Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để chẩn đoán trước sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHƠI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2014 Cơng trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN Học viện Quân y Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Văn Khoa PGS.TS Đinh Đoàn Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Vào hồi ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: năm 2015 - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin –Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU  Tính cấp thiết đề tài Dị tật bẩm sinh vấn đề lớn không ngành sản khoa mà cịn thu hút quan tâm tồn xã hội Theo thống kê tổ chức y tế giới tỷ lệ dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,73% Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tỷ lệ dị tật bẩm sinh 2,4% đến 3,6% Hiện nay, việc điều trị dị tật bẩm sinh khó khăn phức tạp Các DTBS đa số chữa khỏi đƣợc kết điều trị hạn chế, thai nhi sau sinh phát triển thể lực trí lực, giảm khả lao động hay tự chăm sóc, hồ nhập với xã hội Chính việc chẩn đốn trƣớc sinh để có biện pháp tƣ vấn, dự phòng can thiệp biện pháp hàng đầu, cần thiết cấp thiết nhằm làm giảm tỷ lệ dị tật bẩm sinh Việc nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh dị tật bẩm sinh đƣợc tiến hành từ lâu Đã có nhiều phƣơng pháp khả thi đƣợc cơng bố ứng dụng thực tiễn nhƣ: siêu âm sản khoa, test sàng lọc ba (triple test)… phƣơng pháp khơng mang tính can thiệp nhƣng chẩn đốn muộn có độ đặc hiệu thấp Bên cạnh đó, phƣơng pháp nhƣ: chọc hút nƣớc ối, sinh thiết gai rau, lấy máu cuống rốn… có độ đặc hiệu cao thơng qua phân tích vật liệu di truyền thai nhi, nhƣng mang tính can thiệp, gây tỷ lệ tai biến đáng kể cho thai nhi thai phụ nhƣ sẩy thai, rò ối, thai chết lƣu, đẻ non, … Năm 1969, Walknowska cộng phát có mặt tế bào phơi thai tự máu ngoai vi ngƣời mẹ Năm 1997, Lo cộng phát DNA tự thai nhi (free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) huyết tƣơng mẹ bƣớc đột phá lĩnh vực chẩn đoán trƣớc sinh Đây phát vô quan trọng mở hƣớng đầy triển vọng chẩn đoán trƣớc sinh biện pháp khơng can thiệp.Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN tế bào phơi thai tự máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh” nhằm mục đích tách đƣợc ADN phơi thai tự tế bào phôi thai tự máu ngoại vi mẹ ứng dụng để chẩn đoán trƣớc sinh phƣơng pháp không can thiệp  Mục tiêu nghiên cứu đề tài  Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết ADN phơi thi tự máu ngoại vi mẹ  Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết phân lập tế bào phôi thai tự máu ngoại vi mẹ  Ứng dụng ADN phơi thai chẩn đốn bất đồng nhóm máu Rh tế bào phơi thai chẩn đốn hội chứng Trisomy 21, XXY  Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu đề tài Các mẫu máu ngoại vi phụ nữ mang thai bị dị tật mang thai không bị dị tật Nội dung nghiên cứu đề tài  Hoàn thiện quy trình tách chiết ADN phơi thai máu mẹ  Nghiên cứu biến đổi hàm lƣợng ADN phôi thai tự máu theo thai kỳ thời gian tồn chúng sau sinh  Xây dựng quy trình phân lập tế bào phơi thai máu mẹ  Kiểm tra, đánh giá ADN phôi thai máu mẹ  Kiểm tra, đánh giá tế bào phôi thai máu mẹ  Ứng dụng sàng lọc chẩn đoán di truyền trƣớc sinh: tăng sản thƣợng thận, teo Duchenne, bất đồng nhóm máu, hội chứng trisomy 21, XXY  Địa điểm thực đề tài Các nghiên cứu đƣợc thực chủ yếu Phịng Cơng nghệ gen Di truyền tế bào – Trung tâm Sinh Y dƣợc học – Học viện Quân y  Đóng góp đề tài  Đánh giá đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ ứng dụng chẩn đoán trƣớc sinh thời điểm thích hợp thời gian phát triển thai kỳ  Xây dựng đƣợc quy trình phân lập tế bào phơi thai tự máu ngoại vi mẹ, ứng dụng cho chẩn đốn dị tật bẩm sinh  Góp phần sàng lọc chẩn đoán bệnh di truyền trƣớc sinh biện pháp không can thiệp  Ứng dụng thực tiễn đề tài  Lý luận: Góp phần làm sáng tỏ tồn ADN tế bào phôi thai tự máu ngoại vi mẹ ứng dụng sàng lọc chẩn đoán trƣớc sinh bệnh di truyền  Hồn thiện đƣợc quy trình tách chiết ADN tự phân lập tế bào phôi thai tự máu ngoại vi mẹ  Thực tiễn: Góp phần giảm thiểu trƣờng hợp sinh bị bệnh di truyền, DTBS, giảm gánh nặng cho gia đình xã hội  Bố cục luận án Luận án gồm 157 trang bao gồm: Phần đặt vấn đề (3 trang); Tổng quan tài liệu (39 trang); Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu (21 trang); Kết thảo luận (56 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang), Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (2 