TCVN: BỆNH ĐỘNG VẬT –QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN PHẦN XX: BỆNH VIÊM MŨI KHÍ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở BÒ

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-XX : 2020 (Dự thảo lần 2) BỆNH ĐỘNG VẬT –QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN PHẦN XX: BỆNH VIÊM MŨI KHÍ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở BÒ Animal diseases–Diagnostic procedure – Part XX: Infectious bovine rhinotracheitis HÀ NỘI – 2020 TCVN 8400-XX: 2020 Lời nói đầu TCVN 8400-XX : 2020 Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn sở tham khảo tài liệu Tổ chức Thú y giới (OIE) báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 47 phần: - TCVN 8400-1 : 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh vi khuẩn Streptococcus suis gây lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi Aspergillus gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ thương hàn gà; - TCVN 8400-13 : 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm Brucella; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù lợn vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh Staphylococcus aureus gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn; TCVN8400-XX : 2020 - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 phần 22: Bệnh giả dại lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán; - TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử Clostridium perfringens; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn lợn sau cai sữa Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy lợn Coronavirus; - TCVN 8400-39 : 2016: phần 39: Bệnh viêm đường hơ hấp mãn tính gà; - TCVN 8400-40 : 2016: phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết thủy cầm vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây - TCVN 8400-41 : 2019: phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi - TCVN 8400-42 : 2019: phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ; - TCVN 8400-43 : 2019: phần 43: Bệnh lưỡi xanh; - TCVN 8400-44 : 2019: phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis; TCVN 8400-XX: 2020 - TCVN 8400-45 : 2019: phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò; - TCVN 8400-46 : 2019: phần 46: Bệnh dại; - TCVN 8400-47 : 2019: phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển; TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-XX : 2020 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đốn – Phần XX: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm bò Animal diseases– Diagnostic procedure –Part XX: Infectious bovine rhinotracheitis CẢNH BÁO − Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh Viêm mũi khí quản truyền nhiễm bò Tài liệu viện dẫn TCVN 8402 : 2010 Bệnh động vật – Quy trình mổ khám Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm bị (Infectious bovine rhinotracheitis) Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm bị (IBR) bệnh truyền nhiễm gây vi rút bovine herpesvirus1 (BoHV-1) thuộc nhóm Alphaherpes, họ Herpesvirales Bệnh dễ lây lan xảy bò lứa tuổi tính biệt với đặc trưng sốt cao, biểu triệu chứng lâm sàng chủ yếu đường hô hấp chảy nước mũi, xuất huyết