Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN====== NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER
NỘI DUNG
1.1.1.1.Cây phân loại vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
1.1.1.2 Đặc điểm sinh học của Gluconacetobacter xylinus
G xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng
Vi khuẩn G xylinus thường được tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả và trong đất Chúng có hình dạng trực khuẩn, kích thước khoảng 2 μm, thường đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, và không có khả năng di động Bên ngoài tế bào có một lớp màng nhày bao bọc, trong đó cellulose là thành phần chính Khi thử nghiệm với thuốc thử Iot và acid sunfuric, vi khuẩn sẽ chuyển sang màu xanh Dưới điều kiện thích hợp, G xylinus phát triển mạnh mẽ, nhưng hoạt động của chúng sẽ bị ức chế khi có quá nhiều acid acetic.
Vào năm 1886, A.J Brown đã lần đầu tiên giới thiệu về sự tổng hợp cellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter Tuy nhiên, chỉ đến nửa sau thế kỷ XX, cellulose vi khuẩn mới thu hút sự quan tâm và được nghiên cứu một cách sâu rộng.
Cấu trúc cellulose vi khuẩn :
Cellulose vi khuẩn đựợc cấu tạo bởi chuỗi β-1,4 glucopyranose mạch thẳng đươc tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt trong tự nhiên phải kể đến là
Gluconacetobacter là một loại vi khuẩn có khả năng hình thành lớp màng giống thạch dừa khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và điều kiện tĩnh Lớp màng này thực chất được cấu thành từ các tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose Cellulose trong màng CVK có thành phần hóa học tương tự như cellulose thực vật, nhưng có cấu trúc và đặc tính khác biệt, đồng thời sở hữu khả năng kết tinh cao.
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng nghiên cứu
2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu: cao nấm men
- Thuốc Diclofenac natri dạng tinh khiết và dạng chế phẩm bán trên thị trường
- Vật liệu CVK (99% là nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn
Gluconacetobacter xylinus lên men trong các môi trường dinh dưỡng
- Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihidrophotphat, axit clohidric,… đạt tiêu chuẩn phân tích
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)
- Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ)
- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)
- Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức)
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh)
- Bể rửa siêu âm TCP 280
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu
- Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác
2.1.4 Môi trường lên men thu vật liệu CVK
Vật liệu CVK được tạo lên từ môi trường chuẩn:
Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo vật liệu CVK Thành phần
Thêm dịch giống vào môi trường với tỷ lệ tối thiểu 10% thể tích của môi trường Đảm bảo pH của môi trường được đo và điều chỉnh trong khoảng 4 - 6, vì pH thấp sẽ giúp ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn từ các loại vi khuẩn khác.
- Môi trường được hấp khử trùng ở 113°C trong 15 phút Sau đó cho môi trường khử trùng bằng tia UV trong 15 phút.
- Để nguội và bổ sung vào môi trường 10% dịch giống và 2% acid axetic, lắc đều tay
- Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ
Sau khi ủ tĩnh ở nhiệt độ 28°C trong khoảng thời gian từ 7 đến 14 ngày, màng CVK thô được ngâm trong nước cất trong 2 ngày Tiếp theo, các màng CVK được tinh chế thông qua quy trình rửa nhiều lần, như được minh họa trong hình 2.1.
Hình 2.1 Quy trình tinh chế màng CVK
Trong quá trình nuôi cấy CVK, lớp màng được hình thành có độ dày phụ thuộc vào thời gian lấy màng ra khỏi môi trường; thời gian càng lâu, độ dày của màng càng lớn.
Màng chứa một lượng lớn vi khuẩn với nội độc tố, do đó, cần hấp màng trong dung dịch NaOH 3% ở nhiệt độ 113°C để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố.
+ Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước tới khi màng trắng rồi ép màng Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48h để trung hòa hết NaOH
Ngâm màng trong nước sau khi rửa sạch bằng HCl và ép khô Quá trình ngâm nước kéo dài 48 giờ giúp trung hòa hoàn toàn acid, từ đó thu được CVK tinh chế.