trang), Tài liệu tham khảo (29 trang),với 251 tài liệu gồm thứ tiếng tiếng Việt (37 tài liệu) tiếng Anh (214 tài liệu) Luận án có 26 bảng, 43 hình CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU  Phƣơng pháp chẩn đoán không can thiệp Phƣơng pháp không can thiệp phƣơng pháp chẩn đốn dựa vào phân tích vật liệu di truyền thai nhi nhƣng không từ mẫu can thiệp vào tử cung buồng ối mà từ vật liệu di truyền thai nhi có máu ngoại vi ngƣời mẹ Ngày nay, việc chẩn đoán sớm dị tật trƣớc sinh vấn đề quan trọng Nó góp phần quan trọng cho việc giảm bớt gánh nặng cho xã hội, giảm bớt bất hạnh gia đình có đứa trẻ khuyết tật Những gia đình mà bố mẹ mang di chứng chất độc màu da cam, gia đình tiếp xúc nhiều với hóa chất độc hại hay gia đình gặp khó khăn việc sinh muộn, gia đình mang tần suất sinh mắc dị tật cao Những thai nhi ngày lớn lên, thai nhi lớn tai biến đình thai ngày cao Do việc lựa chọn phƣơng thức kỹ thuật dùng cho việc chuẩn đốn sớm có ý nghĩa việc chẩn đốn trƣớc sinh Có phƣơng thức chẩn đốn sớm trƣớc sinh qua máu mẹ: -Phân tích di truyền ADN phôi thai tự lƣu hành máu mẹ -Phân tích di truyền tế bào phơi thai lƣu hành máu mẹ  Sàng lọc chẩn đoán di truyền qua ADN phôi thai tự máu mẹ Sự phát DNA tự thai nhi (free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) huyết tƣơng mẹ bƣớc đột phá lĩnh vực chẩn đoán trƣớc sinh (Lo cộng sự, 1997 Các ứng dụng lâm sàng DNA phôi thai đƣợc tiến hành gần 10 năm sau giải mã gen Rhesus D (Zhong cộng sự, 2000; Lo YMD cộng sự, 1993), rối loạn gen đơn (Chiu cộng sự, 2008)và chẩn đốn giới tính bào thai (Costa cộng sự, 2001; Edwards cộng sự, 1966; Grosset L cộng sự, 1974;) Ƣu điểm việc định lƣợng DNA phơi thai, nhờ cho phép nghiên cứu DNA thai nhi điều kiện bệnh lý lâm sàng khác trình mang thai (Costa cộng sự, 2001; Lo cộng sự, 1998) tăng hàm lƣợng DNA phôi thai đƣợc tìm thấy thai nhi có biểu bất thƣờng, chậm phát triển thai nhi, sinh sớm, bệnh Down, tiền sản giật vv (Lo cộng sự, 1999; Sekizawa cộng sự, 2000; Troeger cộng sự., 1999) Các nghiên cứu ADN phôi thai tự huyết tƣơng mẹ (nguồn gốc, vận chuyển từ mẹ sang bào thai, hàm lƣợng trình mang thai, biến hoàn toàn sau sinh) đƣợc đề cập đến số tài liệu Tuy nhiên, nguồn gốc xuất ADN phơi thai tự cịn vấn đề chƣa rõ nhiều năm Gần đây, nhiều cơng trình xác định đƣợc chúng có nguồn gốc từ tế bào apoptosis thai Rất nhiều loại mô khác nhƣ tế bào biểu mô, tế bào gan bào thai đƣợc giả định nhƣ nguồn gốc sơ khai ADN phôi thai tự việc phân huỷ tế bào của`` thai nhi huyết tƣơng mẹ có giải phóng DNA bào thai Việc truyền trực tiếp DNA thai nhi qua màng ối DNA thai nhi tự huyết tƣơng đƣợc đề cập đến (Kolialexi cộng 2004; Sekizawa cộng sự, 2000; Illanes cộng sự, 2005; Kondo cộng sự, 2002)  Sàng lọc chẩn đốn di truyền qua tế bào phơi thai máu ngoại vi mẹ Tới nay, sau nhiều nghiên cứu khẳng định có mặt tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ Từ tuần thứ thai kì, phát đƣợc tế bào thai gồm: Trophoblast (tế bào nuôi phôi), bạch cầu lympho, hồng cầu nhân, tế bào gốc, song số lƣợng tế bào thấp Các tế bào mang vật chất di truyền phơi thai có ý nghĩa chẩn đốn dị tật sớm cho thai Tuy nhiên, có khác biệt loại tế bào:Trophoblast (lá nuôi phôi): xuất hiên sớm nhất, nhanh bị hủy, không xuất máu ngoại vi mẹ tất thai, khơng có kháng ngun bề mặt đặc hiệu.Bạch cầu phôi thai: Lần bạch cầu phôi thai đƣợc chứng minh có mặt máu ngoại vi mẹ vào năm 1969 Walknowska, đặc biệt với thai nhi mang giới tính nam Sự tồn đƣợc chứng minh khác biệt biểu kháng nguyên bạch cầu ngƣời (HLA) Tuy vậy, việc nghiên cứu loại tế bào gặp phải khó khăn định: (1) tế bào khơng có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu; (2) tuổi thọ tế tƣơng đối dài tồn nhiều năm sau sinh dẫn đến tăng khả chẩn đoán sai.Hồng cầu nhân (hồng cầu thai nhi hay NRBCs): Luôn đƣợc coi loại tế bào đầy hứa hẹn cho kỹ thuật với ƣu điểm: xuất sớm tồn suốt thai kì, tuổi thọ ngắn loại bỏ đƣợc khả tế bào xuất từ lần mang thai trƣớc đó, có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu Hơn số lƣợng tế bào tăng lên phôi thai mang dị tật bẩm sinh Do vậy, nghiên cứu giới tập trung vào phân tách hồng cầu có nhân thai nhi Hình 1.6: Hình minh họa thành phần máu ngoại vi mẹ(http://www.camurrilamberto.it/genLamberto/MCC_NonInvasive_Prenatal_Diagnosis _.pdf ) Các đặc trƣng hồng cầu nhân: Xuất sớm máu ngoại vi, mang gen hồn chỉnh phơi thai, mang kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, thời