Trang 1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠOKhóa RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS luận tốt nghiệp đại học NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chun ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Hà Nội, 20 tháng năm 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠOKhóa RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS luận tốt nghiệp đại học NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn: ThS HÀ THỊ MINH TÂM Hà Nội, 20 tháng 05 năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; quý thầy, cô khoa Sinh-KTNN; quý thầy, cô Viện Nghiên cứu khoa học ứng dụng Trƣờng ĐHSP Hà Nội giúp đỡ em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời biết ơn chân thành tới ThS Hà Thị Minh Tâm Vì lần vào làm nghiên cứu khoa học nên bƣớc đầu nhiều bỡ ngỡ thiếu sót mặt kiến thức nhƣ kỹ năng, nhiên đƣợc bảo tận tình nên em hồn thành tốt khóa luận Khơng có thành cơng mà khơng gắn liền với hỗ trợ, em mong nhận đƣợc góp ý từ quý thầy, bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp em hoàn chỉnh Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Khóa luận tốt nghiệp đại học Nguyễn Tú Hƣơng LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn” đề tài nghiên cứu em dƣới hƣớng dẫn tận tình Ths.Hà Thị Minh Tâm Các kết quả, số liệu có đƣợc q trình nghiên cứu thân em, khơng có trùng lặp đề tài Em xin chịu trách nghiệm lời cam đoan thân có sai sót! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Tú Hƣơng Khóa luận tốt nghiệp đại học DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BC : Cellulose vi khuẩn cs : Cộng MTC : Môi trƣờng chuẩn PC : Plant cellulose OD : Optical density VLC : Vật liệu cellulose G xylinus : Gluconacetobacter xylinus Khóa luận tốt nghiệp đại học MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan đối tƣợng lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Giới thiệu Diclofenac 1.1.2 Tổng quan Bacterial cellulose 1.1.3 Đặc điểm phân loại Gluconacetobacter xylinum 1.2 Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Ở Việt Nam CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Phạm vi nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp đại học 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 2.3.2 Phương pháp chế tạo vật liệu BC 2.3.3 Phương pháp xử lý thống kê 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 3.1 Kết tạo loại vật liệu BC 14 3.1.1 Tạo màng BC từ môi trường lên men 14 3.1.2 Thu màng BC thô 14 3.1.3 Xử lý màng BC trước hấp thụ 15 3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết màng BC 15 3.1.5 Xây dựng phương trình đường chuẩn thuốc Diclofenac 17 3.1.6 Khảo sát khả hấp thụ màng BC 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 2.3 Thành phần thuốc khối lượng tương ứng Bảng 3.1 Giá trị OD hấp thụ thuốc màng BC (n=3) (OD – 283 nm) 19 Bảng 3.2 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC thời điểm 20 Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng BC 21 Khóa luận tốt nghiệp đại học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo thuốc Diclofenac Hình 3.1 Màng BC hình thành 14 Hình 3.2 Rửa màng vịi nước 15 Hình 3.3 Màng BC tinh chế 16 Hình 3.4 Màng BC chia vào bình tam giác 16 Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn diclofenac 17 Hình 3.6 Chuẩn bị dịch đo quang phổ 18 Hình 3.7 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC có khác biệt 20 Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng BC 21 Khóa luận tốt nghiệp đại học MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Diclofenac đƣợc biết loại thuốc chống viêm khơng steroid Thuốc Diclofenac có tác dụng hạ sốt, giảm đau chống viêm, ức chế hoạt tính cyclogenase Vì vậy, giảm tạo thành prostanglandin, prostacyclin thromboxane chất trung gian q trình viêm Ngồi ra, Diclofenac điều hịa đƣờng lipoxygenase kết tụ tiểu cầu Diclofenac cịn gây hại cho đƣờng tiêu hóa làm giảm khả tổng hợp Prostaglandin gây ức chế tạo mucin (là chất bảo vệ cho đƣờng tiêu hóa) Prostaglandin chất có vai trị trì tƣới máu thận Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp Prostaglandin gây viêm cầu thận, hội chứng thận hƣ hoại tử nhú đặc biệt biểu rõ ngƣời bệnh thận, ngƣời suy tim Với ngƣời bệnh trên, thuốc chống viên không steroid gây suy thận cấp suy tim cấp.[5] Trong tự nhiên xuất số vi khuẩn sinh màng cellulose Nuôi cấy vi khuẩn môi trƣờng chứa glucose, glycerol số nguồn cacbon hữu khác chúng có hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết, hay gọi màng sinh học Bacterial cellulose (BC) Khóa luận tốt nghiệp đại học BC cấu tạo sợi microfibril tạo thành bó sợi song song hình thành mạng cellulose có độ bền học, đô tinh khiết thấm hút cao BC sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, tạo màng bảo vệ BC nguồn polymer mới, giải pháp giúp cho nhiều nhà khoa học tìm nhiều nguồn nguyên liệu nay, ứng dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau.