Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo ra từ gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN VŨ THANH HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

VŨ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP

DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ

GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG

MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Khóa luận tốt nghiệp đại học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

VŨ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP

DICLOFENAC NATRI TẠO RA TỪ

GLUCONACETOBACTER XYLINUS TRONG

MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

ThS Ngô Thị Hải Yến

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Khóa luận tốt nghiệp đại học

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới toàn thể các thầy cô đang làm việc tại Viện nghiên cứu và ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, cùng toàn thể các thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN và các bạn sinh viên cùng tham gia làm đề tài bộ môn Sinh lý người và động vật đã quan tâm, giúp đỡ

và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận với đề tài

“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già”

Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Ngô Thị Hải Yến, người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận

Do là lần đầu được tiếp xúc với nghiên cứu khoa học và bản thân cũng chưa có nhiều kinh nghiệm nên tôi còn nhiều thiếu sót trong quá trình thực hiện Vì vậy, tôi rất mong nhận được những lời góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để khóa luận được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thanh Hà

Khóa luận tốt nghiệp đại học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Nghiên cứu khả năng giải

phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường nước dừa già” là kết quả

nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Ngô Thị Hải Yến, giảng viên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Những số liệu kết quả trong khóa luận này là trung thực, không có sự sao chép của đề tài khác Đề tài này chưa từng công bố ở đâu và hoàn toàn không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác Trong đề tài, tôi có trích dẫn một số dữ liệu của một số tác giả, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thanh Hà

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

5 Tính mới của đề tài (nếu có) 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK) 4

1.1.1 Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus 4

1.1.2 Màng cellulose vi khuẩn 4

1.2.Thuốc Diclofenac Natri 5

1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi 5

1.2.2.Tính chất 6

1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac 6

1.2.4 Động học giải phóng của thuốc 6

1.2.5.Dược lực học của thuốc 7

1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc 7

1.3.Tình hình trên thế giới và Việt Nam 8

1.3.1 Trên thế giới 8

1.3.2 Ở Việt Nam 9

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 Khóa luận tốt nghiệp đại học

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 10

2.3.1.1 Chủng vi sinh 10

2.3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 10

2.3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 10

2.3.2 Cách bố trí thí nghiệm 11

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu 11

2.3.3.1.Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già 11

2.3.3.2 Xử lí vật liệu CVK 12

2.3.4 Phương pháp pha dung dịch đệm 14

2.3.5 Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac 14

2.3.6 Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC 18

2.3.7.Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi trường nước dừa già 19

2.3.8 Phương pháp xử lý thống kê 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Màng CVK được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già 21

3.2 Thu màng CVK thô từ môi trường 21

3.3 Tinh chế màng CVK 23

3.4 Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng khỏi màng CVK 23

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

Kết Luận 36

Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn 12 Bảng 2.2 Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác

nhau (n=3) ở bước sóng 276nm 15 Bảng 2.3 Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác

nhau (n=3) ở bước sóng 278nm 16 Bảng 2.4 Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác

nhau (n =3) ở bước sóng 281nm 17 Bảng 3.1 Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác

nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng không ép 26 Bảng 3.2 Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác

nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng ép 28 Bảng 3.3 Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng chưa ép ở các môi trường pH

khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3) 30 Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc của các màng ép ở các môi trường pH khác

nhau trong các khoảng thời gian khác nhau (n=3) 32 Bảng 3.5 Tỷ lệ thuốc Diclofenac được giải phóng cực đại tại 24 giờ của màng

trong các môi trường pH khác nhau 34 Khóa luận tốt nghiệp đại học

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Diclofenac 6

Hình 2.1 Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men 13

Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm 15

Hình 2.3 Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm 16

Hình 2.4 Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm 17

Hình 3.1 Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già 21

Hình 3.2 Màng thu được sau quá trình nuôi cấy 22

Hình 3.3 Màng CVK được bảo quản trong tủ lạnh 22

Hình 3.4 Màng CVK đang được xả dưới vòi nước 23

Hình 3.5 Màng CVK thu được sau quá trình hấp thụ 24

Hình 3.6 Màng được cho vào máy giải phóng 24

Hình 3.7 Mẫu được rút ra các lọ nhỏ để đo quang phổ 25

Hình 3.8 Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm chưa ép trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 27