gian tồn máu ngoại vi có giới hạn CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU   VẬT LIỆU Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu máu ngoại vi phụ nữ mang thai từ tuần tuổi đến 22 tuần tuổi thai số lƣợng mẫu 279 mẫu mẫu máu ngoại vi phụ nữ mang thai mắc hội chứngtrisomy 13, 18, 21, Klinefelter (XXY Bệnh Viện Từ Dũ, 34 mẫu máu ngoại vi phụ nữ có nguy sinh dị tật đƣợc chọc ối chẩn đoán Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dƣợc học – HVQY Thể tích mẫu máu ngoại vi cần lấy từ ml từ phụ nữ mang thai tuần 14-22 tuần Mẫu chứng: Các phụ nữ chƣa mang thai chƣa quan hệ tình dục lấy 02 mẫu máu ngoại vi Mẫu máu ngoại vi phụ nữ mang thai có nguy sinh bị TSTTBS 11 mẫu, Teo Duchenne 10 mẫu máu ngoại 13 mẫu máu ngoại vi phụ nữ có nhóm máu Rh(-) mang thai để chẩn đốn nhóm máu Rh củacon  Hố chất thiết bị máy móc  Hoá chất tách chiết ADN  Hoá chất cho PCR  Hoá chất dùng cho điện di Agarose, Đệm TBE 1, buffer GA 1X, Polymer POP4, HiDi formamid, Gene Scan GS500  PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Phƣơng pháp tách ADN phôi thai tự phƣơng pháp nhân gen PCR realtime-PCR Quy trình tách phân lập tế bào phôi thai tự do, phƣơng pháp nhuộm tế bào kỹ thuật FISH, phƣơng pháp QF-PCR chứng minh tồn tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ Kỹ thuật phân lập tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ Kỹ thuật cố định tế bào phôi thai nhuộm tế bào phôi thai sau phân lập Tách chiết ADN từ phôi bào khuếch đại gen kit WGA REPLI-g Single Cell Kit Qiagene Kỹ thuật QF-PCR cho chẩn đoán bệnh nhiễm sắc thể phương pháp phân tích đoạn STRs Kỹ thuật điện di sản phẩm QF-PCR máy ABI 3130 XL Phương pháp phân tích kết sản phẩm định lượng huỳnh quang sau điện di mao quản        CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  KẾT QUẢ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN PHƠI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ  Kết tách chiết ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ Mẫu huyết tƣơng đƣợc tách ADN phôi thai tự nhiều phƣơng pháp, phƣơng pháp ban đầu chúng tơi tách dùng 200µl dung dịch huyết tƣơng sau biến tính nhiệt độ 99oC phút, dung dịch sau biến tính đƣợc ly tâm tốc độ cao 13.000 vòng/phút phút thu dung dịch phía vào ống 1,5ml khác Phƣơng pháp thứ tách sử dụng kít Qiagene có cải tiến với bƣớc đƣợc nêu chi tiết phần phƣơng pháp nghiên cứu Sau tách xong đo nồng độ ADN phôi thai tự tách chiết đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.1 Bảng kết đo nồng độ ADN phương pháp tách nhiệt phương pháp tách Kít Qiagene (Chi tiết Phụ luc bảng 3.1) Bằng nhiệt độ ST T Mã BN Tuổi thai Tuổi mẹ 811 8.2 812 … Kít Qiagene Nồng độ ADN (ng/ul) Độ tinh 32 1,12 1,00 Nồng độ ADN (ng/ul) 3,00 31 0,81 1,20 3,20 1,78 … … … … … … … 29 839 32 0,86 0,67 3,99 1,78 30 840 35 0,93 1,34 3,78 1,80 0,81 0,18 0,97 0,20 3,95 0,53 1,81 0,31 TB SD Độ tinh 1,82 Từ bảng số liệu tách chiết ADN phôi thai tự hai phƣơng pháp nhận thấy nồng độ ADN tách chiết đƣợc cách sử dụng nhiệt thấp nhiều so với phƣơng pháp tách chiết kít qiagene có cải tiến Mặt khác độ tinh ADN tách chiết đƣợc kít qiagene cao đạt đƣợc tiêu chuẩn cho phép độ tinh ADN nằm khoảng từ 1,80 đến 2,00 Trong phƣơng pháp tách ADN tự kỹ thuật biến tính nhiệt độ 99 oC phút cho thấy nồng độ trung bình phƣơng pháp thấp 0,81±0,18 ng/µl độ tinh 0,97±0,20 Kết tách chiết kít Qiagene nồng độ cao 3,95±0,53 ng/µl độ tinh 1,81±0,31 Trong trình tách chiết ADN tự kít Qiagene chúng tơi có cải tiến sử dụng 400ul huyết tƣơng, việc tăng lƣợng mẫu để tách ADN phôi thai tự đƣợc Lo cộng đề cập tới năm 1998 ông sử dụng từ 400ul đến 700ul mẫu để tách ADN  Kết chạy PCR nhân gen SRY Các mẫu ADN sau tách xong đƣợc nhân gen kỹ thuật Nested PCR (PCR lồng) cho gen SRY nhân gen PCR thƣờng cho gen GAPDH Hình 3.1 Hình ảnh kết điện di gen SRY với gen GAPDH mẫu nghiên cứu từ 811 đến 825 M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ 100bp; Các giếng từ 811 đến 825 mẫu nghiên cứu Phía mẫu nhân gen SRY kích thước sản phẩm 198bp Phía mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm PCR 97bp Nhận xét: Các mẫu từ 811 đến mẫu số 825 thấy xuất băng gen GAPDH (nửa điện di phía dƣới) điều cho thấy mẫu chúng tơi tách đƣợc ADN Từ hình cho thấy băng điện di xuất rõ nét gọn, kích thƣớc sản phẩm PCR phù hợp với tính tốn lý thuyết Trong hình ảnh kết điện di mẫu nghiên cứu gen SRY có số mẫu khơng xuất băng vạch 198bp mẫu xuất băng vạch 