niêm mạc mũi, gây viêm mũi khí quản 3.2 Chữ viết tắt - CPE (Cytopathic effect): Biến đổi bệnh lý tế bào TCVN 8400-XX: 2020 - EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium): Môi trường EMEM dùng cho nuôi cấy tế bào - MDBK (Madin Darby Bovine Kidney): Tế bào thận bò - FCS (Fetal calf serum): Huyết thai bê - ELISA (Enzyme -Linked Immunosorbent Assay): Phản ứng miễn dịch liên kết enzyme - PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp - Realtime PCR (Realtime - Polymerase Chain Reaction): Phản ứng trùng hợp chuỗi thời gian thực - PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phosphat - PBGS (Phosphate buffered gelatin saline): dung dịch muối đệm Phosphat-gelatin - ADN (Acid deoxyribonucleic): axit deoxyribonucleic Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích,sử dụng nước cất, nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 4.1 Thuốc thử vật liệu cho lấy mẫu 4.1.1 Ethanol, từ 70% (thể tích) đến etanol tuyệt đối 4.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2 4.1.3 Dung dịch PBGS 4.1.4 Tăm bông, vô trùng 4.1.5 Xy lanh kim tiêm loại 18G 4.2 Thuốc thử vật liệu thử dùng cho realtime PCR PCR 4.2.1 Kit tách chiết ADN 4.2.2 Kit nhân gen cho phản ứng PCR 4.2.2 Kít nhân gen cho phản ứng realtime PCR 4.2.3 Mồi xuôi, mồi ngược cho phản ứng PCR 4.2.4 Mồi xuôi, môi ngược mẫu dò cho phản ứng realtime PCR TCVN8400-XX : 2020 4.2.5 Mẫu chuẩn dương, chứng nhận dương tính, ADN chuẩn dương tách chiết từ vi rút BoHV-1 có giá trị Ct (Chu kỳ ngưỡng biết trước) 4.2.6 Thạch agarose 4.2.7 Đệm TBE 10X TAE 10X 4.2.8 Đệm tải mẫu (Loading dye) 4.2.9 Thang ADN chuẩn (Maker/ladder) 4.2.10 Nước tinh khiết, khơng có nuclease 4.2.11 Chất nhuộm màu ADN 4.3 Nguyên liệu vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym) 4.3.1 Kít ELISA Hiện kít ELISA thương mại có sẵn thị trường dùng để phát kháng thể IBR, sử dụng phương pháp ELISA cần theo hướng dẫn nhà sản xuất 4.3.2 Nước cất khử ion 4.4 Nguyên liệu thuốc thử dùng cho phân lập vi rút phản ứng trung hòa vi rút 4.4.1 Tế bào MDBK 4.4.2 Vi rút IBR chuẩn 4.4.3 Dung dịch EMEM (Modified Eagle Medium) 4.4.4 FCS (Fetal calf serum) 4.4.5 Dung dịch trypan blue, 0.4% 4.4.6 Trypsine-EDTA, 10X 4.4.7 Dung dịch kháng sinh Peniciline/Streptomycine Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm sinh học, bao gồm thiết bị, dụng cụ sau: 5.1 Thiết bị, dụng cụ chung TCVN 8400-XX: 2020 5.1.1 Tủ lạnh âm sâu, trì nhiệt độ từ âm 20 oC đến âm 80 oC 5.1.2 Tủ lạnh, trì nhiệt độ từ °C đến °C 5.1.3 Buồng cấy an toàn sinh học cấp II 5.1.4 Máy lắc trộn votex 5.1.5 Máy nghiền mẫu cối chày sứ, vô trùng 5.1.6 Pank, kéo, vô trùng 5.1.7 Bể ủ nhiệt, trì nhiệt độ 56 °C 5.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR/ PCR 5.2.1 Máy nhân gen (PCR) 5.2.2 Máy nhân gen (realtime-PCR) 5.2.3 Máy ly tâm, đạt gia tốc ly tâm 900 g; 500 g 20 000 g 5.2.4 Máy ly tâm lắng 5.2.5 Máy đọc gel 5.2.6 Bể điện di 5.2.7 Khay điện di 5.2.8 Lị vi sóng 5.2.9 Ống PCR, 0.2 ml 5.2.9 Ống eppendorf, khơng có ARNse DNase 5.