Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sulfate tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn

Trang 1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== TRẦN THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN ======

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Hà Nội, 2019

Khóa luận tốt nghiệp đại học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN ======

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS

Hà Thị Minh Tâm - người đã ở bên động viên và hướng dẫn em rất nhiều trong thời gian vừa qua

Em cũng xin chân thành cảm ơn các giảng viên thuộc Khoa Sinh - KTNN và các thầy, cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã cung cấp cho em nhiều kiến thức cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp

đỡ em để em có thể hoàn thành khóa luận này

Và cuối cùng, không thể thiếu em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới cha mẹ, người thân và bạn bè - những người đã luôn ở bên cạnh chia

sẻ, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực nghiệm khóa luận

Đây là lần đầu tiên em được tham gia nghiên cứu khoa học nên không thể tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót Vì vậy, em rất mong sẽ nhận được những góp ý chân thành của quý thầy, cô và bạn bè để khóa luận tốt nghiệp của

em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Ánh

Khóa luận tốt nghiệp đại học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc

của vật liệu cellulose nạp Neomycin Sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn” do chính tôi viết Các số liệu

trong kết quả nghiên cứu là hoàn toàn khách quan, do chính tôi thực nghiệm

mà có được và không trùng lặp với các kết quả đã công bố Những trích dẫn

từ các công bố trước đã có ghi chú rõ ràng

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Vật liệu cellulose (VLC) và vi sinh vật tổng hợp vật liệu cellulose 4

1.1.1.Vật liệu cellulose (VLC) 4

1.1.2 Vi sinh vật tổng hợp VLC 6

1.1.3 Môi trường nuôi cấy G xylinus 7

1.2 Tổng quan về thuốc Neomycin Sulfate (NS) 9

1.2.1 Công thức cấu tạo 9

1.2.2 Tính chất lý hóa 10

1.2.3 Dược lý và dược động học 10

1.2.4 Chỉ định và chống chỉ định 11

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 12

1.3.1 Vật liệu cellulose (VLC) 12

1.3.2 Thuốc Neomycin Sulfate 13

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu nghiên cứu 14

2.1.1 Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

2.1.3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC 14

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Chuẩn bị VLC 14

2.2.2 Chế tạo VLC nạp thuốc NS 17

2.2.3 Xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế 19

2.2.4 Xử lý thống kê 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Thu VLC thô và tinh chế VLC 21

3.1.1 Thu VLC thô 21

3.1.2 Tinh chế VLC 21

3.2 Xác định lượng thuốc NS nạp vào VLC 23

3.3 Xác định tỉ lệ thuốc NS giải phóng từ các hệ thống đã thiết kế 23

3.3.1 Mật độ quang của NS khi tiến hành giải phóng thuốc từ các hệ thống đã thiết kế 23

3.3.2 Tỉ lệ giải phóng NS của VLC ở các hệ thống đã thiết kế 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ứng dụng của VLC 5

Bảng 1.2 Thành phần của các môi trường nuôi cấy thu VLC 8

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men 8

Bảng 2.1 Thành phần môi trường chuẩn tạo VLC 15

Bảng 2.2 Môi trường đệm pH = 7,4 17

Bảng 2.3 Mật độ quang của dung dịch NS ở các nồng độ (n = 3) 18

Bảng 3.1 Lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC (n = 3) 23

Bảng 3.2 Mật độ quang phổ khi tiến hành giải phóng thuốc từ các hệ thống đã thiết kế (n = 3) 25

Bảng 3.3 Tỉ lệ giải phóng thuốc NS từ VLC ở các hệ thống đã thiết kế (n=3) 26 Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của VLC 4

Hình 1.2 Cấu trúc sợi cellulose của VLC 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của NS 10

Hình 2.1 Quy trình tinh chế VLC 16

Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn của NS trong môi trường pH = 7,4 18

Hình 3.1 VLC thô lên men từ môi trường chuẩn 21

Hình 3.2 VLC sau khi tinh chế 22

Hình 3.3 Thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của protein trong màng 22

Hình 3.4 Hiệu chỉnh pH 23

Hình 3.5 Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37 ± 0,50C 24

Hình 3.6 Các mẫu được rút ra để đo quang phổ 24

Hình 3.7 Giá trị OD trung bình giải phóng thuốc NS của VLC 25 Hình 3.8 Tỷ lệ giải phóng thuốc NS của VLC 27 Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trong nhiều năm trở lại đây, các nhà nghiên cứu đã đặc biệt quan tâm tới việc ứng dụng các vật liệu sinh học trong đời sống, nhất là trong chăm sóc sức khỏe Trong đó được quan tâm và chú trọng hơn cả đó là vật liệu cellulose (VLC)