198bp Các mẫu đƣợc nhân gen GAPDH hình cho thấy tất mẫu nghiên cứu xuất băng vạch gen GAPDH 97bp điều chứng tỏ mẫu nghiên cứu tách chiết đƣợc ADN Từ kết chứng minh đƣợc máu mẹ ngƣời mang thai có ADN phơi thai tự lƣu hành Kết đƣợc kiểm chứng kỹ thuật siêu âm tuần thứ 16 sau sinh cho kết hoàn toàn phù hợp Dƣới kết 30 trƣờng hợp nghiên cứu ban đầu cho Nghiên cứu quy trình tách chiết ADN phơi thai tự máu ngoại vi mẹ chứng minh đƣợc tồn ADN phôi thai tự lƣu hành máu ngoại vi mẹ Theo nghiên cứu Zolotukhina T.V., (2005), tách chiết ADN phôi thai huyết tƣơng huyết mẹ xác định giới tính nested PCR qua mồi SRY nhiễm sắc thể Y Nghiên cứu cho thấy kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu tác giả giới Với 30 mẫu máu ngoại vi phụ nữ mang thai với tuổi thai từ tuần thứ đến tuần thứ thai kỳ, kết thấy xuất 16/30 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY 14/30 trƣờng hợp âm tính với gen SRY, 30 mẫu nghiên cứu dƣơng tính với gen GAPDH, nhận định mẫu nghiên cứu tách đƣợc ADN phôi thai tự do, mẫu âm tính với gen SRY âm tính thật Từ kết đây, chứng minh đƣợc tồn ADN phôi thai tự lƣu hành máu mẹ Và nhận định quy trình tách chiết ADN phơi thai tự lƣu hành máu ngoại vi mẹ có cải tiến kít Qiagene đạt kết tốt Kết mở hƣớng chẩn đoán trƣớc sinh không  Kết định lƣợng số copy ADN phôi thai máu ngoại vi mẹ Từ bảng thấy nồng độ trung bình ADN phơi thai tự máu ngoại vi mẹ tuần từ tuần thứ đến tuần thứ 12 có độ lệch chuẩn lớn, lớn giá trị trung bình điều chứng tỏ nồng độ ADN phôi thai dao động khoảng lớn nhƣ tuần thai kỳ nồng độ trung bình ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ 50,69 ± 83,56 copy/ml, hay tuần thứ 12 206,63 ± 742,55 copy/ml Bảng 3.6 Bảng kết số copy nồng độ gen DYS14 nồng độ gen GAPDH tuần đến 12 thai kỳ (chi tiết xem phần phụ lục bảng 3.6) Tuần Tuần Số Tuần Số Tuần Tuần 10 Tuần 11 Tuần 12 Số Số Số Số Số Số Số Số Số Số Số Số Mã cop cop cop bản bản bản cop y bện y copy Tỷ lệ gen copy Tỷ lệ gen y copy Tỷ lệ gen copy copy Tỷ lệ gen copy copy Tỷ lệ gen copy copy Tỷ lệ gen y copy Tỷ lệ gen S h gen gen DYS14/G gen gen DYS14/G gen gen DYS14/G gen gen DYS14/G gen gen DYS14/G gen gen DYS14/G gen gen DYS14/G T nhâ DY GAP APDH DY GAP APDH DY GAP APDH DYS GAP APDH DYS GAP APDH DYS GAP APDH DY GAP APDH T n S14 DH (%) S14 DH (%) S14 DH (%) 14 DH (%) 14 DH (%) 14 DH (%) S14 DH (%) 297 18900 0 1,57 2998 23965 12,51 129 269 332 6942 4,78 270 4613 271 1799 9692 13,32 463 81300 8791 27482 2410 1380 275 12411 1380 27400 276 2380 874 277 7156 0,18 2470 0,61 280 1508 943 295 16110 296 3,5 13440 0,03 … … … 59 622 125 15123 60 623 68,8 3754 5157 20,87 5080 1562 692 22111 52800 25021 3470 0,69 4123 0,73 1880 2467 756 52100 3190 0,38 508 9,84 3897 378 1887 20,07 5100 7,56 3620 0 3620 0 4810 0 4330 1870 1600 756 5,95 1160 5,09 4300 1,63 3471 1830 1980 41289 1380 4300 3217 988 3,74 36 978 3,68 986 4,67 27 610 4,43 … … … … 412, 2290 345, 2190 3210 1890 … 13 … 15 12 … … 0,83 238 15100 22820 0,30 125 13332 0,00 … 24 50 … … … 1,58 350 28900 1,21 22800 0,55 260 21300 1,22 13303 0,00 13300 0,00 30 37 … … … 45 1510 … 59 46 … 2810 367 13901 2,64 380 15600 1,78 289 278, … … 3090 1,35 1089 2,65 398 312, 1130 1,29 2,77 70 … 1,80 1,58 Âm nội 61 ng 13303 1333 0,00 1333 0,00 1336 0,00 0,00 Âm nội ng 62 1409 14094 13980 T B 50,6 ,2 83,5 ,2 14070 0,00 10395 1,97 295, 14412 16 3,4 85,7 0,52 18877 S D 0,00 1,05 3,60 14043 135, 17951 ,1 632, 39348 ,1 0,00 1,68 14090 0,00 151, 22583 ,3 1,72 8580 3,38 642, 3,45 167, 9700 ,5 755, 9966 ,2 1400 0,00 2,26 5,36 182, 1054 761, 1344 2,5 1389 0,00 2,83 6,52 206, 1117 2,2 742, 2040 4,4 0,00 3,70 4,57 Để xác định đƣợc tuổi thai thích hợp nhất, tuổi thai thấp có nồng độ cao để chẩn đốn xác ứng dụng vào sàng lọc chẩn đoán bệnh di truyền trƣớc sinh Chúng tiến hành nhân gen SRY kỹ thuật Nested PCR, siêu âm tuổi thai 16 tuần kiểm tra lại sau sinh so sánh với kỹ thuật Realtime PCR Bảng 3.7 Bảng kết so sánh kỹ thuật Nested PCR, Realtime PCR với siêu âm tuần thứ 16 sau sinh (chi tiết kết bảng thể bảng 3.7 phần Phụ lục bảng kết nghiên cứu) ST T … 60 61 62 Mã bệnh nhân 269 … 623 Âm nội chứng Âm nội chứng Sau Siêu sin âm h + + … … + + Tuầ n6 +/+ … +/+ Tuần +/+ … +/+ Tuầ n8 +/+ … +/+ Tuần +/+ … +/+ Tuần 10 +/+ … +/+ Tuần 11 +/+ … +/+ Tuần 12 +/+ … +/+ -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- - - -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- - - Ghi chú: -/-; +/+: Kết chẩn đoán kỹ thuật Nested PCR kỹ thuật