Hình 3.9 Biểu đồ so sánh mật độ quang của lượng thuốc giải phóng ở màng 0,5cm và 1cm đã ép trong các môi trường pH khác nhau (n=3) 29

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng chưa ép ở các pH và thời gian khác nhau 31

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc Diclofenac của các màng ép ở các pH và thời gian khác nhau 33

Hình 3.12 Khả năng giải phóng thuốc cực đại của màng ở các môi trường pH khác nhau tại 24 giờ 34 Khóa luận tốt nghiệp đại học

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ở nước ta những năm gần đây, tỉ lệ phụ nữ mắc các căn bệnh viêm khớp mãn tĩnh ngày càng tăng cao Đặc biệt trong độ tuổi từ 35- 55 tuổi, phụ

nữ hay bị hành hạ bởi các cơn đau do viêm khớp dạng thấp gây nên [2]

Theo các nghiên cứu cho thấy Diclofenac–một dẫn chất của acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid có tác dụng chống viêm và giảm đau Vì vậy, người ta sử dụng Diclofenac để sản xuất ra thuốc dùng khi chữa các bệnh viêm khớp

Ngoài ra, Diclofenac còn là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase vì vậy làm giảm sự tạo thành những chất trung gian của quá trình viêm như prostacyclin, thromboxan và prostaglandin Bên cạnh đó, Diclofenac còn ức chế sự tạo thành mucin gây tổn hại cho đường tiêu hóa dẫn

đến làm giảm sự tổng hợp prostaglandin [3]

Các nghiên cứu gần đây đã phát hiên ra có một số loài vi khuẩn trong

tự nhiên có khả năng tạo màng cellulose Khi được nuôi cấy trong môi trường thích hợp những vi khuẩn này có khả năng hình thành trên một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết được gọi là màng cellulose vi khuẩn (CVK) [5]

Màng CVK đang là nguồn vật liệu mới được quan tâm, thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu nhờ những đặc tính ưu việt mà nó đem lại như: Màng CVK có độ tinh khiết cao, độ dẻo dai cơ học lớn và đặc biệt có khả năng hút nước và giữ nước rất tốt Hiện nay màng CVK đang được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Điển hình, trong lĩnh vực y học, khi điều trị bỏng màng CVK đã được ứng dụng làm da nhân tạo thay thế tạm thời Ngoài ra màng CVK còn là tác nhân chuyển thuốc và là chất làm co mạch [12,21]

Ở Việt Nam, màng CVK có nhu cầu sử dụng cao nhưng giá thành nhập khẩu từ nước ngoài rất lớn và việc nghiên cứu màng CVK còn ở mức hạn chế.Tuy nhiên, bằng phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn Khóa luận tốt nghiệp đại học

Gluconacetobacter Xylinus chúng ta hoàn toàn có thể tự sản xuất màng CVK

để ứng dụng trong thực tiễn

Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng

Gluconacetobacter Xylinus, từ đó tìm hiểu khả năng giải phóng của thuốc

Diclofenac ở môi trường nước dừa già, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên

cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Diclofenac Natri

từ Gluconacebacter Xylinus trong môi trường nước dừa già.”

2 Mục đích của nghiên cứu

Khảo sát, đánh giá khả năng giải phóng thuốc Diclofenac Natri của vật liệu cellulose trong môi trường nước dừa già thông qua các thí nghiệm đã thiết kế

3 Nội dung nghiên cứu

- Chế tạo màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus trong môi trường

nước dừa già

+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK

+ Nghiên cứu tìm hiểu tiềm năng của màng CVK Diclofenac Natri trong việc giải phóng thuốc

-Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng

Gluconacetobacter Xylinus

+ Tăng sinh khả dụng của thuốc Diclofenac Natri

Từ kết quả nghiên cứu có thể áp dụng vào thực tiễn

Khóa luận tốt nghiệp đại học

5 Tính mới của đề tài (nếu có)

Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclofenac Natri từ các loại vật liệu CVK nạp thuốc trong các môi trường giải phóng thuốc mô phỏng theo đường dạ dày – ruột khác nhau

Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu CVK nạp thuốc

Khóa luận tốt nghiệp đại học

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK)

1.1.1 Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus

Gluconacetobacter Xylinus được xếp vào chi Gluconacetobacter, thuộc

họ vi khuẩn Acetobacteraceae [8]

Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,

hóa dị dưỡng Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường nuôi cấy dịch thể, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose [8]

Sự phát triển của Gluconacetobacter và khả năng tổng hợp cellulose

tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu có trong môi trường nuôi cấy

Một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn

Gluconacetobacter Xylinus: độ pH thấp, lượng oxy cần cung cấp rất lớn, nhiệt

độ thích hợp là 25-30ºC [8]

1.1.2 Màng cellulose vi khuẩn

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết mắt xích β-D- Glucose, có công thức cấu tạo là ( C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích Cellulose vi khuẩn ( CVK) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ[7]

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose thực vật (PC)[7] Nhưng cellulose vi khuẩn có những đặc tính vượt trội do được cấu tạo từ các bó sợi microfibril và không có sự kết hợp của các hợp chất phân tử những đặc tính ưu việt hơn của cellulose vi khuẩn là: độ chịu lực tốt hơn, tính đàn hồi, độ bền cơ học cao hơn, …

Cellulose vi khuẩn được tạo thành từ 2 loại cấu trúc tinh thể riêng biệt

có nguồn sản xuất từ vi sinh vật, kích thước khoảng 20 micromet Mức độ Khóa luận tốt nghiệp đại học

polimer hóa của CVK thường từ 2000 – 6000 gốc glucose (1 số vi khuẩn đặc biệt có thể đạt 16000- 20000 gốc glucose)

Tính chất của cellulose vi khuẩn:

Có cấu trúc mạng tinh thể và có kích thước ổn định

Có sức căng, độ bền sinh học, độ bền hóa học, độ bền cơ học và độ tinh sạch cao

Có khả năng phục hồi sau khi bị thủy phân bởi 1 số vi sinh vật

Có khả năng chịu nhiệt và khả năng tạo tinh thể tốt

Được tổng hợp một cách trực tiếp dưới dạng sợi chỉ nhỏ hoặc dạng màng mỏng

Do cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lignin và cấu trúc của CVK có thể biến đổi trong quá trình nuôi cấy nên ta có thể kiểm soát được kích thước, lý tính cũng như chất lượng của cellulose trong quá trình nuối cấy [6]

Cellulose được xem là nguồn vật liệu có nhiều ưu thế nên hiện nay ứng dụng của cellulose đang được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực:

Trong y học: Màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus tẩm mù u có

tác dụng giống màng sinh học trị bỏng Đặc biệt, người ta đã sử dụng màng CVK tinh sạch để làm da nhân tạo trong chữa vết thương [12]

Trong thực phẩm: các sản phẩm ứng dụng của CVK như màng bao thực phẩm, một số món tráng miệng, …

1.2 Thuốc Diclofenac Natri

1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi

Diclofenac là một thuốc chống viêm không steroid[2]

+ Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2

+ Tên quốc tế: Diclofenac Natri

+ Tên IUPAC: 2-(2-(2,6- dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid + Công thức cấu tạo: được mô tả ở hình 1.1

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Diclofenac 1.2.2.Tính chất

- Diclofenac Natri là chất bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ

- Diclofenac Natri dễ tan trong methanol, trong ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton [4]

- Nóng chảy ở khoảng 280°C [4]

1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac

Diclofenac- một dẫn chất của acid phenylacetic Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid[2] có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh Ngoài ra, Diclofenac cũng có thể được sử dụng để điều trị các cơn đau khác (như đau răng, đau sau khi sinh) Tuy nhiên với các cơn đau nghiêm trọng và bất ngờ thì nên sử dụng các thuốc giảm đau có tác dụng giảm đau nhanh hơn Diclofenac

Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do

đó làm giảm đáng kể sự tạo thành những chất trung gian của quá trình viêm như prostaglandin, prostacyclin và thromboxan Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu

1.2.4 Động học giải phóng của thuốc

Diclofenac được hấp thụ qua đường tiêu hóa sau khi uống Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói Diclofenac gắn rất nhiều với protein huyết tương, chủ yếu với albumin (chiếm khoảng 99 %) [2] Khoảng 50% liều uống được chuyển hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh khả dụng của liều tiêm tĩnh mạch 2 giờ sau khi uống, nồng

độ thuốc đạt tối đa trong huyết tương, 4 đến 6 giờ sau khi uống, nồng độ trong Khóa luận tốt nghiệp đại học

dịch bao hoạt dịch đạt mức cao nhất Tác dụng của thuốc xuất hiện 20 - 30 phút sau tiêm bắp, 30 - 60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng, 60 - 120 phút sau khi uống

Nửa đời trong huyết tương khoảng 1 - 2 giờ Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ Xấp xỉ 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất chuyển hóa còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn; phần còn lại thải qua mật và phân Hấp thụ, chuyển hóa và đào thải không phụ thuộc vào tuổi Nếu liều lượng và khoảng cách giữa các lần dùng thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy, ngay cả khi chức

năng thận và gan bị giảm

Chỉ định

Ðiều trị dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp Thống kinh nguyên phát Ðau cấp (viêm sau chấn thương, sưng nề) và đau mạn Viêm đa khớp dạng thấp thiếu niên

1.2.5 Dược lực học của thuốc

Diclofenac có cấu trúc liên quan với Meclofenamat Natri và Acid Meclofenacmic và có tác động dược lí tương tự như các NSAID nguyên thủy khác Thuốc có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt Tác dụng của thuốc

là làm thoái hóa mạch máu mới sinh trong mô viêm của động vật Ngoài ra còn làm ức chế sự hình thành mạch máu Cơ chế hoạt động của thuốc chưa được xác lập rõ ràng, nhưng có nhiều tác dụng liên quan đến sự ức chế tổng hợp prostaglandin [2]

1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc

(5 - 15% người bệnh dùng Diclofenac bị ảnh hưởng bởi tác dụng phụ ở

bộ máy tiêu hóa) [2]

Chú ý: Trong số các thuốc chống viêm không steroid, Diclofenac độc hơn Ibuprofen và Ibuprofen, là thuốc ít độc nhất nhưng vẫn hiệu quả

Tác dụng phụ thường gặp, ADR > 1/100

Toàn thân: Đau đầu, bồn chồn

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng, chán ăn, khó tiêu

Gan: Tăng các transaminase

Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu,

Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc

Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn

Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng bạch cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu

Gan: Rối loạn co bóp túi mật, test chức năng gan bất thường, nhiễm độc gan (vàng da, viêm gan)

Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội chứng thận hư

1.3 Tình hình trên thế giới và Việt Nam

- Laila Hassanein Emara, Nesrin Fouad Taha, Rania Mohamed Badr , Nadia Mohamed Mursi (2012)[21] đã nghiên cứu phát triển hệ thống bơm thẩm thấu để phân phối có kiểm soát Natri Diclofenac