Vật liệu cellulose (VLC) là sản phẩm do vi khuẩn tổng hợp ra, ví dụ

như chủng Gluconacetobacter xylinus (G xylinus) Chúng gồm các phân tử

glucose liên kết với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucorit (rất giống với cellulose của thực vật), tuy nhiên, VLC không chứa các hợp chất cao phân tử như peptin, hemicellulose, ligin và sáp nến Vì thế, ngoài độ dẻo dai, bền chắc, độ đàn hồi cao, khả năng chịu nhiệt tốt, chúng còn có những đặc tính vượt trội như: độ tinh khiết cao, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và có thể phục hồi, tái chế hay phân hủy hoàn toàn Trong y học, chúng được quan tâm

vì có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thường, không độc, không gây dị ứng

và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4, 6] Ngoài ra VLC còn có tác dụng giữ thuốc và kéo dài thời gian giải phóng thuốc Do vậy, VLC được coi là một hướng đi mới trên con đường tìm ra những nguồn nguyên liệu mới hiện nay

Trên thế giới, VLC đã ứng dụng rộng rãi trong cuộc sống, ví dụ như: dùng VLC làm thực phẩm, màng lọc nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho pin và năng lượng cho tế bào và còn có thể làm môi trường cơ chất trong sinh học, [13] Đặc biệt trong y học, VLC được dùng làm chất bọc ngoài và vật liệu vận tải thuốc được sử dụng ngoài da, làm da tạm thời trong quá trình điều trị loét da, trị bỏng và còn làm mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim mạch Và trong lĩnh vực làm đẹp, VLC còn được dùng làm mặt nạ dưỡng da cho con người [8, 13]

Ở Việt Nam, việc dùng VLC trong nghiên cứu và ứng dụng còn chưa phổ biến Các nghiên cứu ứng dụng chỉ mới dừng lại ở những bước đầu, chưa

đi sâu vào các bước tiếp theo

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng có thể nuôi cấy thu VLC từ nhiều loại môi trường Tuy nhiên, trên thế giới, VLC lên men từ môi trường chuẩn được Khóa luận tốt nghiệp đại học

sử dụng phổ biến hơn cả do chúng có độ bền cao hơn VLC lên men từ các môi trường khác

Neomycin Sulfate (NS) là một loại thuốc kháng sinh được sử dụng nhằm hạn chế nguy cơ nhiễm trùng trong quá trình phẫu thuật ruột và có thể làm giảm các triệu chứng của hôn mê gan Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây lại chỉ ra rằng NS có nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng như thay đổi tâm trạng, chán ăn, hô hấp yếu, gặp vấn đề về thị giác thậm chí gây co giật Ngoài ra, NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa bình thường Phần hấp thụ nhỏ được phân bố nhanh trong các mô và được bài tiết qua thận để phù hợp với mức độ chức năng thận Phần không được hấp thụ của thuốc (khoảng 97%) được loại

bỏ không thay đổi trong phân

Từ kết quả tạo ra được VLC trên việc nuôi cấy loài vi khuẩn thuộc

chủng G xylinus có thể chế tạo màng sinh học nạp thuốc Neomycin Sulfate

để khảo sát sự giải phóng thuốc qua màng nhằm tăng khả năng và thời gian giải phóng từ đó tăng sinh khả dụng của thuốc Tôi quyết định chọn đề tài

nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose

nạp Neomycin Sulfate tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong

môi trường chuẩn”

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2 Mục đích nghiên cứu

- Tạo VLC lên men từ môi trường chuẩn nạp NS

- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc của VLC nạp NS ở các độ dày màng và pH môi trường khác nhau Đánh giá khả năng giải phóng thuốc trong các trường hợp đó rồi từ đó định hướng khả năng giải phóng thuốc trong cơ thể

3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Hệ thống giải phóng thuốc của VLC nạp NS

tạo ra từ G xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn

- Phạm vi nghiên cứu: Trong quy mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

* Ý nghĩa khoa học

- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng giải phóng thuốc tại chỗ của VLC Nghiên cứu sự giải phóng NS từ VLC nạp thuốc có thể khắc phục được hạn chế của thuốc, tăng hiệu quả cho việc điều trị các bệnh lý

- Đánh giá tiềm năng của VLC nạp NS để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu trên các loại thuốc khác

