Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo từ glconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN --- TRẦN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO TỪ GLUCONACETOBACTER X

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

TRẦN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO TỪ

GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI

TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

TRẦN THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI

TẠO TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY

TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Sinh lý học người và động vật

Em xin gửi lời cảm ơn Th.S Phạm Thị Kim Dung, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong khoa Sinh-KTNN cùng các thầy cô ở Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng-Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè thân yêu đã chăm sóc và khích lệ em trong thời gian nghiên cứu

Bài khóa luận tốt nghiệp của em còn rất nhiều thiếu sót, em rất mong nhận được sự đóng góp, nhận xét, góp ý của quý thầy, cô và các bạn để bài khóa luận của em hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 20 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Hường

Khóa luận tốt nghiệp đại học

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận tốt nghiệp với đề tài:

“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo” đều là sự thật, là kết quả nghiên cứu của cá nhân em, không sao chép,

không trùng lặp với bất kì đề tài nào Trong quá trình viết luận văn tốt nghiệp

em có tham khảo, trích dẫn một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, dưới sự hướng dẫn của Th.S Phạm Thị Kim Dung

Nếu đề tài có vấn đề gì em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, Ngày 20 Tháng 05 Năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Hường

Khóa luận tốt nghiệp đại học

5 VNCKH&UD Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

5 Tính mới của đề tài 3

PHẦN NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 4

1.1.1 Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus 4 1.1.2 Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri 5

1.1.2.1 Công thức hoá học 5

1.1.2.2 Tính chất hóa lý 5

1.1.2.3 Độ ổn định 5

1.1.2.4 Hấp thụ 6

1.1.2.5 Tác dụng và chỉ định 6

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 6

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7

2.1 Đối tượng 7

2.1.1 Đối tượng 7

2.1.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 7

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 8

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2.1.3.1 Thiết bị 8

2.2 Phạm vi nghiên cứu 9

2.3 Phương pháp nghiên cứu 9

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 9

2.3.2 Chuẩn bị màng BC 9

2.3.3 Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC 11

2.3.4 Phương pháp dựng đường chuẩn 11

2.3.5 Tạo VLC nạp Diclofenac Natri 14

2.3.6 Pha dung dịch đệm 14

2.3.7 Xác định lượng thuốc giải phóng của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 15

2.3.8 Phương pháp thống kê và xử lí số liệu 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17

3.1 Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 17

3.2 Màng tinh chế 18

3.3 Vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri 18

3.4 Xác định lượng thuốc Diclofenac natri được giải phóng ra khỏi màng 18

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 7

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 8

Bảng 2.3 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 8

Bảng 2.4 Tạo VLC trong môi trường nuôi cấy nước vo gạo 10

Bảng 2.5 Mật độ quang_OD, của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm 13

Bảng 3.1 Kết quả thu VLC 17

Bảng 3.2 Giá tri OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC chưa ép nước 20

Bảng 3.3 Giá trị OD khi tiến hành giải phóng thuốc Diclofenac Natri tại các thời điểm khác nhau của VLC ép 50% nước 21 Bảng 3.4: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép nước ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3) 24 Bảng 3.5: Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép 50% nước ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau(%) (n=3) 25

Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri 5

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô 10

Hình 2.2 Sơ đồ chu trình tinh chế VLC 11

Hình 2.3 Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm 13

Hình 2.4 Pha dung dịch đệm 15

Hình 2.5 Máy khuấy từ ra nhiệt ở trong tủ ấm 16

Hình 3.1 Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo 17

Hình 3.2 Rung siêu âm 18

Hình 3.3 Máy xác định lượng thuốc giải phóng 19

Hình 3.4 Mẫu rút ra để đo quang phổ 19

Hình 3.5 Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm chưa ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 22

Hình 3.6 Biểu đồ so sánh mật độ quang phổ của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm ép nước trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 22

Hình 3.7 Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các thời điểm khác nhau đối với màng gạo chưa ép nước( % ) (n=3) 26

Hình 3.8 Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau trong các thời điểm khác nhau đối với màng gạo ép 50% nước( % ) (n=3) 27

Hình 3.9 Tỉ lệ giải phóng thuốc tại các nồng độ pH khác nhau thời điểm 24 giờ đối với màng chưa ép và màng ép 50% nước (% ) (n=3) 28

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Việc nghiên cứu và ứng dụng VLC trong nước đang được quan tâm và

đã có được một số thành tựu nhất định VLC có tẩm dầu mù u được thử nghiệm trên thỏ gây bỏng làm màng trị bỏng giúp vết thương mau lành và ngăn sự nhiễm trùng đó là kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Y Dược