CVK tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90°C, áp suất thường trong khoảng 4 giờ đến khối lượng không đổi, ta được khối lượng CVK tạo thành
Tách màng CVK Ép loại nước Ngâm trong NaOH 3%
48 h, rửa và ép Ngâm trong HCl 3%
48 h, rửa và ép Ngâm trong nước
2.1.5 Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế
Môi trường pH được sử dụng để tiến hành thử nghiệm là 2; 4,5; 6,8; 7,4
Pha 4 dung dịch đệm có pH như trên theo công thức pha chế dung dịch chuẩn độ của Dược điển Việt Nam[14]
Để chuẩn bị dung dịch đệm pH = 2, bạn cần hòa tan 6,57g KCl trong nước, sau đó thêm 119ml dung dịch HCl 0,1M Tiếp theo, bổ sung nước cất đủ để đạt tổng thể tích 1000ml, rồi đo pH và điều chỉnh cho đến khi pH đạt 2 bằng cách sử dụng HCl hoặc NaOH.
Dung dịch đệm pH = 4,5: cho 6,8g kali dihydro phosphate trong 1000ml nước cất, dùng máy đo pH và hiệu chỉnh nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH)
Để chuẩn bị dung dịch đệm pH = 6,8, hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước, đủ để đạt tổng thể tích 1000ml Sau đó, đo pH của dung dịch và điều chỉnh nếu cần thiết bằng H3PO4, KOH hoặc NaOH.
Để chuẩn bị dung dịch đệm pH = 7,4, bạn cần hòa tan 0,6g kali dihydro phosphate, 6,4g dinatri hydrophosphat và 5,85g natri clorid vào nước cất cho đủ 1000ml Sau khi pha chế, hãy đo pH và điều chỉnh nếu cần thiết bằng H3PO4, KOH hoặc NaOH.
Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của loại vật liệu CVK nạp thuốc trong môi trường chuẩn
- Nghiên cứu khoảng thời gian giải phóng thuốc tối ưu của loại vật liệu CVK
- Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm
2.2.1 Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac natri
Nguyên lí: Sử dụng máy UV-2450 (Shimadru - Nhật Bản) đo quang phổ hấp thụ của diclofenac ở các nồng độ khác nhau với bước sóng 278 nm
Để xây dựng đường chuẩn cho diclofenac, cần chuẩn bị các mẫu với nồng độ 10%, 20%, 40%, 60%, 80% và 100% trong dung môi Methanol, với mẫu trắng là dung môi Methanol Sử dụng phần mềm Excel 2010 để dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn cho diclofenac Để đảm bảo độ chính xác và tin cậy, tiến hành pha dung dịch chuẩn ba lần và đo quang phổ ba lần để lấy giá trị trung bình, từ đó xây dựng đường chuẩn cho thuốc.
Bảng 2.2 Bảng xây dựng đường chuẩn Giá trị OD 276 nm (n=3)
STT Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3
Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn của Diclofenac OD278nm
2.2.2 Tạo vật liệu BC nạp thuốc
Màng CVK nạp thuốc được tiến hành thử nghiệm trên 2 loại màng
- Mẫu 1 Dùng màng CVK có độ dày 0.5cm
- Mẫu 2 Dùng màng CVK có độ dày 1cm
Màng CVK sau khi được tinh chế và sấy khô 50% sẽ được giữ nguyên một nửa số màng Sau đó, cho vào bình tam giác thủy tinh chứa 100 ml dung dịch Diclofenac.
Xác định lượng Diclofenac trong BC đã nạp thuốc bằng máy quang phổ UV
Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 1,5h và 2h, tiến hành rút mẫu và sử dụng máy đo quang hổ UV Vis để đo giá trị OD của từng mẫu Để đảm bảo độ chính xác cao, mỗi mẫu được đo 3 lần.
Dựa trên giá trị OD trung bình, chúng ta thay vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ Diclofenac Để tính toán lượng thuốc hấp thụ qua màng, cần áp dụng công thức phù hợp.
Trong đó: mht: Lượng thuốc hấp thụ vào màng; mtrước: Khối lượng thuốc ban đầu; msau: Khối lượng thuốc còn lại trong dung môi
- Tỉ lệ % Diclofenac được hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn được tính theo công thức:
EE: Là phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng (%)
Qt: Là lượng thuốc lý thuyết (mg)
Qd: Là lượng thuốc còn lại (mg)
2.2.3 Nghiên cứu sự giải phóng thuốc từ vật liệu CVK nạp thuốc
Cho màng CVK ở trạng thái ép và giữ nguyên đã hấp thụ Diclofenac với độ dày màng 0,5 và 1cm vào bình chứa 900ml môi trường có pH tương ứng là 2,0.