Realtime –PCR giống âm tính dương tính -/+: : Kết chẩn đoán kỹ thuật Nested PCR kỹ thuật Realtime –PCR khác Nested âm tính cịn Realtime dương tính Từ kết trên, chúng tơi nhận thấy để ứng dụng ADN phôi thai vào sàng lọc chẩn đoán bệnh di truyền trƣớc sinh thời điểm thích hợp phƣơng pháp Reatime PCR tuần thứ trở với kỹ thuật Nested PCR phải tuần thứ trở  Kết biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ Để kiểm tra xem nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ biến đổi theo tuần thai thai nhi tiến hành định lƣợng mẫu nghiên cứu tuần từ tuần đến 22 tuần tuổi Kết cho thấy nồng độ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự ml huyết tƣơng có thay đổi tuần nồng độ có xu hƣớng tăng lên theo tuổi thai, trƣờng hợp nồng độ có lúc giảm nhƣng sau xu hƣớng tăng trở lại tuần sau (xem đầy đủ biểu đồ phần phụ lục Hình ảnh biểu đồ số đến biểu đồ số 15) Hình 3.10 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự trƣờng hợp 269 Trục tung biểu diễn nồng độ ADN phơi thai (tính số copy/ml), trục hồnh biểu diễn tuổi thai tuần từ đến 22 tuần Trong trƣờng hợp 269 đƣờng cong biểu diễn nồng độ ADN phôi thai máu ngoại vi mẹ tăng lên nhanh từ tuần thai thứ đến tuần thai 14, nhƣng đến tuần thứ 16 nồng độ giảm cách đáng kể xuống gần nồng độ ADN phôi thai tuần tuổi thai, sau tuổi thai sau nồng độ ADN phôi thai lại tăng dần trở lại.Kết chạy nhân gen SRY 189 bệnh nhân nghiên cứu Sau hồn thành quy trình tách chiết ADN phơi thai tự nhân gen kỹ thuật Nested PCR tiến hành đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu phƣơng pháp Chúng nghiên cứu 189 trƣờng hợp cho kết bảng dƣới đây, kết đƣợc kiểm chứng sau sinh cho kết hồn tồn phù hợp Chúng tơi nhận thấy độ nhạy phƣơng pháp 100% độ đặc hiệu 100% Kết tƣơng tự kết tác giả Sekizawa cộng (2007) 302 trƣờng hợp từ tuần đến 16 tuần tuổi thai thấy 298 302 trƣờng hợp xác định xác nhân gen SRY, với độ nhạy 97,2% độ đặc hiệu 100% Bảng 3.8 Bảng kết nhân gen SRY kiểm chứng sau sinh 189 mẫu nghiên cứu (Chi tiết xem phần Phụ lục bảng 3.8) STT Mã BN Kết trƣớc sinh Kết sau sinh Tuổi Tuổi thai 841 (-) (-) 31 … … … … … … 189 1029 (-) (-) 29 8.2 Từ bảng nhận thấy 189 mẫu nghiên cứu thấy xuất 84 mẫu dƣơng tính với gen SRY 105 mẫu âm tính với gen SRY Các kết trƣớc sinh sau sinh hoàn toàn phù hợp với  Kết biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ sau sinh Để đánh giá đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ sau sinh thu thập mẫu nghiên cứu định lƣợng nồng độ ADN phôi thai tự trƣớc sinh tuần thai 36 thai kỳ mẫu máu mẹ sau sinh thời điểm giờ, giờ, sau sinh Bảng 3.9 Bảng kết nồng độ ADN biến thiên sau sinh STT Mã bệnh nhân SS01 SS02 SS03 SS04 SS05 SS06 SS07 Trung bình SD Số copy gen DYS14 Trƣớc sinh tháng sau sinh sau sinh (Tuần thai 36 tuần) 587 42 329 25 890 45 532 60 716 34 413 27 344 27 544,43 37,14 0,57 206,02 12,72 1,51 sau sinh 0 0 0 0 Trên bảng kết nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ trƣớc sau kkhi sinh, nhận thấy nồng độ copy gen DYS14/1ml huyết tƣơng cao trung bình 554,43 ± 206,02 copy/ml Và sau nồng độ gen DYS14 1ml 37,14 ± 12,72 copy/ml, sau sau sinh giá trị trung bình số copy gen DYS14 0,57± 1,51 copy/ml, hồn tồn khơng cịn ADN tự sau sinh thứ sau sinh Trong trƣờng hợp có trƣờng hợp ADN phơi thai tự khơng đƣợc tìm thấy sau sau sinh, trƣờng hợp sau sau sinh ADN phôi thai tồn máu ngoại vi mẹ Ba sau sinh nồng độ ADN phơi thai khơng cịn tìm thấy máu ngoại vi mẹ Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang cộng (1999), nghiên cứu 10 phụ nữ mang thai nam Tác giả lấy mẫu thời điểm tuần, tuần, tuần, ngày sau sinh tác giả thấy tất thời điểm không phát đƣợc ADN phôi thai tự Lần thứ tác giả nghiên cứu 12 phụ nữ mang thai khác, tác giả lấy mẫu thời điểm phút, 15 phút, 30 phút, 45, 60 120 phút, kết cho thấy ADN phôi thai tự máu mẹ có thời gian bán thải vào khoảng 16,3 Error! Reference source not found Hình 3.14 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự sau sinh Từ kết lựa chọn thời điểm lấy mẫu khoảng giờ, sau sinh Kết cho thấy ADN phôi thai tự sau sinh bị hoàn toàn thứ sau sinh hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Lo cộng năm 1999 Từ kết nhận định ADN phôi thai lƣu hành máu ngoại vi mẹ tồn thời gian ngắn sau sinh Ở nghiên cứu nhận thấy sau sau sinh ADN phôi thai không thấy xuất máu ngoại vi mẹ  So sánh nồng độ ADN phôi thai máu ngoại vi mẹ với kết QFPCR Dƣới hình ảnh mẫu chạy chẩn đoán bất thƣờng nhiễm sắc thể Kít