Bài viết Khảo sát quy trình định lượng men G6PD trong máu khô của trẻ sơ sinh bằng phương pháp huỳnh quang nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ huỳnh quang: nồng độ NADP và G6P, thời gian phản ứng, đồng thời đánh giá độ lặp, xây dựng đường chuẩn và tính toán giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) men G6PD trên giọt máu khô được lấy ở gót chân của trẻ sơ sinh.
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2018 ISBN: 978-604-82-2548-3 KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MEN G6PD TRONG MÁU KHÔ CỦA TRẺ SƠ SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG Trần Khánh Hòa Trường Đại học Thủy lợi, email: hoatk@wru.vn GIỚI THIỆU CHUNG Thiếu men G6PD rối loạn di truyền phổ biến trẻ sơ sinh đột biến cánh dài vùng băng nhiễm sắc thể X (Xq28) Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 2,5% trẻ sơ sinh giới bị thiếu men G6PD với mức độ khác [3] Ở Việt Nam, theo báo cáo Tổng cục Dân số, tỷ lệ trẻ sơ sinh bị thiếu men G6PD khoảng 1,5 – 2,5% trẻ sinh sống tỷ lệ thay đổi theo vùng địa lý nhóm dân tộc [1] Trong chuỗi chuyển hóa pentose phosphate, men G6PD xúc tác phản ứng chuyển hóa nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) thành dạng rút gọn NADPH*, coenzyme quan trọng giúp bảo vệ hồng cầu chống lại tác nhân oxy hóa Khi trẻ bị thiếu men G6PD, hồng cầu dễ bị phá hủy tiếp xúc với chất oxy hóa mạnh băng phiến (long não), đậu tằm (đặc biệt chưa nấu chín) sử dụng số dược phẩm gây thiếu máu tán huyết (vỡ hồng cầu) Tình trạng làm tăng lượng bilirubin máu gây thiếu máu kèm theo vàng da, vàng mắt, mệt mỏi Nếu bị vàng da nặng, tuần đầu sau sinh, trẻ bị tổn thương não gây bại não, chậm phát triển tinh thần vận động Tuy nhiên, phát sớm qua sàng lọc (48 đến 72 sau sinh), theo dõi tình trạng vàng da sơ sinh khuyến cáo không tiếp xúc sử dụng loại thức ăn có chứa chất oxy hóa mạnh, trẻ có sống hồn tồn bình thường Do đó, định lượng men G6PD giọt máu khô lấy gót chân trẻ sơ sinh cách chủ động với chi phí thấp giúp phát sớm để phòng ngừa biến chứng trẻ sơ sinh việc cần thiết, góp phần nâng cao chất lượng dân số PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Định lượng men G6PD mẫu máu khô trẻ sơ sinh phương pháp huỳnh quang dựa phản ứng oxi hóa glucose-6phosphate (G6P) thành 6-phosphogluconate (6PG) nhờ men G6PD mẫu máu khô làm xúc tác, đồng thời NADP chuyển hóa thành chất phát huỳnh quang NADPH*, tỷ lệ với nồng độ men G6PD mẫu Đồng sunphat thêm vào hỗn hợp để làm chậm phản ứng Huỳnh quang đo với bước sóng kích thích 340 nm, bước sóng phát xạ 460 nm [4, 5] * + PD G6P + NADP G 6PG + NADPH + H Các phản ứng nghiên cứu thực dung dịch đệm Tris-HCl 0,5M, [CuSO4 ] = 0,1mM [5] Men G6PD lấy từ mẫu máu khô giấy thấm trẻ sơ sinh không bị thiếu men G6PD Quy trình định lượng G6PD tóm tắt sau [4] (1) – Đục lỗ máu khô giấy thấm để thêm G6PD vào giếng polystyren (2) – Thêm hỗn hợp dung dịch G6P NADP theo tỷ lệ nồng độ: 1: 1,5 (3) – Ủ mẫu để oxi hóa G6P, tạo chất phát huỳnh quang NADPH* (4) – Thêm CuSO4 để dập tắt phản ứng Cu2+ ức chế men G6PD 340 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2018 ISBN: 978-604-82-2548-3 (5) – Đo cường độ huỳnh quang máy G6P = 1,0 mM Cường độ huỳnh quang thu Victor 2D, Perkin Elmer trình bày Bảng Hình Nghiên cứu tiến hành khảo sát yếu tố Bảng Sự phụ thuộc cường độ ảnh hưởng đến cường độ huỳnh quang: nồng huỳnh quang vào thời gian phản ứng (phút) độ NADP G6P, thời gian phản ứng, đồng t (phút) Cường độ t (phút) Cường độ thời đánh giá độ lặp, xây dựng đường chuẩn tính tốn giới hạn phát (LOD), giới 1268 30 5480 hạn định lượng (LOQ) men G6PD giọt 10 2325 40 5501 máu khơ lấy gót chân trẻ sơ sinh 20 3869 45 5545 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ảnh hưởng nồng độ NADP G6P Nồng độ G6P NADP pha với tỷ lệ: 1: 1,5 Để tối ưu hóa nồng độ NADP G6P, nghiên cứu khảo sát nồng độ NADP (mM) khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 Thời gian phản ứng 30 phút [5] Mỗi mẫu đo lặp lại lần cường độ huỳnh quang trung bình trình bày Bảng Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang Hình vào thời gian phản ứng (phút) Bảng Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào nồng độ NADP (mM) NADP 0,5 1,0 1,5 Cường độ 3097 3464 5440 NADP 2,0 2,5 Thời gian phản ứng tăng từ phút đến 30 phút, cường độ huỳnh quang tăng lên Tuy nhiên, tăng thời gian phản ứng lên đến 40, 45 phút cường độ huỳnh quang tăng khơng đáng kể Do đó, 30 phút khoảng thời gian phù hợp cho việc định lượng men G6PD Cường độ 4158 4101 3.3 Khảo sát độ lặp phép phân tích Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào nồng độ NADP Nghiên cứu khảo sát cường độ huỳnh quang 10 giếng với điều kiện tối ưu khảo sát trên: [G6P] = mM; [NADP] = 1,5 mM; thời gian phản ứng 30 phút; [CuSO4 ] = 0,1 mM Men G6PD lấy mẫu máu khô giấy thấm trẻ sơ sinh khơng bị thiếu G6PD Cường độ huỳnh quang trình bày Bảng Kết cho thấy, giếng polystyren với [NADP] = 1,5 mM; [G6P] = mM cho tín hiệu huỳnh quang cao 3.2 Ảnh hưởng thời gian phản ứng Nghiên cứu tiến hành thí nghiệm với khoảng thời gian (phút) khác nhau: 5; 10; 20; 30; 40; 45 cố định [NADP] = 1,5 mM 341 Bảng Cường độ huỳnh quang 10 giếng chuẩn điều kiện tối ưu Giếng Cường độ 5612 6198 5917 4922 5032 Giếng 10 Cường độ 5150 6076 5746 5498 5660 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2018 ISBN: 978-604-82-2548-3 Bảng Cường độ huỳnh quang mẫu trắng Sử dụng Exel 2013, nghiên cứu tính được: Hệ số biến thiên (CV) = 7,3%, nhỏ CV kit IVD cho G6PD [4] Giếng 3.4 Xây dựng đường chuẩn Cường độ 820 953 962 Giếng Cường độ 850 946 892 Đường chuẩn để định lượng G6PD xây dựng dựa điều