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA 5.3.1 Máy đọc ELISA, đọc đĩa bước sóng 450 nm 5.3.2 Thiết bị ủ mẫu, trì nhiệt độ 37 °C 5.4 Thiết bị, dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào phản ứng trung hịa vi rút 5.4.1 Kính hiển vi đảo ngược 5.4.2 Tủ ấm, có chứa % CO2, trì 37 oC TCVN8400-XX : 2020 5.4.3 Chai nuôi tế bào 25 cm2 5.4.4 Đĩa nuôi tế bào 96 giếng 5.4.5 Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,22 µm 5.4.6 Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 µm 5.4.7 Buồng đếm hồng cầu Ngồi cịn có loại pipet đầu typ phù hợp, ống nghiệm 15 ml, 50 ml, đĩa petri vật tư tiêu hao phù hợp cho trình thực biện pháp kỹ thuật tiêu chuẩn Chẩn đoán lâm sàng 6.1 Đặc điểm dịch tễ - Bệnh xảy bò lứa tuổi, non sinh mắc bệnh trầm trọng trưởng thành Động vật thường mắc bệnh dạng thể ẩn, không biểu triệu chứng lâm sàng, nhiên thải vi rút ngồi mơi trường - Bệnh lây trực tiếp từ bệnh sang khỏe đàn, vi rút thường xâm nhập qua đường hô hấp thông qua chất tiết từ đường hô hấp sinh dục vật dụng chăn ni bị nhiễm mầm bệnh Bệnh truyền từ mẹ sang qua thai - Tỷ lệ mắc bệnh khoảng từ 20 % đến 100 %, tùy thuộc vào độc lực chủng vi rút lưu hành Tỷ lệ chết thấp, khoảng 10 % - Vi rút BoHV-1 tồn môi trường mùa đông khoảng 30 ngày dễ bị bất hoạt nhiệt độ cao Vi rút tồn 37 oC 10 ngày Vi rút sống sót điều kiện âm 20 oC khoảng năm 6.2 Triệu chứng lâm sàng - Giai đoạn ủ bệnh từ ngày - ngày, trường hợp nhẹ, vật bị chảy nước mũi sốt nhẹ kéo dài ngày - ngày Trường hợp thường dễ bị bị bỏ qua - Trong trường hợp bệnh trầm trọng hơn, vật sốt 40 oC – 42 oC, ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, giảm cân, chảy nhiều nước mũi Con giảm sản lượng sữa Trong ngày đầu, dịch mũi dạng lỏng, sau nước mũi trở nên đặc lại dịch nhầy Xoang miệng bị tổn thương, chảy nhiều nước bọt Viêm mũi khí quản Niêm mạc mũi, hầu họng khí quản bị viêm đỏ có vết loét nhỏ Các tổn thương thường tập trung đường hô hấp Con vật khó thở, thường thở miệng, thở nặng mùi Bệnh thường kéo dài ngày - 10 ngày Nếu bị nhiễm trùng kế phát, vật bị ho viêm phế quản Bò trưởng thành bê thường chết viêm dày ruột TCVN 8400-XX: 2020 - Gia súc mang thai bị sảy thai Hiện tượng sảy thai bị sau vật bị bệnh nặng bị xảy tuần sau bị bệnh 6.3 Bệnh tích - Niêm mạc đường hơ hấp lấp đầy dịch nhầy có tượng phù nề, xoang mũi, xoang miệng chứa đầy dịch tiết - Xuất huyết có vết loét, điểm hoại tử niêm mạc miệng, niêm mạc mũi, hầu họng, quản khí quản Các tổn thương tương tự thấy xuất niêm mạc ống tiêu hóa tá tràng, khơng tràng, hồi tràng, manh tràng cỏ - Hạch bị sưng, xuất huyết Khi bị nhiễm trùng kế phát, phổi có tượng xuất huyết, hoại tử điểm - Các tế bào biểu mô niêm mạc đường hô hấp bị phù nề, có tượng xâm nhiễm nhiều tế bào bạch cầu lympho hoại tử - Xuất thối hóa bong bóng hoại tử tế bào biểu mơ đường tiêu hóa Hiện tượng xuất mảng Payer’s - Xuất ổ hoại tử thể vùi gan 6.4 Chẩn đốn phân biệt - Bệnh lở mồm long móng: vật sốt cao, chảy nhiều nước dãi Xuất mụn loét niêm mạc miệng, móng chân làm cho vật khập khiễng Tốc độ lây lan nhanh - Bệnh sốt vận chuyển (Shipping fever): vật bị sốt vận chuyển thường ủ rũ, mệt mỏi, ăn Có dấu hiệu viêm phổi trầm trọng, khó thở, có tiếng ran phổi rõ ràng Khơng có dấu hiệu viêm mũi, dịch nhầy mũi kết dử mắt viêm mũi khí quản tuyền nhiễm Con vật đáp ứng tốt với điều trị kháng sinh - Bệnh bạch