Aneufast Kit đƣợc điện di mao quản: Hình 3.15 Hình ảnh mẫu QF64 (tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) bình thƣờng có NST 46, XY Hình ảnh cho chúng tơi thấy locus 13, 18, 21 XY cho peak với tỷ lệ 1:1 Đối với nhiễm sắc thể giới tính có locus Amel; X22; DXYS28; DXYS267 nằm nhiễm sắc thể X nhiễm sắc thể Y xuất peak với tỷ lệ 1:1 Riêng locus SRY nằm NST Y mẫu nghiên cứu xuất peak chứng tỏ mẫu thai nam mang nhiễm sắc thể bình thƣờng 46, XY Chúng đối chiếu so sánh mẫu nghiên cứu định lƣợng nồng độ ADN phôi thai máu ngoại vi mẹ thấy nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ mẫu 9,69% Chúng nhận thấy mẫu đƣợc chẩn đốn có NST bình thƣờng 46, XY đối chiếu so sánh với nồng độ ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ thấy nồng độ ADN phơi thai mẫu có nhiễm sắc thể 46, XY trung bình khoảng 10,01 ± 2,67% Hình 3.16 Hình ảnh điện di mao quan mẫu QF 61 (tƣơng ứng với mẫu DT 02) có NST 47XY, +21 Từ hình ảnh cho thấy locus NST số 13, 18, XY xuất peak với tỷ lệ 1:1 dị hợp tử peak đồng hợp tử Ở mẫu locus NST số 21: D21S1442, D21S1411 xuất peak với tỷ lệ 1:1:1 Locus D21S1435, D21S1446 xuất peak với tỷ lệ 2:1 Từ kết kết luận mẫu nghiên cứu bị thai nam bị hội chứng Down (Trisomy 21) Bảng 3.10: Bảng nồng độ ADN phôi thai tự huyết tương mẹ bệnh nhân mang thai có NST 46, XY (Chi tiết xem phần phụ lục bảng 3.10) Mã bệnh STT nhân BT01 … … 29 BT29 TB SD Tuổi mẹ Tuổi thai 41 … 39 33,55 6,10 16 … 17,5 18,36 2,46 Số copy Số Tỷ lệ gen gen copy gen DYS14/GAPDH DYS14 GAPDH (%) 3312,0 27506,0 12,04 … … … 579,3 4318,0 13,42 848,7 7923,4 10,01 1141,3 10036,0 2,67 QFPCR 46,XY … 46XY Bảng 3.11: Bảng nồng độ ADN phôi thai tự huyết tương mẹ bệnh nhân mang thai có NST bất thường Mã bệnh STT nhân DT01 DT02 Tuổi Tuổi mẹ thai 40 20 36 16 Hội chứng 47,+21 47,+21 Số copy Số Tỷ lệ gen gen copy gen DYS14/GAP DYS14 GAPDH DH (%) QF-PCR 4561,4 11380,0 40,08 47,XY,+21 890,7 1044,0 85,32 47,XY,+21 10 TB SD DT03 DT04 DT05 DT06 DT07 DT08 DT09 DT10 27 32 37 36 40 36 30 34 34,89 4,40 19 23 17 16 18 19 19 20 18,56 2,19 47,XXY 47,+21 47,+21 47,+21 47,+21 47,+18 47,XXY 45, XO 465,9 306,7 819,0 935,4 1419,3 1209,0 279,5 0,0 1209,7 1315,4 1541,0 648,0 1606,9 2831,6 2188,0 3787,2 935,4 1389,6 2884,7 3337,3 30,23 47,33 50,97 33,03 64,87 31,9 29,9 0,0 46,0 18,8 47,XXY 47,XY,+21 47,XY,+21 47,XY,+21 47,XY,+21 47,XY,+18 47,XXY 45, XO So sánh nồng độ AND phôi thai bảng 3.10 3.11 thấy nồng độ ADN phôi thai huyết tƣơng mẹ trƣờng hợp bình thƣờng 10,01 ± 2,67% trƣờng hợp bất thƣờng 46,0 ± 18,8%, điều cho thấy nồng độ ADN phôi thai tự trƣờng hợp bị dị tật cao trƣờng hợp bình thƣờng khoảng 4,5 lần, khác có ý nghĩa thống kê với p=0,00043 (< 0,05), tuổi thai tuổi mẹ trung bình hai nhóm không khác nhiều, khác tuổi mẹ nhóm khơng có ý nghĩa thống kê với p=0,48 (> 0,05) Chungwen Wei cs (2001), nghiên cứu sàng lọc ADN phôi thai tự máu mẹ qua gen xác định giới tính nam giới SRY gen - lactin Trong số 30 đối tƣợng thai phụ, 19 trƣờng hợp thai nam đƣợc xác định xác qua phân tích ADN phơi thai máu mẹ với độ xác 100% đối chiếu với kết phân tích nhiễm sắc thể qua tế bào dịch ối Nồng độ ADN tách chiết đƣợc tăng cao trƣờng hợp thai nhi bị Down, nồng độ ADN phôi thai trƣờng hợp bất thƣờng tăng cao trƣờng hợp bình thƣờng khoảng 2,9 lầnError! Reference source not found Kết phù hợp với kết tác giả Chungwen năm 2001  KẾT QUẢ QUY TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO PHƠI THAI TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ  Kết phân lập tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ Để phân lập đƣợc tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ tiến hành phân lập dựa vào phức hợp kháng nguyên kháng thể với kháng thể lựa chọn kháng thể CD71+ Để phân lập tốt tế bào phôi thai tế bào máu ngoại vi mẹ cịn dựa vào ngun tắc hạt từ tính Các hạt từ tính chúng tơi bọc bề mặt ngồi hạt từ Streptavidin, cịn kháng thể chúng tơi gắn Biotin Mối liên kết Streptavidin với Biotin liên kết bền chặt mặt hóa học Sau thu đƣợc hồng cầu có nhân phƣơng pháp chúng tơi nhuộm hồng cầu có nhân thuốc nhuộm huỳnh quang để chứng minh tồn tế bào phôi thai tự máu ngoại vi mẹ Sau thực thu đƣợc số kết sau: Hình 3.21 Hình ảnh tế bào phơi thai mẫu số 831 Hình 3.22 Hình ảnh tế bào phơi thai mẫu số 837 Từ hình ảnh kết chúng tơi nhận thấy tế bào phơi chúng tơi tách đƣợc có xuất tín hiệu màu vàng NST Y, điều chứng minh quy trình tách tế bào phơi thai máu ngoại vi mẹ đạt kết tốt Theo tác giả