kiện tối ưu Nồng độ men G6PD trẻ không mắc thiếu men Sử dụng Exel 2013, nghiên cứu tính được: G6PD lớn 2,6 (U/g Hb), nghiên LOD = 1066,4 cứu xây dựng đường chuẩn khoảng LOQ = 1445,8 nồng độ G6PD từ 0,77-10,5 (U/g Hb) Cường KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ độ huỳnh quang ứng với nồng độ G6PD Nghiên cứu bước đầu khảo sát quy trình đưa Bảng Hình định lượng G6PD giọt máu khô lấy Bảng Sự phụ thuộc cường độ gót chân trẻ sơ sinh phương pháp huỳnh quang vào nồng độ G6PD miễn dịch huỳnh quang với điều kiện tối Giếng G6PD (U/g Hb) Huỳnh quang ưu: [G6P] = mM; [NADP] = 1,5 mM; Thời gian phản ứng = 30 phút; [CuSO4] = 0,1 mM 0,77 1151 Xây dựng đường chuẩn định lượng 2,7 3543 men G6PD giọt máu khô lấy gót 4,5 5680 chân trẻ sơ sinh: y = 1094x + 546,91 7,0 8435 Với trẻ sơ sinh, việc lấy mẫu máu (huyết thanh) để định lượng men G6PD 9,0 10362 bảo quản vận chuyển mẫu việc khó 10,5 11832 khăn, đặc biệt vùng xa trung tâm Do đó, kết nghiên cứu sở cho nghiên cứu toàn diện để định lượng men G6PD giọt máu khơ lấy gót chân trẻ sơ sinh cách chủ động (không phụ thuộc vào kit nhập khẩu) giúp nhiều trẻ sơ sinh sàng lọc thiếu men G6PD, đặc biệt trẻ sơ sinh xa trung tâm, nơi có khó khăn việc bảo Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang quản vận chuyển mẫu vào nồng độ G6PD TÀI LIỆU THAM KHẢO Từ đồ thị, phương trình đường chuẩn tuyến tính khoảng nồng độ G6PD từ [1] Kết thực sàng lọc trước sinh sơ sinh đến năm 2010 kế hoạch triển khai 0,77 10,5 U/g Hb, có hệ số tương quan năm 2011, Số (123), 2011, Tạp chí Dân số R2 = 0,9977 thỏa mãn tiêu chuẩn 0,99 R2 Phát triển thu phương trình đường chuẩn [2] Nguyễn Viết Nhân, 2010, Tài liệu hướng có dạng: y = a + bx là: y = 1094x + 546,91 dẫn sàng lọc sơ sinh, Trường Đại học Y Dược Huế [3] Perkin Elmer, 2012, Complete solutions for screening newborns, 1244-1216-12 [4] Perkin Elmer, 2016, Neonatal G6PD, Nghiên cứu tiến hành thực nghiệm với ND-1000 mẫu trắng (không men G6PD làm xúc tác [5] Pointe Scientific, 2009, Glucose-6phản ứng) quy trình phần 3.4 Cường độ Phosphate Dehydrogenase Reagent Set, huỳnh quang trình bày Bảng Rev 12/09 P803-G7583-01 3.5 Tính giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 342 ... toàn diện để định lượng men G6PD giọt máu khô lấy gót chân trẻ sơ sinh cách chủ động (không phụ thuộc vào kit nhập khẩu) giúp nhiều trẻ sơ sinh sàng lọc thiếu men G6PD, đặc biệt trẻ sơ sinh xa trung... đường chuẩn định lượng 2,7 3543 men G6PD giọt máu khơ lấy gót 4,5 5680 chân trẻ sơ sinh: y = 1094x + 546,91 7,0 8435 Với trẻ sơ sinh, việc lấy mẫu máu (huyết thanh) để định lượng men G6PD 9,0 10362... mM Men G6PD lấy mẫu máu khô giấy thấm trẻ sơ sinh không bị thiếu G6PD Cường độ huỳnh quang trình bày Bảng Kết cho thấy, giếng polystyren với [NADP] = 1,5 mM; [G6P] = mM cho tín hiệu huỳnh quang