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ là 37 độ C
Sau 0,5h, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ
Mỗi lần lấy mẫu, chúng ta rút ra 5ml và bổ sung 5ml dung dịch đệm tương ứng Để đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy, thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả trung bình được tính toán.
- Tỉ lệ giải phóng Diclofenac từ màng BC được tính theo công thức (3):
R : Tỉ lệ giải phóng thuốc (%)
Nồng độ Diclofenac trong dung dịch tại thời điểm t được xác định dựa trên thể tích dung dịch đệm ở các giá trị pH khác nhau, với n là số lượng mẫu được lấy ra từ dịch giải phóng.
V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào
2.2.4 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Trong bài nghiên cứu sử dụng phần mềm Excel 2010, các số liệu được thể hiện dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn Số trung bình cộng phản ánh giá trị trung bình của các lần thí nghiệm lặp lại Sự khác biệt giữa các nhóm được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ hơn 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thu màng CVK
3.1.1 Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn
Khi nuôi cấy G xylinus, vi khuẩn này sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường để sinh trưởng và phát triển Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, màng CVK thu được sẽ có độ dày khác nhau Thông thường, sau hơn 1 tuần, màng đạt độ dày khoảng 0,5 cm, và sau 2 tuần, độ dày này sẽ tăng lên 1 cm.
Hình 3.1 Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong MTC sau 7 ngày
3.1.2 Màng CVK nạp thuốc Diclofenac natri
Màng CVK được làm sạch và sấy ở nhiệt độ yêu cầu trong 4 giờ để loại bỏ nước, sau đó được cho vào các bình tam giác chứa 100 ml dung dịch Diclofenac 5% Các bình này được đặt vào bể rung siêu âm ở nhiệt độ 37 độ C.
Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 1,5h, 2h lấy dung dịch ra và tiến hành đo
OD nhờ máy đo quang phổ UV 245 để xác định có bao nhiêu mg thuốc Diclofenac được màng hấp thụ
Theo dữ liệu thu được, giá trị OD trung bình của dung dịch thuốc có xu hướng giảm dần theo thời gian khảo sát Ở hai độ dày màng được nghiên cứu, giá trị này gần như không thay đổi sau 2 giờ Lượng thuốc Diclofenac hấp thụ vào màng tăng dần qua các khoảng thời gian và đạt cực đại sau 2 giờ.
Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng với các độ dày khác nhau trong 2 giờ được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.1 Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng
Khối lượng thuốc hấp thụ (mg)
Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng ra khỏi màng CVK
Sử dụng 4 loại đệm đã pha, mỗi bình chứa 900ml dung dịch đệm, sau đó cho các màng đã hấp thụ thuốc vào từng bình Dùng máy khuấy từ gia nhiệt với tốc độ 50 vòng/phút và nhiệt độ 37 độ C.
Sau lần lượt các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 1h, 12h, 24h rút mỗi mẫu 5ml ra đo quang phổ, đồng thời bổ sung 5ml dung dịch đệm tương tự
Hình 3.2 Màng được cho vào dung dịch đệm và dùng máy khuấy từ gia nhiệt
Hình 3.3 Mẫu được rút ra để đo OD sau các khoảng thời gian
Kết quả mật độ quang thu được thể hiện trong bảng 3.2; 3.3 và hình 3.4; 3.5
Bảng 3.2 Gía trị OD thu được tại các thời điểm khảo sát tiến hành trên màng giữ nguyên với 4 loại môi trường khi giải phóng thuốc Diclofenac pH
Thời gian(h) Độ dày màng
Gía trị OD theo thời gian
Bảng 3.3 Gía trị OD thu được tại các thời điểm khảo sát tiến hành trên màng ép 50 % với 4 loại môi trường khi giải phóng thuốc Diclofenac pH
Thời gian (h) Độ dày màng
Gía trị OD theo thời gian
Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện sự khác nhau về mật độ quang của lượng thuốc được giải phóng ở 2 loại màng giữ nguyên khác nhau trong 4 môi trường khảo sát
Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện sự khác nhau về mật độ quang của lượng thuốc được giải phóng ở 2 loại màng ép 50% khác nhau trong 4 môi trường khảo sát
Dựa trên các giá trị OD (y) trung bình từ bảng 3.2 và 3.3 của thuốc Diclofenac, quá trình giải phóng từ màng CVK – Diclofenac cho phép tính toán nồng độ Diclofenac tại từng thời điểm bằng cách sử dụng phương trình (1) và (2) Sau khi thay thế giá trị nồng độ vừa tính vào công thức (3), chúng ta có thể xác định tỷ lệ giải phóng thuốc Diclofenac từ màng CVK – Diclofenac trong các điều kiện độ dày, thời gian và môi trường pH khác nhau, như thể hiện trong bảng 3.4 và 3.5.