Babochkinavà cộng năm 2005 nghiên cứu nhuộm tế bàophôi thai tự máu ngoại vi mẹ 19 trƣờng hợp mang thai từ tuần thứ 12 đến 37 tuần với độ nhạy phản ứng lai huỳnh quang NST Y 91% độ đặc hiệu 75% tác giả chứng minh có tế bào phơi thai lƣu hành tự máu mẹ  Kết nhân gen SRY sau phân lập tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ Sau phân lập tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ tiến hành khuếch đại gen tế bào phân lập đƣợc đó, sau tiến hành chạy nhân gen SRY để chứng minh tồn tê bào phôi thai máu ngoại vi mẹ Quy trình khuếch đại gen từ tế bào kít Repli-G Qiagene đƣợc miêu tả chi tiết phần phƣơng pháp nghiên cứu quy trình nhân gen locus NST X NST Y đƣợc thực kít Aneufast cho kết dƣới đây: Hình 3.23 Hình kết nhân gen locus NST giới tính X Y mẫu nghiên cứu 964 Từ hình ảnh kết cho chúng tơi thấy sau nhân gen locus NST giới tính X Y alen xuất với tín hiệu Peak cao rõ nét Trong kết có xuất Alen NST Y locus Amel, locus SRY locus DXYS156 điều chứng minh đƣợc mẫu tế bào phôi tách đƣợc tế bào phôi thai tự do, tế bào phơi thai mang nhiễm sắc thể giới tính Y Các locus khác NST giới tính X Y xuất với tín hiệu tỷ lệ bình thƣờng  Kết ứng dụng ADN phơi thai tự máu ngoại vi mẹ để sàng lọc chẩn đoán di truyền trƣớc sinh  Kết sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Chúng tiến hành sàng lọc bệnh nhân qua ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ Bằng việc sử dụng nhân gen SRY gen GAPDH với quy trình chu trình phản ứng nhƣ nêu Chúng thu đƣợc kết điện di sản phẩm PCR nhƣ sau: Hình 3.24 Hình ảnh điện di gen SRY mẫu sàng lọc bệnh CAH M: Marker 100 Âm: chứng âm nước cất Dương: chứng dương CAH1, CAH2, CAH3, CAH4, CAH5, CAH6, CAH7, CAH8, CAH9, CAH10,CAH11 mẫu bệnh nhân nghiên cứu Từ kết điện di nhận thấy có 5/11 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY 6/11 trƣờng hợp âm tính với gen SRY Tất 11 trƣờng hợp cho kết dƣơng tính với gen nội chứng GAPDH Trong 11 trƣờng hợp nghiên cứu có trƣờng hợp cần chọc ối làm xét nghiệm chẩn đoán bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh Bảng 3.12: Bảng kết sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 8 8 Chẩn đoán gen SRY (-) (-) (+) (+) Kết kiểm tra sau sinh (-) (-) (+) (+) CAH5 (+) (+) CAH6 CAH7 CAH8 CAH9 CAH10 CAH11 8 8 8 (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) STT Mã bệnh nhân Tuổi thai CAH1 CAH2 CAH3 CAH4 10 11 KẾT QUẢ GEN CYP21A2 chọc ối sau sinh Bình thƣờng Đột biến , hủy thai Đột biến Bình thƣờng Dị hợp xóa đoạn exon 1- Bình thƣờng Dị hợp tử R356W Bình thƣờng đột biến , hủy thai Bình thƣờng Bình thƣờng Trên bảng kết nhận thấy có 5/11 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY khơng phải dùng thuốc Trong trƣờng hợp có trƣờng hợp kiểm tra gen CYP21A2 sau sinh có mang đột biến Cịn 6/11 trƣờng hợp âm tính với gen SRY tiếp tục phải dùng thuốc đến tuần thứ 16 thai kỳ trƣờng hợp có trƣờng hợp bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh có trƣờng hợp hủy thai trƣờng hợp âm tính với gen SRY không bị bệnh Theo tác giả Du cộng năm 2009 sàng lọc chẩn đốn thành cơng trƣờng hợp mang thai bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thông qua ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ Kết sàng lọc đƣợc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh  Kết sàng lọc bệnh Teo Duchenne Các gia đình, dịng họ có tiền sử sinh bị Teo Duchenne đƣợc sàng lọc bệnh trƣớc sinh ADN phôi thai tự máu ngoại vi mẹ tuần thứ thai kỳ Bảng 3.13: Bảng kết sàng lọc bệnh Teo Duchenne STT 10 Mã bệnh nhân DMD01 DMD02 DMD03 DMD04 DMD05 DMD06 DMD07 DMD08 DMD09 DMD10 Tuổi thai 8 8 8 8 8 Chẩn đoán gen SRY (+) (+) (+) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (+) Chẩn đoán siêu âm 16 T (+) (+) (+) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (+) Chọc ối chẩn đoán DMD (+) (-) (+) (-) (-) (+) Qua bảng số liệu nhận thấy 10 trƣờng hợp có trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY trƣờng hợp âm tính với gen SRY Bốn trƣờng hợp âm tính với gen SRY không cần chọc ối để chẩn đốn bệnh Teo Duchenne Cịn trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY đƣợc chọc ối để tiến hành xét nghiệm bệnh Teo Duchenne Đại học Y Hà Nội cho kết 3/6 trƣờng hợp mang bệnh Teo Duchenne, trƣờng hợp không mang gen bệnh thai nhi sinh bình thƣờng  Kết chẩn đốn bất đồng nhóm máu Rh mẹ thai nhi Bảng 3.15: Bảng kết chẩn đốn nhóm máu Rh thai nhi tuần thứ STT Mã bệnh nhân Tuổi mẹ Tuổi thai RH01 Rh02 RH03 RH04 RH05 RH06 