hầu bê (calf diphtheria): bệnh bạch hầu bê có tỷ lệ mắc thấp, tỷ lệ chết cao máu bi nhiễm độc trầm trọng, trái ngược với bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm Bê có tượng khó thở, sốt, giảm ăn, ủ rũ có tượng viêm phổi - Bệnh sốt cata ác tính (malignant catarrhal fever): Con vật sốt cao, ăn, ủ rũ, bị tổn thương niêm mạc miệng mắt trầm trọng Bệnh có tỷ lệ ốm thấp tỷ lệ chết cao Có tượng xuất huyết hạch bạch huyết 10 TCVN 8400-XX: 2020 Đới chứng tế bào + Cho 200 µl mơi trường vào giếng (đánh ký hiệu sơ đồ đĩa) + Ủ đĩa tủ ấm % CO2 37 oC 24 h Đối chứng môi trường + Cho 200 µl mơi trường EMEM (4.4.3) vào giếng (đánh số sơ đồ đĩa) + Ủ đĩa tủ ấm % CO2 37 oC 24 h Chuẩn độ lại vi rút sử dụng + Pha loãng dung dịch vi rút gốc: từ 10-1 đến 10-4 Mỗi nồng độ kiểm tra lặp lại giếng + Cho 50 µl mơi trường EMEM vào giếng + Cho 50 µl vi rút nồng độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3 10-4 vào giếng Ghi kí hiệu đĩa phản ứng + Ủ đĩa tủ ấm % CO2 37 oC 24 h - Sau ủ xong, cho 100 µl tế bào MDBK vào tất giếng bao gồm đối chứng dương, đối chứng âm, đối chứng tế bào, đối chứng môi trường hệ thống chuẩn độ vi rút + Ủ đĩa phản ứng ngày - ngày nhiệt độ 37 oC tủ ấm có % CO2 + Kiểm tra tế bào ngày kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế bào Điều kiện để chấp nhận kết qua - Đối chứng môi trường tế bào: bình thường - Hiệu giá huyết chuẩn dương: cho kết hiệu giá kháng thể xác định, nằm khoảng giao động ± độ pha loãng bậc so với hiệu giá biết - Hiệu giá chuẩn độ ngược vi rút: khoảng 30 TCID50 – 300 TCID50 7.4.2.4 Đọc kết quả: - Hiệu giá kháng thể độ pha loãng huyết cuối mà cịn xảy tượng trung hịa 50 % giếng phản ứng (không quan sát thấy CPE) - Nếu tượng trung hòa vi rút xảy 50 % số giếng mẫu huyết chưa pha lỗng đọc hiệu giá 18 TCVN8400-XX : 2020 - Nếu tất giếng nồng độ chưa pha loãng 50 % giếng nồng độ pha loãng 1/2 xảy tượng trung hịa vi rút hiệu giá xác định Cách đọc tương tự nồng độ pha lỗng - Mẫu dương tính có hiệu giá ≥ 7.4.3 Phát kháng thể BoHV-1 phản ứng ELISA Hiện có nhiều kít ELISA phát kháng thể BoHV-1 có bán sẵn thị trường Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo hướng dẫn nhà sản xuất, bước thực tham khảo phụ lục F Kết luận Động vật nghi mắc bệnh cho dương tính với bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm có đặc điểm triệu chứng, bệnh tích điển hình có kết xét nghiệm dương tính với vi rút BoHV dương tính với kháng thể BoHV (trong trường hợp chưa tiêm phòng vác xin) phương pháp tiêu chuẩn 19 TCVN 8400-XX: 2020 Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịchđệm phosphat pH ~ 7,4 (PBS) A.1.1 Thành phần: Natri hydrophosphat (Na2HPO4): 9,47g Kali dihydrophosphat (KH2PO4): 9,08 g Nước cât: 900 ml A.1.2 Cách chuẩn bị: Hòa tan Natri hydrophosphat Kali dihydrophosphat 900ml nước cất Chỉnh pH khoảng 7.2 ± 0.2 axit clohydric 1N NaOH 1N CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất A.2 Môi trường vận chuyển mẫu (PBGS) A.2.1 Thành phần: Phenol red Gelatin PBS (pH 7.4): 0.4 mg 5,0 g 1000 ml A.2.2 Cách chuẩn bị: Hòa tan gelatin PBS 56 oC, thêm đỏ phenol Sau chia ống 15 ml, ống ml hấp 121 oC 20 A.3 Dung dịch DPBS dùng cho trì cấy chuyển tế bào Hịa