TP Hồ Chí Minh Ngoài ra, VLC còn được ứng dụng trong: phẫu thuật, ghép

mô, cơ quan [9]

Diclofenac là dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá trình viêm Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh [5]

Diclofenac Natri được đánh giá là có tác động giảm đau mạnh trong những cơn đau từ trung bình cho đến trầm trọng, khi viêm do chấn thương, do can thiệp phẫu thuật, thuốc nhanh chóng làm giảm chứng đau tự nhiên, đau do vận động, và giảm phù nề do viêm và phù nề ở vết thương [5]

Tuy nhiên, khi dùng Diclofenac Natri cũng gây các tác dụng không mong muốn như đau đầu, đau vùng thượng vị, chán ăn, khó tiêu, trướng bụng, bồn chồn, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, gan tăng các transaminase, ù tai; thỉnh thoảng có gặp trường hợp phù, dị ừng, đau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, Khóa luận tốt nghiệp đại học

2

làm ổ loét tiến triển, nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu;…[1,2]

Do đó, với mục tiêu tạo ra màng cellulose vi khuẩn dựa trên loài vi

khuẩn thuộc chủng G xylium, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự

giải phóng thuốc qua màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng, hạn chế tác dụng phụ, kháng lại tác động của acid và khả dụng sinh học của vật liệu

cellulose trong việc điều trị bệnh Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp

Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường

nước vo gạo

3 Nội dung nghiên cứu

Tạo và thu VLC tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi

trường môi trường nước vo gạo

Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu tiềm năng của VLC trong sự giải phóng thuốc

Nghiên cứu tiềm năng của môi trường nuôi cấy trong nước vo gạo Nghiên cứu ứng dụng của VLC nhằm khắc phục hạn chế của thuốc

Diclofenac Natri để mang lại lợi ích cho việc điều trị

Đánh giá những ưu nhược điểm khả năng giải phóng thuốc của VLC nạp thuốc Diclofenac Natri để từ đó đề xuất hướng nghiên cứu với các thuốc khác

Khóa luận tốt nghiệp đại học

3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra hệ thống giải phóng Diclofenac Natri kéo dài từ màng cellulose

vi khuẩn

5 Tính mới của đề tài

Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclfenac

Natric từ vật liệu cellulose nạp thuốc Diclofenac Natri tạo từ Glconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu cellulose nạp thuốc

Khóa luận tốt nghiệp đại học

4

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.1.1 Tổng quan về vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus

Vật liệu cellulose là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, chủng

Gluconacetobacter xylinus Vật liệu cellulose cấu tạo bởi những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose mạch thẳng Theo AJ Brown (1886), vật liệu cellulose gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm kết hợp với nhau Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [12]

Vật liệu cellulose được tạo từ Gluconacetobacter xylinus có cấu trúc hóa

học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học lớn, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, vật liệu cellulose được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, môi trường, dầu mỏ, mỹ phẩm, da nhân tạo, y học, Vật liệu cellulose được sử dụng như hệ thống để phân phối thuốc [3, 4, 8]

Ngoài ra, Vật liệu cellulose còn được ứng dụng làm màng băng vết thương, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [9]

Amin và cộng sự đã báo cáo việc sử dụng vật liệu cellulose làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả cho thấy vật liệu cellulose giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc [11]

Ở Brazil, Vật liệu cellulose ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thương [9]

Vật liệu cellulose được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với nhiều ứng dụng và đang được nghiên cứu, sản xuất hàng loạt

Khóa luận tốt nghiệp đại học

5

1.1.2 Tổng quan về thuốc Diclofenac Natri

Diclofenac là một dẫn chất của acid 2-amino benzen acetic, có sinh khả dụng thấp do kém nước (độ tan trong nước ở 25oc khoảng 0.06 mM) [17] Vì vậy dạng được dùng thường là muối của nó (có độ tan lớn hơn, ổn định hơn), đặc biệt muối được sử dụng nhiều là muối Natri Diclofenac [5]

1.1.2.1 Công thức hoá học

Tên khoa học: [2- (2,6- dicloro anilino) phenyl] acetat natri

Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2

Khối lượng phân tử: 318,13 [5]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của thuốc Diclofenac Natri

1.1.2.3 Độ ổn định

Trong cấu trúc phân tử, Natri Diclofenac có nhóm chức amin bậc hai dễ

bị oxy hoá, nhóm phenyl acetat dễ bị thuỷ phân đặc biệt dưới tác động của lực

cơ học, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng Tuy nhiên nếu tồn tại ở dạng rắn thì tương đối bền