RH07 34 26 30 29 35 29 36 8 8 Chẩn đoán Rh Thai (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) RH mẹ (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Chẩn đoán Rh sau sinh (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) 10 11 12 13 RH08 RH09 RH10 RH11 RH12 RH13 32 28 35 26 32 26 8 8 (+) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) Từ kết bảng cho thấy: 13 bệnh nhân nghiên cứu có bệnh nhân mang thai mang nhóm máu Rh(-) , cho thấy khơng có bất đồng nhóm máu mẹ (mẫu Rh4, Rh 11 Rh 12) Có 10 tổng số 13 mẫu nghiên cứu có thai nhi mang nhóm máu Rh(+), 10 mẫu có bất đồng nhóm máu mẹ Các kết đƣợc xác định lại test nhanh nhóm máu Rh sau sinh  Kết thử nghiệm ứng dụng tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể kít Vysis MultiVysion PGT Multicolor probes Mẫu DT02 phân lập tế bào thai 16 tuần tuổi, trƣờng hợp vừa đƣợc chẩn đoán kỹ thuật FISH vừa đƣợc chẩn đoán kỹ thuật QF-PCR sau chọc ối Hình 3.29 Hình ảnh tế bào phơi thai mẫu số DT01 Nhận xét: Hình ảnh kết nhuộm FISH cho mẫu DT cho thấy tín hiệu huỳnh quang bắt màu tốt khơng bị tín hiệu Với NST số 21 xuất tín hiệu màu xanh cây, NST thƣờng khác nhƣ NST số 13 18 xuất tín hiệu chứng tỏ NST bình thƣờng Hai NST giới tính xuất tín hiệu màu vàng NST giới tính Y tín hiệu màu xanh rêu NST X Do vậy, tế bào mang nhiễm sắc thể 47, XY, +21 Kết đƣợc kiểm chứng phƣơng pháp chẩn đoán QF-PCR qua mẫu ối KẾT LUẬN  Chúng chứng minh đƣợc tồn ADN phôi thai tế bào phôi tự lƣu hành máu ngoại vi ngƣời mẹ  Đã xây dựng đƣợc quy trình tách chiết ADN tự ứng dụng sàng lọc bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh sang lọc đƣợc 11 trƣờng hợp có 5/11 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY sang lọc đƣợc 10 bà mẹ mang thai có nguy sinh bị Teo Duchenne, ngồi cịn chẩn đốn đƣợc 10/13 trƣờng hợp bà mẹ mang nhóm máu Rh(-) mang thai có nhóm nhóm máu Rh(+)  Nghiên cứu khảo sát đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự cac tuần tuổi thai từ đến 22 tuần lựa chon đƣợc thời điểm thích hợp cho sang lọc chẩn đoán bệnh di truyền trƣớc sinh vào tuổi thai tuần tuổi  Nghiên cứu đƣợc ADN phôi thai tự tồn thời gian ngắn máu ngoại vi mẹ sau sinh vào khoảng 3h sau sinh  Chúng khảo sát so sánh đƣợc nồng độ AND phôi thai tự trƣờng hợp mang thai bị dị tật cao gấp 4,5 lần so với trƣờng hợp mang thai không bị dị tật KIẾN NGHỊ  Cần nghiên cứu ứng dụng kết sang lọc chẩn đoán nhiều mặt bệnh khác  Mở rộng nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều tế bào phôi thai lƣu hành máu ngoại vi mẹ để tiến tới chẩn đoán đƣợc bệnh di truyền qua máu ngoại vi DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN [1] Triệu Tiến Sang, Nguyễn Duy Bắc, Trần Ngọc Anh, Đặng Tiến Trƣờng (2010), “Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán số hội chứng bất thƣờng nhiễm sắc thể”, Tạp chí y dược học quân sự, vol 35, số 7/2010, tr.41-44 [2] Nguyen Duy Bac, Trieu Tien Sang, Tran Van Khoa (2010), “QF-PCR in the prenatal and postnatal detection of common chromosome aneuploidies”, Revue mesdiccale 2010, tr.22-28 [3] Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa (2012), “Nghiên cứu quy trình chiết tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ, Ứng dụng chẩn đốn trƣớc sinh bệnh di truyền”, Tạp chí y dược học quân sự, vol 37, số tháng 9/2012, tr.35-39 [4] Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (2013), “Phát ADN tự thai nhi huyết tƣơng phụ nữ mang thai kỹ thuật PCR, Ứng dụng chẩn đoán bệnh di truyền trƣớc sinh”, Tạp chí y học Việt Nam, Tập 411, số đặc biệt/2013, tr.212-218 [5] Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đồn Long (2014), “Phát định lƣợng AND phơi thai tự huyết tƣơng ngƣời mẹ phƣơng pháp Realtime-PCR”, Tạp chí y dược học quân sự, vol 39, số tháng 6/2014, tr.45-51 [6] Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (2014), “Tách phân lập tế bào phôi thai máu ngoại vi mẹ ứng dụng chẩn đốn khơng can thiệp”, Tạp chí y dược học quân sự, vol 39, số tháng 8/2014, tr.49-55 [7] Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đồn Long, Nguyễn Duy Bắc (2014), “Ứng dụng phân tích DNA phôi thai tự để sàng lọc di truyền trƣớc sinh”, Tạp chí y học Việt Nam, tập 424, số đặc biệt/2014, tr.130-137 [8] Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (11/2014), “Khảo sát định lƣợng ADN phôi thai tự huyết tƣơng mẹ tuần tuổi thai từ tuần đến 22 tuần phƣơng pháp Realtime-PCR”, Tạp chí y học Việt Nam, tập 424, số đặc biệt/2014, tr.138-146