0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 pH= 2 0,5cm pH= 2 1cm pH= 4,5 0,5cm pH=4,5 1cm pH= 6,8 0,5cm pH= 6,8 1cm pH= 7,4 0,5cm pH= 7,4 1cm
0.5 1 2 4 6 8 10 12 24 pH= 2 0,5cm pH= 2 1cm pH= 4,5 0,5cm pH=4,5 1cm pH= 6,8 0,5cm pH= 6,8 1cm pH= 7,4 0,5cm pH= 7,4 1cm
Bảng 3.4: Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) của các màng giữ nguyên ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3)
Tỷ lệ giải phóng thuốc theo thời gian pH
Thời gian(h) Độ dày màng
Bảng 3.5 Tỉ lệ giải phóng thuốc (%) của các màng ép 50% ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n = 3) pH
Thời gian (h) Độ dày màng
Tỷ lệ giải phóng thuốc theo thời gian
Từ số liệu của bảng 3.4 và 3.5 cho thấy khả năng giải phóng thuốc của mỗi loại màng ở mỗi loại môi trường ở các khoảng thời gian là khác nhau
Tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac từ màng CVK có xu hướng tăng theo thời gian, với pH = 6,8 cho kết quả tốt nhất so với các pH khác Ở pH = 2, màng không ép dày 0,5cm giải phóng 17,98% thuốc sau 24 giờ, trong khi màng ép 50% đạt 16,98% Màng dày 1cm cũng cho kết quả cao hơn, với 18,33% cho màng không ép và 17,81% cho màng ép 50% Tương tự, ở pH = 4,5, màng không ép dày 0,5cm đạt 17,98%, trong khi màng 1cm không ép đạt 18,81%, cho thấy màng không ép luôn có tỉ lệ giải phóng cao hơn và màng dày 1cm có khả năng giải phóng thuốc tốt hơn so với màng 0,5cm.
Ở pH = 6,8, màng CVK dày 0,5cm cho tỷ lệ giải phóng thuốc cao nhất là 19,58% sau 24 giờ đối với màng không ép và 18,02% đối với màng ép 50% Trong khi đó, màng dày 1cm đạt tỷ lệ giải phóng cực đại là 19,78% cho màng không ép và 19,31% cho màng ép 50% Như vậy, ở pH = 6,8, màng không ép có tỷ lệ giải phóng cao hơn, và màng CVK dày 1cm có khả năng giải phóng thuốc tốt hơn so với màng 0,5cm.
Tương tự ở pH = 7,4 màng không ép có tỉ lệ giải phóng cao hơn, màng CVK 1cm có khả năng giải phóng thuốc tốt hơn màng 0,5cm
Khi so sánh các giá trị tỉ lệ trung bình bằng công cụ phân tích dữ liệu với mức ý nghĩa α = 0.05, kết quả cho thấy P < 0.05, điều này cho thấy sự khác biệt về tỉ lệ giải phóng thuốc sau 24 giờ giữa hai loại màng là có ý nghĩa thống kê Cụ thể, tại pH = 6,8, màng CVK 1cm có khả năng giải phóng thuốc tốt hơn so với màng CVK 0,5cm Ngoài ra, tại pH = 6,8, tỉ lệ thuốc Diclofenac giải phóng từ màng CVK đạt giá trị cao nhất.
Màng CVK đóng vai trò quan trọng trong hệ thống vận tải thuốc Diclofenac, giúp ngăn chặn thuốc tan nhanh trong môi trường axit của dạ dày Nếu không có màng này, sinh khả dụng của Diclofenac chỉ đạt 50-60% và thời gian bán thải là 3-6 giờ Sử dụng màng BC trong hệ thống giải phóng thuốc qua đường uống sẽ kéo dài thời gian giải phóng, từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng thuốc.