- Mitra Jelvehgari , Hadi Valizadeh , Ramin Jalali Motlagh, Hassan Montazam (2014)[22] đã nghiên cứu xây dựng và đặc tính hóa lý của Buccoadhesive Microspheres chứa Diclofenac Sodium

- Srikanth A ABSTRACT, Nagaveni, SaravanaKumar, Prasanna Raju Y(2013)[20] đã nghiên cứu đặc tính và chế tạo DICLOFENAC SODIUM loại MICROCAPSULES LOADED

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là một hướng đi mới Các nghiên cứu và ứng dụng của màng CVK mới dừng lại

ở mức độ khiêm tốn và hầu hết là ở điều kiện phòng thí nghiệm

Hiện nay, chúng ta đã có thể tự sản xuất màng CVK bằng phương pháp sản xuất đơn giản là lên men tĩnh Phương pháp này sử dụng trang thiết bị đơn giản, giá thành thấp và tốc độ sinh sản nhanh, mang lại nhiều hiệu quả trong việc sản xuất màng CVK ứng dụng vào thực tiễn Khóa luận tốt nghiệp đại học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Khả năng giải phóng Diclofenac của màng CVK được lên men từ môi trường nước dừa già

2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường ĐHSP Hà Nội 2

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1.1 Chủng vi sinh

Vi khuẩn cellulose từ Gluconacetobacter Xylinus được nuôi cấy tại

phòng sạch Vi sinh- Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu: nước dừa già, nước cất

- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)

Khóa luận tốt nghiệp đại học

- Cân phân tích CP 224S, cân kỹ thuật TE 412 (Sartorius – Thụy Sỹ)

- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)

- Bể ổn nhiệt 1013

- Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức)

- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh)

- Bể rửa siêu âm TCP 280

- Tủ lạnh Daewoo

- Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác (hộp nhựa, cốc đong 500ml, 1000ml, pipet, bình tam giác, kéo, giấy bạc, giấy thấm, …)

2.3.2 Cách bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm 1: Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già

- Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK

- Thí nghiệm 3: Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc thông qua hệ thống được thiết kế

- Thí nghiệm 4: Dựng đường chuẩn Diclofenac

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi

trường nước dừa già

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3.1.Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già

Bước 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ ở 200°C, sau khi sấy xong lấy

ra và để nguội

Bước 2: Chuẩn bị môi trường theo Bảng 2.1

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn

Thành phần Môi trường nước dừa già

Bước 3: Hấp khử trùng môi trường ở 111°C trong 15 phút

Bước 4: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV từ 15-30 phút rồi để

nguội môi trường

Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho

giống phân bố đều trong dung dịch

Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên

cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 28°C

Bước 7: Thu màng CVK thô, rửa sạch chủng dưới vòi nước

+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113°C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ

+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng CVK cần đạt là trung tính, ta thu được CVK tinh khiết [13,6]

Màng Cellulose vi khuẩn thô được xử lý theo sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men

Màng sau khi thu được cần đạt những yêu cầu sau:

- Mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt

- Có độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô

- Độ dày thích hợp của màng CVK thô: chọn màng CVK có độ dày 0,5cm và 1cm để tiến hành làm thực nghiệm

2.3.4 Phương pháp pha dung dịch đệm

Lượng thuốc được giải phóng được tiến hành thử nghiệm ở dung dịch đệm có pH là 2; 4,5; 6,8; 7,4

Pha các dung dịch đệm có pH như trên:

- Dung dịch đệm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nước, thêm 11,9ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1000ml, đo pH

và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH)

- Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong 1000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH)

- Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 68,8g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh

pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH)

- Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml, đo pH

và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH)

2.3.5 Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac

Pha thuốc Diclofenac trong Ethanol ở các nồng độ 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%

Sử dụng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch mẫu chứa thuốc Diclofenac ở các bước sóng 276nm, 278nm, 281nm

Tiến hành đo 3 lần sau đó lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc để dựng đường chuẩn

Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau thể hiện ở Bảng 2.2

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Bảng 2.2 Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