGG-CTG-TTC-GAT-CAA-GT 4725 NF GGC-ACA-TGC-TCA-GAG-ACA 4863 NR AGC-GCT-GAG-TCC-AGT-CTT-G Cặp mồi 4587F/4914R dùng để khuếch đại đoạn gen vi rút IMNV có kích thước 328 bp Cặp mồi 4725NF/4863NR dùng để khuếch đại đoạn gen có kích thước 139 bp Chuẩn bị mồi: - Mồi trạng thái đông khô phải ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước mở hoàn nguyên Lần nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi nồng độ 200 pmol/ l làm gốc - Mồi sử dụng nồng độ 20 pmol/ l: pha lỗng mồi gốc nước khơng có nuclease (10 gốc 90 l mồi l nước) 3.2.1.5.2.2 Chuẩn bị phản ứng Tùy theo điều kiện phịng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng thương mại phù hợp sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước bước hai theo số mẫu chẩn đoán, cộng thêm mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm, trộn chung vào ống Eppendorf Sau hút 22,5 l hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml, ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm 3.2.1.5.2.3 Tiến hành phản ứng PCR bước Thêm 2,5 l RNA mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 PCR (thành phần gồm: dung dịch đệm 1X EZ; loại dNTP có nồng độ 300 nồng độ 0,465 25 l hỗn hợp phản ứng RTM; mồi 4587F, 4914R có M; Mn(OCOCH3)2 2,5 mM nước cho đủ thể tích để hỗn hợp với tổng thể tích l Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1, xem Bảng Bảng - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước Thành phần Thể tích cho mẫu (25 l), Dung dịch đệm EZ (5X) dNTP (10 mM loại) 0,75 rTth Enzyme (2,5 U/ l) Mồi 4587F 0,582 (20 M) l Nồng độ cuối 1X 300 M 0,1 U 0,465 M Mồi 4914R 0,582 (20 M) Mn(OCOCH3)2 (25 mM) 2,5 RNA mạch khuôn 2,5 Nước 0,465 M 2,5 mM 12,086 Sau pha hỗn hợp cho phản ứng đặt vào máy luân nhiệt Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR bước nêu Bảng Bảng - Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR bước Bước Nhiệt độ/Thời gian Số chu kỳ Tạo cDNA 60 oC/30 Biến tính 95 oC/2 Biến tính 95 oC/45 s Bắt cặp 60 oC/45 s Kéo dài mạch 60 oC/7 oC Giữ ổn định Giữ ổn định 39 Sản phẩm khuếch đại bảo quản oC điện di 3.2.1.5.2.4 Tiến hành phản ứng RT-PCR bước Thêm 0,5 l RNA mạch khuôn (sản phẩm PCR bước 1) vào ống PCR chứa sẵn 24,5 ứng RT-PCR (thành phần gồm: dNTP có nồng độ 200 M; magie clorua 1,5 mM 2,5 U Taq DNA polymerase, mồi 4725 NF, 4863 NR có nồng độ 0,465 hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 l hỗn hợp phản M nước cho đủ thể tích để l Có thể sử dụng thành phần hóa chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại đảm bảo nồng độ cuối thành phần Ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix Promega X, xem bảng Bảng - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước Thành phần Promega Gotag Green Master Mix, 2X Mồi 4725 NF Thể tích cho mẫu, 12,5 0,582 (20 M) l Nồng độ cuối 1X 0,465 M Mồi 4863 NR 0,582 (20 M) Sản phẩm bước 0,465 M 0,5 Nước 10,836 Sau pha hỗn hợp cho phản ứng, đặt hỗn hợp vào máy luân nhiệt Chu trình nhiệt phản ứng PCR bước nêu Bảng Bảng - Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR bước Bước Nhiệt độ/Thời gian Số chu kỳ Biến tính 95 oC/2 Biến tính 95 oC/30 s Bắt cặp 65 oC/30 s Kéo dài mạch 72 oC/30 s Kéo dài mạch 72 oC/2 oC Giữ ổn định Giữ ổn định 39 CHÚ Ý: Mẫu, nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt khay đá lạnh suốt trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng CẢNH BÁO: Do chất RNA dễ bị phân hủy môi trường