ĐẦU VÀ CỞ THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DNA EBV TRONG MÁU NGOẠI VI VỚI ĐỢ NHẠY CAO GĨP PHẦN SÀNG LỌC PHÁT HIỆN SỚM HỒ HỮU THỌ1, TRIỆU THỊ NGUYỆT1, ĐỖ TRÂM ANH2, NGUYỄN ĐÌNH ỨNG, ĐINH THỊ THU HẰNG3, BÙI TIẾN SỸ4, HOÀNG ĐÀO CHINH5, LÊ MINH KỲ6, VŨ TRƯỜNG PHONG, NGÔ THANH TÙNG7, NGUYỄN KIM LƯU8, NGUYỄN VĂN BA, HỒ ANH SƠN3, HOÀNG VĂN LƯƠNG3, NGHIÊM ĐỨC THUẬN2 TĨM TẮT Nhóm nghiên cứu thiết lập thành cơng quy trình định lượng DNA EBV máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9% Đối chiếu với kết xét nghiệm nhóm chứng người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu 98% Quy trình kỹ thuật định lượng cf-DNA EBV kiểm định với mẫu chuẩn quốc tế cung cấp Đại học Hồng Kơng Quy trình thiết lập nghiên cứu góp phần sàng lọc phát sớm bệnh ung thư vòm mũi họng SUMMARY Development of ultrasensitive q-pcr assay based on circulating EBV DNA for early detection of nasopharyngeal carcinoma In our study, we have establihed successfully an ultrasensitive qPCR assay for detection cf-EBV DNA Evaluation on clinical samples has proven a remarkably high sensitivity of 96.9% and high specificity of 98% Moreover, we have also validated the performance of the optimal qPCR assay using the international standard panel that was provided by Chinese University of Hong Kong ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) loại ung thư phổ biến số nước Châu Á, có Việt Nam[1,2] Bệnh nhân UTVMH thường chẩn đoán giai đoạn muộn, đồng thời triệu chứng bệnh thường khơng đặc hiệu khó phân biệt với bệnh lý khác vùng lân cận Bên cạnh đó, UTVMH thường có di hạch sớm [3] Hậu nhiều bệnh nhân UTVMH chẩn đoán giai đoạn tiến triển kèm theo di căn, điều trị khó khăn mà hiệu khơng cao UTVMH liên quan mật thiết với nhiễm virus Epstein Barr (EBV), hệ gen virus đã xác định hầu hết tế bào khối UTVMH Triển vọng to lớn DNA-EBV lưu hành máu ngoại vi sàng lọc phát sớm, tiên lượng đánh giá mức độ đáp ứng điều trị UTVMH đã khẳng định qua hàng loạt nghiên cứu giới 15 năm qua Tuy nhiên, vẫn chưa có xét nghiệm DNA-EBV chuẩn hóa sử dụng lâm sàng Tại Việt Nam, quy trình định lượng DNA-EBV có độ nhạy cịn thấp với ngưỡng phát 300 copy/ml huyết tương, nên phát DNA-EBV máu ngoại vi 64%-68% số bệnh nhân UTVMH[4-6] Thực tế đặt yêu cầu cần thiết lập quy trình phát định lượng DNA-EBV máu ngoại vi với độ nhạy cao Labo Nghiên cứu Gen, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân Y Khoa Tai-Mũi-Họng - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân Y Khoa Sinh học Phân tử - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 Khoa Xạ phẫu Xạ trị - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 Trung tâm Ung Bướu phẫu thuật Đầu cổ - Viện Tai-Mũi-Họng Trung Ương Khoa Ung thư Đầu cổ xạ trị - Bệnh viện K Trung tâm Ung Bướu Y học Hạt nhân - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y 74 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM ĐẦU VÀ CỔ nước ta, góp phần sàng lọc phát trường hợp mắc ung thư vòm mũi họng giai đoạn sớm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Mẫu máu ngoại vi chống đông EDTA 32 bệnh nhân chẩn đoán xác định UTVMH dựa vào kết giải phẫu bệnh sinh thiết vịm mũi họng (nhóm bệnh) Mẫu máu ngoại vi chống đông EDTA 105 người khỏe mạnh (nhóm chứng) Các hóa chất dùng tách chiết DNA từ huyết tương bao gồm Kit tách chiết Anapure DNA/RNA Viral Mini Kit, Isopropanol, Ethanol 100% Hóa chất dùng phản ứng Realtime PCR như: Quantitect Probe master mix, Quantitect SYBR master mix, Primer, Probe, DMSO Panel mẫu chuẩn định lượng DNA EBV với giải nồng độ xác định mẫu huyết tương chuẩn dương tính với DNA-EBV Đại học Hồng Kơng, GS Allen Chan chuyển cho nhóm nghiên cứu Máy Roto-Gene Q, Tủ hút thao tác di truyền, máy li tâm, khối ổn nhiệt có lắc, máy vortex, NanoDrop Phản ứng PCR tiến hành hệ thống máy Rotor-Gene Q với thể tích phản ứng 20µl 8,6µl dịch chiết DNA sử dụng làm khuôn Dữ liệu realtime PCR thu thập hệ thống RotorGene Q lưu máy tính sau phân tích phần mềm Rotor-Gene Q Mỗi mẫu chạy 02 lần lặp lại, lần chạy kèm theo chứng âm không chứa khuôn DNA Đường chuẩn thiết lập sử dụng mẫu chuẩn DNA quốc tế Đại học Hồng Kông với dãy nồng độ xác định Giá trị trung bình kết định lượng 02 lần lặp lại sử dụng để tính tốn nồng độ Phương pháp xử lý số liệu Nồng độ DNA-EBV huyết tương tính theo đơn vị số copy/ml huyết tương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết tối ưu quy trình realtime PCR phát DNA-EBV Tiến hành thiết kế primer/probe mô tả phần phương pháp nghiên cứu, primer/probe (III) tiếp tục sử dụng để tối ưu thành phần phản ứng chu trình nhiệt Tối ưu nồng độ mồi Phương pháp nghiên cứu Thu thập bảo quản mẫu Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5ml/lần lấy vào ống chứa chất chống đơng K2 EDTA Trong vịng 6h sau lấy, mẫu máu vận chuyển đến labo, tách huyết tương Tách chiết DNA từ huyết tương DNA huyết tương tách chiết kit Anapure DNA/RNA Viral Mini Kit với quy trình cải tiến góp phần làm tăng độ nhạy phát DNAEBV máu ngoại vi Thiết kế trình tự primer/probe cho phản ứng realtime PCR Trình tự mồi probe thiết kế đánh giá phần mềm Oligo Primer Analysis Software Thiết kế primer/probe cho phản ứng Realtime PCR định lượng DNA-EBV nhắm vào vùng DNA khác gen EBV: EBNA1, LMP1 BamH1-W Các primer/probe đánh giá sơ sử dụng chứng dương DNA tách chiết từ mẫu huyết tương chuẩn Đại học Hồng Kơng Bộ primer/probe có tín hiệu khuếch đại sớm độ đặc hiệu cao lựa chọn để tiếp tục tối ưu thành phần phản ứng chu trình nhiệt Hình Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng qPCR Các phản ứng realtime PCR (0.1Q), (0.2Q), (0.3Q), (0.4Q), (0.5Q) có lượng Khn DNA nồng độ primer 0,1µM, 0,2µM, 0,3µM, 0,4µM 0,5µM Phản ứng (am Q) chứng âm khơng có Khn DNA nồng độ primer 0,2µM Tối ưu nồng độ Probe Realtime PCR định lượng TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 75 ĐẦU VÀ CỞ Hình Tối ưu nồng độ probe cho phản ứng Realtime PCR Các phản ứng realtime PCR (35 0.2-1+), (35 0.1-1), (35 0.05-1) có lượng Khn DNA nồng độ probe 0,2µM, 0,1µM, 0,05µM Phản ứng (35 0.2-1-) chứng âm khơng có Khn DNA nồng độ probe 0,2µM Tối ưu nồng độ DMSO Hình Tối ưu nồng độ DMSO cho phản ứng Realtime PCR Các phản ứng realtime PCR (10%-Q), (7.5%-Q), (5%-Q), (2.5%-Q) có lượng Khn DNA nồng độ DMSO 10%, 7,5%, 5% 2,5% Phản ứng (SS-Q) chứng dương khơng bổ sung DMSO Chu trình nhiệt phản ứng Realtime PCR TT Các bước Nhiệt đợ Thời gian Đơn vị Biến tính ban đầu 95 15 Phút Khuếch đại Biến tính 94 15 Giây Số chu kỳ: 45 Gắn mồi 63 30 Giây Kéo dài 72 30 Giây 25 ∞ Lưu mẫu Nồng độ thành phần phản ứng Realtime PCR tối ưu: STT Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng đợ phản ứng Đơn vị Thể tích phản ứng (µl) Quantitect Probe master mix X 10 Primer III/F 10 0,2 µM 0,4 Primer III/R 10 0,2 µM 0,4 Probe III 10 0,05 µM 0,1 DMSO 100 2,5 % 0,5 Khuôn DNA 8,6 Tởng 20 Kết đánh giá quy trình bợ panel mẫu chuẩn quốc tế 76 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM ĐẦU VÀ CỔ Đồng thời, khả định lượng quy trình realtime PCR tối ưu đánh giá panel mẫu chuẩn quốc tế thu đường chuẩn với hệ số tương quan tuyến tính R2=0.99613 (Hình 5) Như vậy, quy trình realtime PCR tối ưu có tương quan tuyến tính tốt có khả định lượng DNA-EBV với độ tin cậy cao Hình Độ nhạy quy trình panel mẫu chuẩn quốc tế Toàn số mẫu (9/9) panel mẫu chuẩn quốc tế với cho tín hiệu khuếch đại, mẫu chuẩn có nồng độ thấp 25copy/ml Chứng âm khơng có khn DNA khơng cho tín hiệu khuếch đại Kết thí nghiệm cho thấy, quy trình realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm khơng cho tín hiệu khuếch đại) có khả phát mẫu DNA EBV có nồng độ thấp panel mẫu chuẩn quốc tế Kết thí nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát quy trình realtime PCR tối ưu 25 copy/ml huyết tương, tốt nhiều so với nghiên cứu khác nước đã công bố với ngưỡng phát 300 copy/ml[4-6] Hình Đường chuẩn quy trình tối