* Ý nghĩa thực tiễn

- Sử dụng VLC làm vật liệu nạp và giải phóng thuốc định hướng khắc phục những hạn chế của NS dạng thương mại trong điều trị bệnh

- Định hướng tăng sinh khả dụng thuốc NS

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Hình 1.1 Cấu trúc của VLC

Quan sát VLC trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) loại FE – SEM S4800 HITACHI với độ phân giải 1 nm cho thấy màng có các sợi cellulose rất nhỏ, mảnh, đồng nhất, liên kết chặt chẽ với nhau thể hiện ở Hình 1.2 [7]

Hình 1.2 Cấu trúc sợi cellulose của VLC

1.1.1.2 Đặc tính của VLC

Khóa luận tốt nghiệp đại học

VLC xuất hiện thành một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng Khi được đem đi làm khô, chúng có dạng bản mỏng với độ dày khoảng 0,01 – 0,5 nm giống như giấy da

VLC còn có những đặc tính nổi trội như: Trọng lượng nhẹ với độ tinh sạch cao, độ bền cơ học lớn (độ bền dai và chịu được lực kéo cao), có khả năng chịu nhiệt tốt và khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm (60 - 700 lần trọng lượng) Chúng còn có khả năng tương thích sinh học cao, có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc, không gây dị ứng và đặc biệt là có khả năng cản khuẩn

1.1.1.3 Ứng dụng của VLC

VLC được ứng dụng rất nhiều trong đời sống [13], cụ thể như sau:

Bảng 1.1 Ứng dụng của VLC

Thực phẩm - Vỏ bao xúc xích, thịt nhân tạo

- Thạch dừa, kem, salad

Y dược - Da nhân tạo, lớp màng trị bỏng

- Phẫu thuật ghép mô, cơ quan Làm đẹp Móng nhân tạo, mặt nạ đẹp da

Môi trường - Miếng hấp thu chất độc

- Miếng thu hồi dầu

Trang phục Quần áo, giày dép tự phân hủy

Thể thao Lều lắp ráp

Khóa luận tốt nghiệp đại học

VLC có thể được tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật, trong đó chủng G

xylinus được tập trung nghiên cứu nhiều nhất vì: Khả năng sản xuất sinh khối

cao, VLC tạo ra có cấu trúc phù hợp cho các mục đích sử dụng…

1.1.2.1 Gluconacetobacter xylinus (G xylinus)

G xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic Là vi khuẩn có chu mao, hiếu

khí bắt buộc và sản xuất cellulose ngoại bào [8]

1.1.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn G xylinus

G xylinus thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không di động và không sinh

bào tử

G xylinus có dạng hình que, kích thước ngang khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài

khoảng 2 - 3 µm, thẳng hay hơi cong, sắp xếp riêng rẽ và đôi khi xếp thành chuỗi Khi điều kiện môi trường nuôi cấy thay đổi hoặc tế bào già thì hình dạng của chúng có thể bị biến đổi: tế bào phình to ra, dài hơn, phân nhánh Khóa luận tốt nghiệp đại học

hoặc không phân nhánh [8]

1.1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G xylinus

- G xylinus là loài vi khuẩn hiếu khí

- Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 25 – 300C, thích hợp nhất

là 250C và ở 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn

- G xylinus tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ưu là 5,5

G xylinus có thể lấy nguồn cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy

thuộc vào từng chủng Ví dụ chủng G xylinus BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất, chủng G xylinus IFO 13693 lại sử dụng glucose hiệu quả hơn… Trong quá trình sinh trưởng, G xylinus chuyển hóa glucose thành acid gluconic, đây

chính là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị

Ngoài ra, vì G xylinus có thể sinh trưởng trong điều kiện pH thấp nên

để tránh bị nhiễm các loài vi khuẩn lạ, trong quá trình nuôi cấy người ta thường bổ sung thêm acid citric hay acid acetic [8]

1.1.3 Môi trường nuôi cấy G xylinus

Môi trường được dùng để nuôi cấy G xylinus là môi trường tổng hợp

gồm các nguồn dinh dưỡng cần thiết như carbon, nito, phospho, sulfur, các nguyên tố vi lượng và có thể có các yếu tố tăng trưởng

G xylinus có thể lấy nguồn cacbon từ nhiều loại đường khác nhau nên

có thể sẽ là một giải pháp tốt nếu chúng ta có thể sử dụng các vật liệu thừa của các ngành công nghiệp như: nước vo gạo, rỉ đường, nước mía, nước dừa

già, làm nguyên liệu để nuôi cấy G xylinus

- Một số môi trường nuôi cấy vi khuẩn G xylinus tạo VLC được thể

hiện ở Bảng 1.2 [10]