Khóa luận tốt nghiệp đại học

6

1.1.2.4 Hấp thụ

Diclofenac Natri được hấp thụ nhanh Diclofenac Natri hấp thụ qua đường tiêu hoá gần như là hoàn toàn, hấp thụ trong huyết tương đạt nồng độ tối đa khoảng 1 đến 4 giờ sau khi uống Diclofenac natri cũng được hấp thu qua da và niêm mạc[5]

1.1.2.5 Tác dụng và chỉ định

Natri Diclofenac có hoạt tính chống viêm, giảm đau và hạ sốt do có khả năng ức chế đặc hiệu enzym cyclo- oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prostaglandin, prostacyclin, thromboxane là các chất trung gian gây đau, viêm, sốt Diclofenac Natri có hoạt tính chống viêm mạnh hơn aspirin, nhưng tương đương với indomethacin [5]

Diclofenac Natri chủ yếu được sử dụng trong các bệnh xương khớp: viêm khớp dạng thấp, viêm gân, viêm bao hoạt dịch, với liều duy trì hàng ngày khoảng 75 đến 100mg, chia 3 đến 4 lần Với thuốc TDKD, chỉ cần uống 1 viên 75 mg, hoặc 100 mg trong một ngày, uống khi no [5]

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam đã và đang quan tâm đến việc nghiên cứu tạo VLC Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu VLC mới dừng lại ở bước đầu thí nghiệm

Nghiên cứu VLC làm tác nhân vận chuyển thuốc vẫn còn là một hướng nghiên cứu mới

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, đã có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng màng cellulose

vi khuẩn trong hệ thống phân phối thuốc (năm 2014) [11]

Nghiên cứu của Wei B Và CS (2011) màng cellulose vi khuẩn thu được sau khi ngâm trong benzalkkonium chloride có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S Aureus

và B Subtilis [19]

Khóa luận tốt nghiệp đại học

2.1.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Bảng 2.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

1 Diclofenac Natri dạng tinh khiết Trung Quốc

5 Amoni sunfat ((NH4)2SO4 ) Trung Quốc

6 Diamoni photphat (KH2PO4 ) Trung Quốc

1 Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ)

2 Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)

3 Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA

4 Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

5 Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)

6 Bể ổn nhiệt 1013, bể rửa siêu âm TCP 280

7 Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức)

8 Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh)

Thí nghiệm 1: Tạo VLC nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo

Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng VLC

Thí nghiệm 3: Tìm quang phổ hấp thụ và giải phóng của thuốc Diclofenac Natri

Thí nghiệm 4: Xây Dựng đường chuẩn Diclofenac Natri

Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc Diclofenac Natri trong 2 giờ

Thí nghiệm 6: Tính tỉ lệ thuốc giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC nạp Diclofenac Natri ở các môi trường pH khác nhau

Thí nghiệm 7: Tính tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac Natri của VLC nạp Diclofenac Natri ở độ dày khác nhau

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình tạo Vật liệu cellulose thô

Bổ Sung 10% Dịch Giống, 2% Acid Acetic

Hấp khử trùng môi trường trong 113oC, 15 phút

Khử trùng môi trường bằng tia UV (15 phút)

Ủ tĩnh trong buồng nuôi cấy tế bào khoảng 5 đến 14 ngày ở 28oC

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Vật liệu cellulose thô Khóa luận tốt nghiệp đại học

11

2.3.3 Xử lí và kiểm tra độ tinh khiết của VLC

Hình 2.2 Sơ đồ chu trình tinh chế VLC

Kiểm tra đường glucose có trong màng (Đường D_glucose tác dụng với thuốc Fehling tạo ra kết tủa nâu đổ) Vì vậy để kiểm tra sự có mặt của đường D-glcoso ta dung thuốc thử Fehling, xử lí hóa học

Lấy dịch thử mỗi loại của màng và mẫu đối chứng_nước cất và dung dịch D-glucose

Cho mỗi loại dịch thử vào mỗi ống nghiệm, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 đến 15phút

Quan sát hiện tượng (kết tủa) xuất hiện trong mỗi ống nghiệm

2.3.4 Phương pháp dựng đường chuẩn

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử

Sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru-Nhật Bản), đo phổ vùng

tử ngoại và khả kiến Máy gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm

Vật liệu cellulose thô màu trắng, trong

Vật liệu cellulose có màu vàng nâu

Vật liệu cellulose có màu trắng ngà, không mùi

Vật liệu cellulose thô

Rửa dưới vòi nước, ngâm trong NaOH 3% trong 24 giờ đến 48giờ làm vỡ tế bào vi khuẩn, giải phóng độc tố ra ngoài

Trung hòa bằng HCL 3% trong 24 giờ đến 48giờ

Ngâm nước trong 24 giờ đến 48 giờ trung hòa hết acid

Khóa luận tốt nghiệp đại học