tan 9,55 g bột DPBS L nước cất lần, hấp vô trùng 121 oC 30 Sử dụng tốt tuần, bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC A.4 Môi trường ni tế bào (Sử dụng q trình cấy chuyển nuôi tế bào) A.4.1 Thành phần: Môi trường EMEM 20 500 ml TCVN8400-XX : 2020 Huyết thai bê (FCS), % 25 ml Kháng sinh (Penicillin/Streptomycin: 10000 UI/ml) ml Chống nấm (Fungizone: 250 μg/ml) ml A.4.2 Cách chuẩn bị Trộn cách thành phần theo tỷ lệ trên, bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC Sử dụng tốt tuần A.5 Chuẩn bị Trypsin-EDTA 1X A.5.1 Thành phần Trypsin -EDTA 10X 100ml PBS (xem A.1) 900 ml A.5.2 Cách chuẩn bị: Lắc trypsin PBS (A.1, phụ lục 1) lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.4.6), sau chia nhỏ lượng ống bảo quản nhiệt độ –20 °C Sử dụng tốt tháng A.6 Cấy chuyển nuôi tế bào A.6.1 Nguyên vật liệu: Chai nuôi tế bào 25 cm2 phát triển thành lớp đạt 90% bề mặt chai Môi trường nuôi tế bào (xem A.4) Trypsin - EDTA (xem A.5) DPBS (xem A.3) CHÚ Ý: Tất môi trường phải cân 37 oC tất vật tư dùng cho tế bào phải đảm bảo vô trùng trước sử dụng A.6.2 Cách tiến hành - Hút bỏ môi trường chai tế bào 25 cm2 nuôi tế bào MDBK lớp 90 % bề mặt chai - Rửa bề mặt thảm tế bào ml DPBS 1X, tráng qua hút bỏ DPBS - Thêm ml trypsin 1X-EDTA vào chai tế bào 25 cm láng lên bề mặt tế bào cho bề mặt tế bào phủ trypsin Ủ thời gian từ đến 10 tủ ấm 37 oC (5.4.2) Khi tế bào tách 21 TCVN 8400-XX: 2020 hết, bổ sung ml EMEM có 5% FCS vào chai để vô hoạt trypsin, trộn chuyển toàn huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml - Ly tâm huyễn dịch tế bào gia tốc 200 g Loại bỏ phần dung dịch trên, giữ cặn tế bào - Hoàn nguyên cặn với ml EMEM bổ sung % FCS, chuyển vào chai nuôi cấy 25 cm2 Nuôi chai tế bào tủ ấm 37 oC có % CO2 Theo dõi phát triển hàng ngày tế bào kính hiển vi soi ngược Sau ngày lại thay môi trường nuôi cấy Đến tế bào phát triển thành lớp bao phủ 90 % đĩa ni cấy lại tiến thành cấy chuyển lặp lại quy trình Phụ lục B 22 TCVN8400-XX : 2020 (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm có khả gây hại thao tác không cẩn thận Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da hít phải hóa chất Ln ln đeo găng tay, trang, mặc quần áo bảo hộ thực chiết tách Qui trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN DNeasy Blood & Tissue kit (Cat No 69506)1 sau: B.1 Chuẩn bị - Dung dịch AW1: thêm 130 ml etanol tuyệt đối (4.2.1) vào 98 ml dung dịch AW1 đậm đặc; - Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (4.21) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc B.2 Cách tiến hành - Hút 200 µl hỗn dịch mẫu (7.3.2.1) cho vào ống eppendorf 1.5 ml Thêm vào 180 µl buffer ATL - Thêm 20 µl proteinase K, trộn nhẹ máy lắc (5.1.4), ủ ấm 56 oC mẫu bị dung giải hoàn toàn Thỉnh thoảng trộn mẫu đặt mẫu bể ủ nhiệt nước có đảo lắc (5.1.7) Thời gian dung giải mẫu từ h - h - Thêm 200 ul buffer AL vào ống mẫu, trộn máy lắc (5.1.4) - Thêm 200 µl cồn tuyệt đối vào mẫu, lắc, trộn - Hút toàn hỗn hợp bước vào cột lọc (spin column) đặt ống thu (collection tube) Ly tâm 8000 rpm thời gian Bỏ ống thu dịch qua ly tâm - Đặt cột lọc vào ống thu Thêm 500 µl buffer AW1 Ly tâm 8000 rpm thời gian Bỏ ống thu dịch qua ly