[5] Với mục đích đánh giá đƣợc khả hấp thu thuốc Ranitidin vật liệu BC khảo sát đặc tính lý hóa vật liệu BC trƣớc sau hấp thụ thuốc, thực đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu Cellulose tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn” Mục đích nghiên cứu - Mục đích nghiên cứu: Thiết kế đƣợc hệ thống màng BC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc nạp thuốc diclofenac natri Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều - Nhiệm vụ nghiên cứu: Chế tạo vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trƣớc hấp thụ thuốc diclofenac natri, xác định lƣợng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết vật liệu BC Khảo sát tối ƣu hóa khả hấp thụ thuốc diclofenac natri vào vật liệu BC Khảo sát đặc tính thuốc diclofenac natri trƣớc sau đƣợc hấp thụ thuốc Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu Cellulose tạo từ Gluconacetobacter xilinus ni cấy mơi trƣờng chuẩn Khóa luận tốt nghiệp đại học Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC lên men mơi trƣờng chuẩn - Ý nghĩa thực tiễn: Từ kết nghiên cứu chọn đƣợc trƣờng hợp hấp thụ thuốc tốt Từ kết nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn đời sống Tính đề tài - Nâng cao khả hấp thụ thuốc diclofenac natri điều trị giảm đau, chống viêm - Khắc phục nhƣợc điểm thuốc từ kết nghiên cứu áp dụng vào điều trị bệnh Bƣớc 5: Bổ sung 10% dịch giống, lắc tay cho giống phân bố dung dịch (trong trình phải ý để mơi trƣờng dịch giống không bị nhiễm khuẩn) Bƣớc 6: Chuyển dịch sang dụng cụ ni cấy theo kích thƣớc nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh khoảng 4-14 ngày 280C Bƣớc 7: Thu vật liệu BC thơ, rửa chúng dƣới vịi nƣớc (xả nƣớc nhẹ) 2.3.2.2 Xử lý vật liệu BC a Xử lý màng BC trƣớc hấp thụ thuốc Mục đích: Cần nuôi cấy tĩnh giúp loại tạp chất môi trƣờng nuôi cấy độc tố vi khuẩn Phƣơng pháp: Vật liệu chứa lƣợng lớn vi khuẩn hấp vật liệu NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C thời gian 15 phút nồi hấp khử trùng để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn giải phóng nội độc tố vi khuẩn thời gian 1giờ Khóa luận tốt nghiệp đại học Sau ngâm NaOH, vớt vật liệu đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến vật liệu trắng Thử quỳ tím bề mặt vật liệu BC trung tính, thu đƣợc BC tinh khiết b Đánh giá độ tinh khiết màng BC Mục đích: Sau xử lý, màng BC loại tạp chất gây độc hại Phƣơng pháp: - Màng BC tinh chế mang cắt nhỏ, cho 50ml nƣớc cất - Chia màng BC cắt vào bình tam giác đổ dung dịch thuốc Diclofenac natri - Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vịng/phút 10 - Sau đó, sử dụng dung dịch axit triclor acetic 1% để kiểm tra protein dịch chiết màng Mẫu chứng âm nƣớc cất, mẫu chứng dƣơng dung dịch pepton 1% Phản ứng dƣơng cho kết tủa đục - So sánh với mẫu đối chứng âm (nƣớc cất) ta thu đƣợc màng dẻo dai, mềm, mỏng, hút nƣớc dịch mô 2.3.2.3 Phương pháp dựng đường chuẩn thuốc Diclofenac natri - Nguyên lý: Sử dụng máy UV- 2450 đo quang phổ hấp thụ thuốc diclofenac với nồng độ khác bƣớc sóng 283 nm [4] - Thực hiện: Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu chuẩn diclofenac với nồng độ tƣơng ứng dung môi Methanol Trong đó, mẫu trắng methanol Bƣớc 2: Đo độ hấp thụ dung dịch chuẩn bị theo dãy bƣớc lựa chọn với mẫu trắng xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan độ hấp thụ nồng độ diclofenac natri Khóa luận tốt nghiệp đại học Bƣớc 3: Dùng máy đo quang phổ từ ngoại UV- 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) dung dịch pha nhƣ hấp thụ cực đại (λ max) Tiến hành đo lần, lấy giá trị trung bình quang phổ thuốc diclofenac natri để xây dựng đƣờng chuẩn thuốc Phƣơng trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ nồng độ diclofenac natri độ hấp thụ Phƣơng trình biểu diễn nồng độ độ hấp thụ có dạng: y= ax + b với R2 hệ số tƣơng quan Trong đó: y: độ hấp thụ dung dịch λ max x: nồng độ dung dịch Giá trị mật độ quang (OD) dung dịch thuốc nồng độ khác 11 2.3.2.4 Xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng BC, tính hiệu suất Tiến hành thử nghiệm mẫu MTC - Mẫu 1: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm - Mẫu 2: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 0,5cm, ép loại nƣớc 50% - Mẫu 3: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm - Mẫu 4: Dùng màng cellulose vi khuẩn với độ dày 1cm, ép loại nƣớc 50% Chuẩn bị trƣớc 12 bình tam giác chứa 25mg thuốc diclofenac 100ml dung dịch Methanol khuấy tan Cho 12 màng vào 12 bình trên, cho vào máy lắc 150 vòng/ phút Sau quãng thời gian 30 phút, 1giờ, 1,5 giờ, rút mẫu đo quang phổ máy UV – 2450 Thu đƣợc giá trị OD thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta nhận đƣợc nồng độ diclofenac (C%) có dung dịch (1) Khóa luận tốt nghiệp đại học C%: nồng độ phần trăm khối lƣợng, thể tích số mg chất tan có 100ml dung dịch mct: khối lƣợng chất tan dung dịch (mg) mdd hay Vdd: thể tích dung dịch (ml) Khối lƣợng diclofenac hấp thụ là: mht = mtr - ms (2) mht : khối lƣợng diclofenac đƣợc hấp thụ vào màng BC (mg) mtr: khối lƣợng diclofenac dung dịch ban đầu (mg) ms: khối lƣợng diclofenac lại 100ml dung dịch diclofenac 25% (mg) Tỷ lệ % diclofenac hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn: (3) 12