enzym RNAase tiết từ vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ dung dịch Enzym RNAase bền, khó bị phân hủy nhiệt độ Vì vậy, tất dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng RT-PCR phải tuyệt đối vô trùng 3.2.1.5.3 Chạy điện di 3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị gel Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến % agarose dung dịch đệm TBE 1X TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan Sau cho vào lị vi sóng đun đến sôi, đợi đến nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC, cho vào l etidi bromua/100 ml Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, đổ thạch vào khuôn Tiến hành đổ vào gel (chú ý không nên đổ gel dày q 0,8 cm) Khi gel đơng lại tiến hành gỡ lược khỏi gel Chuyển gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X TAE 1X) loại với dung dịch đun agarose vào máng điện di ngập gel 3.2.1.5.3.2 Điện di Hút 10 l sản phẩm RT-PCR nhỏ vào giếng gel Khi thực điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đốn kích thước sản phẩm khuếch đại Hút 10 l thang DNA vào giếng gel Điện di hiệu điện 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng khí lên từ hai phía điện cực máy điện di sau nối điện) Khi quan sát thấy màu xanh đậm thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agarose, dừng trình điện di CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix khơng có sẵn đệm tải mẫu tiến hành điện di nhỏ Loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 10 l l sản phẩm PCR ra, nhỏ vào trộn đều, sau lấy khoảng l nhỏ vào giếng gel 3.2.1.5.4 Đọc kết Sau điện di xong, đọc kết bàn đọc UV, đọc kết với tia UV bước sóng 302 nm Đối chiếu vạch sáng mẫu với vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương tính mẫu đối chứng âm tính để đưa kết luận Bảng - Kết điện di Giếng Thang DNA Mẫu đối chứng dương tính Mẫu đối chứng âm tính Mẫu Vạch 328 bp Vạch 139 bp Phân vạch rõ ràng sáng theo kích thước sử dụng Kết Điện di tốt Có Có Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt Khơng Có Đạt u cầu Khơng Khơng Mẫu đối chứng dương tính hỏng, enzym hỏng Có Khơng Khơng đạt u cầu Khơng Khơng Khơng ngoại nhiễm Có Có Có Khơng Khơng Có Có Có Dương tính IMNV Khơng Có Dương tính với IMNV Khơng Khơng Âm tính với IMNV Có Khơng Khơng chấp nhận kết Phân tích lại mẫu Bị ngoại nhiễm Kết mẫu thử dương tính xuất vạch sáng có kích thước kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 328 bp bước 139 bp bước có vạch 139 bp bước Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm khơng có vạch sáng Kết mẫu thử âm tính khơng có vạch sáng kích thước 139 bp Khơng có vạch sáng mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính Thang DNA phân vạch rõ ràng 3.2.2 Phương pháp mô học 3.2.2.1 Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương khơng có RNAase, trừ có quy định khác - Dung dịch Davidson (xem A.1) - Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2) - Thuốc nhuộm eosin (xem A.3) - Etanol 70 %, 90 % etanol tuyệt đối - Parafin - Xylen - Keo dán, ví dụ Bom Canada 3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm chẩn đốn bệnh cụ thể sau: - Kính giải phẫu - Bộ đồ giải phẫu gồm dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo loại, lam kính lamen - Lọ nhỏ cố định mẫu - Bình rót parafin - Bộ phận làm lạnh mẫu - Máy cắt mẫu microtome - Nồi nước có chỉnh nhiệt độ - Tủ ấm bàn sấy mẫu - Kính hiển vi quang học - Cassete - Khung đúc mẫu 3.2.2.3 Lấy mẫu Thu mẫu tôm có dấu hiệu bệnh (như mơ tả dấu hiệu bệnh lý phần trên) Không dùng tôm chết tôm bảo quản đá để cắt mô 3.2.2.4 Cách tiến hành 3.