tâm - Đặt cột lọc vào ống thu Thêm 500 µl buffer AW2 Ly tâm tốc độ tối đa 14000 rpm, thời gian min, để làm khô màng cột lọc Bỏ ống thu dịch qua ly tâm - Đặt cột lọc vào ống eppendorf Thêm 200 µl buffer AE thẳng vào màng cột lọc (khơng chạm đầu típ vào màng) Để nhiệt độ phòng min, ly tâm 8000 rpm Bỏ cột lọc - Chuyển ADN thu sang ống 1,5 ml Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm thương mại khác cho kết tương đương 23 TCVN 8400-XX: 2020 - Bảo quản mẫu ADN oC ngày chạy phản ứng realtime PCR giữ âm 20 oC để lưu mẫu thời gian dài Phụ lục C 24 TCVN8400-XX : 2020 (Tham khảo) Trình tự cặp mồi, mẫu dị, thành phần phản ứng chu trình nhiệt sử dụng cho phương pháp realtime PCR phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi- mẫu dị phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Mẫu dị, mồi Kí hiệu Trình tự (5’-3’) Mồi xi gB-F TGT-GGA-CCT-AAA-CCT-CAC-GGT Mồi ngược gB-R GTA-GTC-GAG-CAG-ACC-CGT-GTC Mẫu dò gB-P FAM-AGG-ACC-GCG-AGT-TCT-TGC-CGC-TAMRA GHI CHÚ: - Trình tự cặp mồi mẫu dị phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Bảng C.1 tiêu chuẩn khuyến cáo sử dụng Các phịng thí nghiệm sử dụng cặp mồi, mẫu dị khác Tổ chức Thú y giới (OIE) Phịng Thí nghiệm tham chiếu OIE bệnh vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm khuyến cáo sử dụng Bảng C.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR TT Thành phần Thể tích (µl) cho phản ứng Nước tinh khiết khơng có nuclease 6.0 2X Reaction buffer 12,5 Mồi xi (20 µM) 0,5 Mồi ngược (20 µM) 0,5 Probe (6 µM) 0,5 Mẫu DNA 5.0 Tổng thể tích 25 Bảng C.3 - Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR 25 TCVN 8400-XX: 2020 Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95 °C chu kỳ 95 °C 15 s 60 °C (*) 50 s 40 chu kỳ GHI CHÚ: 1) Nhiệt độ thời gian phù hợp với Platinum qPCR SuperMix-UDG, code 11730-017 Việc thực cài đặt nhiệt độ thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn kít sử dụng 2) (*): Ghi nhận tín hiệu huỳnh quang Phụ lục D Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm thương mại khác cho kết tương đương Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo nhà sản xuất thành phần phản ứng realtime PCR chu trình nhiệt 26 TCVN8400-XX : 2020 (Tham khảo) Trình tự cặp mồi, thành phần phản ứng chu trình nhiệt sử dụng cho phương pháp PCR phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Bảng D.1 - Trình tự cặp mồi phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Mẫu dị, mồi Kí hiệu Trình tự (5’-3’) Mồi xuôi Ext F CACGGACCTGGTGGACAAGAAG Mồi ngược Ext R CTACCGTCACGTGAGTGGTACG Bảng D.2 - Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR TT Thành phần Thể tích (µl) Nước tinh khiết khơng có nuclease 7.0 2X Buffer 10.0 Mồi xi (20 µM) 0,5 Mồi ngược (20 µM) 0,5 Mẫu chiết tách (ADN) 2.0 Tổng thể tích cho phản ứng: 20 Bảng D.