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Bảng 1.2 Thành phần của các môi trường nuôi cấy thu VLC

Thành phần dinh dưỡng của CNM [18], được thể hiện ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của cao nấm men

1.2 Tổng quan về thuốc Neomycin Sulfate (NS)

Neomycin Sulfate là dạng muối sulfat của neomycin, một kháng sinh

nhóm aminoglycoside phổ rộng có nguồn gốc từ Streptomyces fradiae

Neomycin Sulfate có hoạt tính kháng khuẩn [1]

1.2.1 Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C23H52N6O25S3 (C23H46N6O13.3H2SO4)

- Khối lượng phân tử: 908.866 g/mol

- Tên quốc tế: Neomycin Sulfate

Tên IUPAC: (2 R, 3 S, 4 R, 5 R, 6 R) 5 amino 2 (aminomethyl) 6 [(1 R, 2 R, 3 S, 4 R, 6 S) - 4, 6 - diamino - 2 - [(2 S, 3 R, 4 S, 5 R) - 4 -[(2 R,

-3 R, 4 R, 5 S, 6 S) - -3 - amino - 6 - (aminomethyl) - 4, 5 - dihydroxyoxan - 2 - yl] oxy - 3 - hydroxy - 5 - (hydroxymethyl) oxolan - 2 - yl] oxy - 3 -

hydroxycyclohexyl] oxyoxane - 3, 4 - diol; sulfuric acid

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Neomycin Sulfate (NS) [12]

1.2.2 Tính chất lý hóa

NS là bột màu trắng, hút ẩm, dễ tan trong nước, rất khó tan trong

ethanol 96% và thực tế không tan trong aceton [1, 15]

Quang phổ hấp thụ tối đa ở bước sóng 277 nm Muốn định tính NS có trong các chế phẩm (dung dịch nhỏ mắt, thuốc mỡ, thuốc tiêm, ) ta có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [14]

1.2.3 Dược lý và dược động học

* Dược lý

NS là chất diệt khuẩn và hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp protein trong các tế bào vi khuẩn nhạy cảm Nó có hiệu quả chủ yếu chống lại trực khuẩn gram âm nhưng có một số hoạt động chống lại các sinh vật gram

dương Ví dụ như: E coli, Klebsiella, Neisseria,

Neomycin là một phức hợp kháng sinh gồm 3 thành phần: hai thành phần đồng phân B và C là các thành phần hoạt tính và neomycin A là thành phần phụ Neomycin không thể đảo ngược liên kết với protein 16S rRNA và S12 của tiểu đơn vị 30S ribosomal của vi khuẩn Kết quả là tác nhân này cản trở việc lắp ráp phức hợp khởi đầu giữa mRNA và ribosome của vi khuẩn, do

đó, ức chế sự khởi đầu tổng hợp protein Ngoài ra, neomycin gây ra sự hiểu Khóa luận tốt nghiệp đại học

lầm của mẫu mRNA và gây ra sự chuyển đổi khung hình, do đó, dẫn đến kết thúc sớm Cuối cùng, điều này dẫn đến tế bào vi khuẩn bị chết đi [22]

* Dược động học

NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa bình thường (3%) Phần nhỏ hấp thu được phân phối nhanh chóng trong các mô và được đào thải qua thận phù hợp với mức độ của chức năng thận Phần không được hấp thụ của thuốc (khoảng 97%) được loại bỏ trong phân

Các nghiên cứu liên kết với protein đã chỉ ra rằng mức độ gắn kết với protein aminoglycoside thấp và tùy thuộc vào các phương pháp được sử dụng

để thử nghiệm, điều này có thể nằm trong khoảng từ 0% đến 30%

Sự tăng trưởng của hầu hết các vi khuẩn đường ruột bị ức chế nhanh chóng sau khi uống NS và sự ức chế này kéo dài trong 48 - 72 giờ

Sự giải phóng NS gắn mô xảy ra chậm trong khoảng thời gian vài tuần sau khi ngừng dùng thuốc [21]

1.2.4 Chỉ định và chống chỉ định

* Chỉ định

NS được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt

do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1]

Dùng uống để sát khuẩn đường ruột trước khi phẫu thuật, điều trị ỉa chảy

do E Coli và hỗ trợ trong điều trị hôn mê gan do làm giảm vi khuẩn tạo NH3 trong ruột [2]