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu Cố định mẫu dung dịch Davidson Đối với ấu trùng tơm hậu ấu trùng cố định dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h Số tôm thu từ 30 đến 50 bể Sau cố định etanol 70 % nhiệt độ phòng Đối với tôm lớn cố định cách lấy tôm sống cắt lấy phần đi, bụng, sau cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson Số tơm thu từ đến 10 ao Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không cm Tỷ lệ mẫu dung dịch cố định 1/10, ngâm 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước mẫu, sau bảo quản etanol 70 % nhiệt độ phòng 3.2.2.4.2 Khử mẫu cố định Ngâm etanol 90 % hai lần, thời gian 30 đến 60 lần Sau ngâm etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 đến 60 lần 3.2.2.4.3 Làm mẫu Ngâm sang lọ xylen để 30 đến 60 Ngâm sang lọ xylen để 30 đến 60 Sau ngâm tẩm parafin hai lần, lần 56 oC đến 58 oC h Đúc khuôn: Đặt mẫu thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào mặt khuôn để cắt tốt Làm lạnh mẫu bàn lạnh để tủ lạnh 3.2.2.4.4 Cắt mẫu Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt phẳng, để mặt khay đá Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ m đến m Chọn lát cắt tiêu phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 oC đến 35 oC; sau dùng lam kính vớt lát cắt tiêu Để khơ 3.2.2.4.5 Nhuộm tiêu H&E Tẩy parafin cách ngâm xylen hai lần, lần từ đến min, sau ngâm etanol tuyệt đối, etanol 90 % etanol 70 %, lần ngâm từ đến đem rửa vòi nước chảy từ đến Ngâm thuốc nhuộm haematoxylin từ đến sau rửa vịi chảy từ đến tiếp tục ngâm thuốc nhuộm eosin từ đến Làm nước mẫu qua thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90% etanol tuyệt đối, bước từ đến min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ đến min), gắn lamen keo dán, ví dụ Bom Canada Để khơ soi kính 3.2.2.4.6 Đọc kết Soi tiêu từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1000 X) Khi tôm bị bệnh IMNV, kết mơ bệnh học cho thấy vị trí hoại tử sợi vân có tượng viêm, phù, xuất huyết sợi cơ, xuất thể ẩn tế bào chất Tôm bị nhiễm nặng, phần bụng bị hoại tử nghiêm trọng xâm nhập với số lượng lớn tế bào máu vào vùng bị viêm 3.2.3 Phương pháp lai chỗ (in situ hybridization - ISH) 3.2.3.1 Nguyên tắc - Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern Blot Trình tự axit nucleic cần tìm khơng tách chiết khỏi mơ hay tế bào Q trình lai với mẫu dò đánh dấu phát phân tử lai thực khuẩn lạc, nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô 3.2.3.2 Thuốc thử vật liệu thử - Dung dịch lai - Phosphatase kiềm nitroblue tetrazolium 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat Xem 3.2.2.1 3.2.3.3 Thiết bị, dụng cụ Xem 3.2.2.2 3.2.3.4 Lấy mẫu Thu tơm có dấu hiệu bị bệnh (như mô tả dấu hiệu bệnh lý phần trên) Mẫu tơm dùng để phân tích phải cịn sống cịn tình trạng hấp hối 3.2.3.5 Chuẩn bị mẫu Để phát IMNV mẫu tơm phải cố định cách cắt lấy phần đuôi, bụng ngâm dung dịch không axit [dung dịch R-F (A.4)] Ngâm mẫu cố định từ 12 h đến 24 h, sau lấy mẫu khỏi dung dịch cố định, rửa với nước h đến h đem xử lý mẫu 3.2.3.6 Xử lý mẫu Mẫu tôm cố định xử lý cố định parafin cắt (4 m) theo hướng dẫn quy trình chuẩn 3.2.3.7 Tiến hành lai Cặp probe sử dụng trình lai, xem bảng Bảng - Cặp probe sử