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 98 °C 30 s chu kỳ 98 °C 5s 60 °C 10 s 72 °C 10 s °C 35 chu kỳ chu kỳ GHI CHÚ: Nhiệt độ thời gian phù hợp với ThermoScientific - Phire TMHot Star II PCR3 Việc thực cài đặt nhiệt độ thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn kít sử dụng Phụ lục E Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm thương mại khác cho kết tương đương Khi sử dụng nên tuân thủ theo khuyến cáo nhà sản xuất thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 TCVN 8400-XX: 2020 (Quy định) Phương pháp xác định số lượng tế bào cách sử dụng Haemocytometer E.1 Các bước thực - Làm buồng đếm nắp kính - Nhẹ nhàng khuấy chai ni tế bào để trộn đồng - Hút 200 ul dung dịch tế bào vào ống eppendorf mới, bổ sung 200 ul Trypan Blue0.4%, trộn - Hút 100 ul dung dịch tế bào trypan blue vào buồng đếm, nhỏ dung dịch vào cạnh buồng đếm dung dịch theo mao dẫn vào đầy ngăn - Đếm tế bào cịn sống (là tế bào khơng bị nhuộm màu trypan blue) hình vng góc E.2 Tính tốn kết quả: Ct = T x Tb x 1/4 x 104 Trong đó: Ct: Số lượng tế bào ban đầu có ml T: Tổng số tế bào góc vng Tb: Hệ số pha loãng dung dịch tế bào với trypan blue 1/4: Hệ số góc vng 104: Hệ số chuyển đổi Ví dụ: Đếm tổng số tế bào góc vng có 480 tế bào, Ct = 480 x x 1/4 x 10 4= 240.104 =2.4.106 tb/ml Phụ lục F (Quy định) 28 TCVN8400-XX : 2020 Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm(TCID50) Reed- Muench Cơng thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm (TCID50) Reed-Muench: TCID50 = 10x Với X tính sau: X = A − 50 × ( a − b) − a A− B Trong đó: A tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát 50 %, tính phần trăm (%) B tỷ lệ giếng tế bào nhiễm vi rút sát 50 %, tính phần trăm (%) a nồng độ pha loãng vi rút A (lấy giá trị số mũ) b nồng độ pha loãng vi rút B (lấy giá trị số mũ) VÍ DỤ: Nồng độ vi rút pha lỗng Tỷ lệ giếng nhiễm vi rúta) 10-6 -7 10 10-8 10-9 Phản ứng Giá trị cộng dồn Nhiễm Không nhiễm 5/5 4/5 2/5 0/5 Tỷ lệ giếng nhiễm vi rút, % Nhiễm Không nhiễm Tỷ số 11 11/11 100 6/7 2/6 0/9 86 33 CHÚ THÍCH:a)Số giếng nhiễm vi rút/số giếng gây nhiễm với lượng nhiễm 100 µl/giếng.Mũi tên hướng tăng lên số nhiễm số khơng nhiễm Trong 100 µl dung dịch pha lỗng vi rút nhiễm vào giếng có: X= 86 − 50 × [( −7) − (−8)] − (−7) = 7,68 86 − 33 Vậy TCID50 là: 107,68/ 100 µl dung dịch pha lỗng vi rút Phụ lục H (Tham khảo) Quy trình thực phản ứng ELISA để phát kháng thể kháng 29 TCVN 8400-XX: 2020 vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Hiện có nhiều kít ELISA phát kháng thể BoHV có bán sẵn thị trường Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo hướng dẫn nhà sản xuất Ví dụ: sử dụng kít Infectious Bovine Rhinotracheitis virus (BHV1) gB Antibody Test Kit, hãng IDEXX4 H.1 Chuẩn bị nguyên liệu - Nguyên liệu kít để nhiệt độ phịng 30 trước làm phản ứng - Pha loãng dung dịch rửa: pha dung dịch nước rửa đặc với nước cất khử ion (4.3.2) theo tỷ lệ 1:10 Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 µl/giếng x lần rửa x bước rửa x số giếng sử dụng - Thiết lập sơ đồ bố trí mẫu: sơ đồ bố trí mẫu phải có đối chứng âm (Negative Control – NC), đối chứng dương (Positive Control – PC) H.2 Cách tiến hành Nhỏ 50 µl dung dịch nước rửa chuẩn bị F1 vào giếng; Nhỏ 50 µl Positive Control vào hai giếng A1 B1 Nhỏ 50 µl Negative Control vào hai giếng C1 D1 Nhỏ 50 µl huyết cần kiểm tra (7.4.1) vào giếng lại, vỗ nhẹ vào cạnh đĩa, tránh đọng mẫu thành giếng Đậy nắp đĩa ủ tủ ấm (5.3.2) nhiệt độ 37 oC ± oC h ủ oC - oC qua đêm (12 - 18 h) khay ẩm Đổ bỏ dung dịch đĩa, rửa đĩa cách thêm 300 