ưu panel mẫu chuẩn quốc tế Tương quan tuyến tính giá trị Ct với log nồng độ DNA-EBV có mẫu khác panel mẫu chuẩn quốc tế từ 25 - 150.000copy/ml Đánh giá hiệu quy trình tối ưu mẫu lâm sàng, góp phần sàng lọc phát sớm UTVMH Hình Độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm định lượng DNA-EBV máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Kết xác định DNA-EBV máu ngoại vi 96,9% số bệnh nhân UTVMH (31/32), độ nhạy xét nghiệm 96,9% Nồng độ TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM DNA-EBV mẫu dương tính nhóm bệnh nhân UTVMH dao động khoảng từ 53copy/ml3,8x105copy/ml 77 ĐẦU VÀ CỞ Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết DNAEBV dương tính 2/105 trường hợp, tương ứng với độ đặc hiệu 98% (103/105) Với trường hợp nhóm chứng khoẻ mạnh dương tính với DNA-EBV, nồng độ DNA-EBV xác định 40copies/ml xét nghiệm lại sau tuần cho kết âm tính, giúp phân biệt với trường hợp dương tính thật Như vậy, quy trình định lượng nồng độ DNAEBV máu ngoại vi đã thiết lập đánh giá panel mẫu chuẩn quốc tế Đại học Hồng Kông với ngưỡng phát 25copy/ml Đồng thời, đánh giá mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu độ nhạy 97% độ đặc hiệu 98% Kết đạt tương đương với công bố giới[7,8,9] KẾT LUẬN Quy trình realtime PCR định lượng DNA EBV với độ nhạy cao (25copy/ml) đã thiết lập thành công nghiên cứu quy trình đã đánh giá chất lượng mẫu chuẩn quốc tế đảm bảo độ tin cậy cao Hiệu sàng lọc chẩn đốn sớm UTVMH nhóm đối tượng nghiên cứu quy trình tối ưu định lượng DNA EBV tự lưu hành máu ngoại vi đạt độ nhạy 96,9% và độ đặc hiệu 98% TÀI LIỆU THAM KHẢO Yu, W.M and S.S Hussain, Incidence of nasopharyngeal carcinoma in Chinese immigrants, compared with Chinese in China and South East Asia: review J Laryngol Otol, 2009 123 (10): p 1067-74 Vokes, E.E., D.N Liebowitz, and R.R Weichselbaum, Nasopharyngeal carcinoma Lancet, 1997 350(9084): p 1087-91 78 Stacey EM, F.R., "The nose, paranasal sinuses, and nasopharynx”, in: Sternberg SS, editor, Diagnostic Surgical Pathology, vol1, 3nd edition Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, 1999 1: p 885-917 Phạm Huy Tần, T.H.T., Trần Thị Thuý Hằng, Nguyễn Đình Phúc, Trần Vân Khánh, Nồng độ EBV-DNA huyết tương bệnh nhân ung thư vòm mũi họng mối tương quan với chẩn đoán giai đoạn TNM (Tumor Nodes Metastasis) Tạp chí nghiên cứu Y học, 2015 95(3): p 24-31 Tú, Đ.V., Đánh giá nồng độ EBV-DNA huyết tương bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn II-III trước sau điều trị Luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội, 2012 Nguyễn Tuyết Mai, Đ.V.T., Mối tương quan nồng độ EBV-DNA huyết tương với kết điều trị ung thư vòm họng giai đoạn II, III bệnh viện K Y học Việt Nam, 2012 1: p 43-46 Lo, Y.M., et al., Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma Cancer Res, 1999 59(6): p 1188-91 Shao, J.Y., et al., Comparison of plasma Epstein-Barr virus (EBV) DNA levels and serum EBV immunoglobulin A/virus capsid antigen antibody titers in patients with nasopharyngeal carcinoma Cancer, 2004 100(6): p 1162-70 Kondo, S., et al., Diagnostic value of serum EBV-DNA quantification and antibody to viral capsid antigen in nasopharyngeal carcinoma patients Cancer Sci, 2004 95(6): p 508-13 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM ... quy trình tối ưu mẫu lâm sàng, góp phần sàng lọc phát sớm UTVMH Hình Độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm định lượng DNA- EBV máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Kết xác định DNA- EBV máu ngoại. .. cứu quy trình đã đánh giá chất lượng mẫu chuẩn quốc tế đảm bảo độ tin cậy cao Hiệu sàng lọc chẩn đoán sớm UTVMH nhóm đối tượng nghiên cứu quy trình tối ưu định lượng DNA EBV tự lưu hành máu ngoại. .. giúp phân biệt với trường hợp dương tính thật Như vậy, quy trình định lượng nồng độ DNAEBV máu ngoại vi đã thiết lập đánh giá panel mẫu chuẩn quốc tế Đại học Hồng Kông với ngưỡng phát 25copy/ml