dụng trình lai Probe Trình tự nucleotit IMNV 993F 5'-AACACAAAATCTGCCAGCAA-3' IMNV 993R 5'-CCCAACCACCCAAATTCATA-3' Quy trình sử dụng cho phương pháp ISH mô tả Lightner (1996) Với phương pháp ISH, mảnh cắt tiêu phủ 500 l dung dịch lai (4 SSC, formamid 50 %, Denhard's, dextran sulfat % (khối lượng/thể tích), DNA tinh dịch cá hồi 0,5 IMNV probe (0,2 g/ml) có chứa g/ml) Tiêu đặt nhiệt 84 oC 10 Làm lạnh đá thời gian ủ qua đêm lò lai 42 oC Sự tạo màu thực với kháng thể kháng digoxigenin gắn với phosphatase kiềm nitroblue tetrazolium 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat Đọc kết kính hiển vi quang học 3.2.3.8 Đọc kết Mẫu dương tính vùi kết tủa màu xanh đến đen tế bào chất, tế bào không bị nhiễm vi rút cấu trúc mơ bình thường bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam) Mẫu âm tính khơng có màu xanh đen, bắt màu thuốc nhuộm bổ sung có màu cam sau q trình lai Báo cáo kết chẩn đốn Tơm xác định nhiễm bệnh IMNV có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng bệnh kết dương tính phương pháp sau: - Phản ứng RT-PCR phát vi rút dương tính; - Mẫu cắt mơ có bệnh tích vi rút IMNV; - Kết lai chỗ dương tính với IMNV Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịch Davidson Etanol 95 % Formalin (formaldehyd 37 %) 330 ml 220 ml Axit axetic đậm đặc 115 ml Nước 335 ml A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer) Hematoxylin dạng tinh thể 1g Natri iodat 0,2 g Amoni alum [NH4Al(SO4)2] kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g Axit axetic 1g Cloral hydrat 50 g Nước 1000 ml Hịa tan hematoxylin nước, sau cho natri iodat amoni alum kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit axetic chloral hydrat lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch pha chai tối màu A.3 Thuốc nhuộm eosin Eosin Y 1g Etanol 70 % lít Axit axetic băng ml Thêm từ giọt đến giọt axit axetic vào etanol 70 % Hịa tan eosin etanol, sau cho thêm axit axetic lọc qua giấy lọc Bảo quản dung dịch pha chai tối màu A.4 Dung dịch R-F (RNA - friendly) Formaldehyd 37 % 349 ml Cồn 95 % 407 ml Nước 244 ml Chỉnh pH = THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bonnie T.Poulos 2006 Donald V Lightner, Detection of infectious myonecrosis virus (IMNV) of penaeid shrimp by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) [2] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2010 Viral encephalopathy and retinopathy [3] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2009 Infectious myonecrosis [4] Tang et al 2005 K.F.J Tang, C.R Pantoja, B.T Poulos, R.M Redman and D.V Lightner In situ hybridization demonstrates that Litopenaeus vannamei, L stylirostris and Penaeus monodon are susceptible to experimental infection with infectious myonecrosis virus (IMNV), Dis Aquat Org 63, pp 261-265 ... thể có dấu hiệu bệnh lý mô tả Tôm bố m? ?: lấy mẫu phần đuôi tôm bố mẹ Tôm giống (> postlarvae 8, hay hậu ấu trùng lớn ngày tuổi) đến tôm trưởng thành: lấy chân bơi từ đến 10 Tôm nhỏ tôm giống (nhỏ... mẫu 3.2.2.3 Lấy mẫu Thu mẫu tôm có dấu hiệu bệnh (như mơ tả dấu hiệu bệnh lý phần trên) Không dùng tôm chết tôm bảo quản đá để cắt mô 3.2.2.4 Cách tiến hành 3.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu Cố định mẫu dung... kết Soi tiêu từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1000 X) Khi tôm bị bệnh IMNV, kết mơ bệnh học cho thấy vị trí hoại tử sợi vân có tượng viêm, phù, xuất huyết sợi cơ, xuất