µl dung dịch nước rửa vào giếng, đổ bỏ Lặp lại từ lần, tránh làm khô đĩa lần rửa Nhỏ 100 µl dung dịch Conjugate vào giếng Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ 18 oC - 26 oC h Đổ bỏ dung dịch đĩa; Rửa đĩa cách thêm 300 µl dung dịch rửa 1X vào giếng, đổ bỏ Lặp lại từ lần, tránh làm khơ đĩa lần rửa Nhỏ 100 µl dung dịch TMB Subtrate N.12 vào giếng Ủ đĩa thí nghiệm nhiệt độ 18 oC - 26 oC 10 (tránh ánh sáng) Thông tin đưa để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Khi sử dụng kít khác, nên tuân thủ theo khuyến cáo nhà sản xuất 30 TCVN8400-XX : 2020 10 Nhỏ 100 µl dung dịch Stop Solution N.3 vào giếng để dừng phản ứng 11 Đo giá trị OD (mật độ quang học) máy đọc (5.3.1) bước sóng 450 nm H.3 Tính tốn kết - Đối chứng: NCX = PCX = - Phản ứng công nhận thỏa mãn đồng thời hai điều kiện sau: + NCx > 0.50 + Pcx Blocking % > 80 % - Sự có mặt kháng thể BoHV xác định phần trăm ức chế, theo công thức sau: Blocking % = 100 x H.4 Đánh giá kết Âm tính Nghi ngờ Dương tính Blocking % < 45 45 ≤ Blocking % < 55 Blocking % ≥ 55 Những mẫu nghi ngờ, cần lấy mẫu lại sau tuần để khẳng định lại THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 TCVN 8400-XX: 2020 [1] OIE (Office International des Epizooties) Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (2018) Chương 3.4.11 Infectious bovine rhinotracheitis/infectious pustular vulvovaginitis [2] Kerstin Wernike, Bernd Hoffmann, Donata Kalthoff, Patricia König, Martin Beer Development and validation of a triplex real-time PCR assay for the rapid detection and differentiation of wild-type and glycoprotein E-deleted vaccine strains of Bovine herpesvi rút type Journal of Virological Methods 174 (2011) 77–84 [3] Peter Nettleton, George Russell Update on infectious bovine rhinotracheitis http://inpractice.bmj.com/ on November 20, 2017 [4] Jianning Wang, Joseph O’Keefe, Della Orr, Leo Loth, Malcolm Banks An international interlaboratory ring trial to evaluate a real-time PCR assay for the detection of bovine herpesvi rút in extended bovine semen Veterinary Microbiology 126 (2008) 11–19 [5] Sinead Moorea, Michael Gunna, Dermot Wallsb A rapid and sensitive PCR-based diagnostic assay to detect bovine herpesvi rút in routine diagnostic submissions Veterinary Microbiology, 75 (2000) 14153 [6] Stefan VilEek Detection of the bovine herpes virus (BHV-1) genome by PCR Journal of Virological Methods, 41 (1993) 245-248 [7] Reed L J and H Muench: A simple method of estimating fifty percent endpoints 32 ... thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm bị (Infectious bovine rhinotracheitis) Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm bò (IBR) bệnh truyền nhiễm gây vi rút bovine herpesvirus1... 46: Bệnh dại; - TCVN 8400-47 : 2019: phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển; TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-XX : 2020 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đốn – Phần XX: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm. .. phản ứng chu trình nhiệt sử dụng cho phương pháp realtime PCR phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi- mẫu dị phát vi rút viêm mũi khí quản truyền nhiễm Mẫu dị,