Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus)

- Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao,,,, để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với ch

T Ổ NG QUAN

T Ổ NG QUAN V Ề SÂM VŨ DIỆ P

SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm (Araliaceae) [1,3]

SVD còn có tên gọi khác là Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm, Ngật đáp thất [1,3]

Cây thảo sống nhiều năm, cao từ 0,3 đến 0,5 m, có thân rễ mập, phân nhánh, nằm ngang và thường nổi trên mặt đất Rễ củ dài, nhiều đốt, mang nhiều vết sẹo do thân tàn lụi để lại, với đầu rễ có hình con quay Thân cây mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, đường kính từ 0,3 đến 0,6 cm Lá cây là lá kép chân vịt, mọc vòng ở ngọn, thường gồm 2 đến 3 lá, với 3 đến 7 lá chét, thuôn dài từ 2,5 đến 14 cm và rộng từ 1,5 đến 4 cm Lá có gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng và có lông.

Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp [15]

@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 - 10 cm, mang từ 20 -

Hoa có cuống mảnh dài từ 1 đến 1,5 cm, màu trắng lục với 5 lá nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 - 3 ô, đầu vỏ nhụy chẻ đôi Quả mọng hình cầu hơi dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ và có chấm đen lớn ở đầu Quả chứa 2 - 3 hạt hình cầu, màu xám trắng, với vỏ cứng và có rốn hạt.

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

SVD là loài cây ưa ẩm và bóng râm, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín ở độ cao từ 1600 – 2300 m Loài này phát triển mạnh mẽ trong mùa mưa ẩm, với chồi thân xuất hiện từ cuối tháng 2 đến đầu tháng 3 Chồi sinh trưởng nhanh, đạt chiều cao cực đại trong vòng một tháng và cho ra hoa vào tháng 4 Quả xanh hình thành từ cuối tháng 4 đến tháng 6, chín và rụng vào tháng 7, nhưng thường bị cuốn trôi do mưa lớn, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên Sau khi quả chín, vào tháng 9 đến tháng 10, phần thân trên mặt đất tàn lụi, để lộ vết sẹo trên thân rễ, dấu hiệu xác định tuổi cây, trong khi chồi mới bắt đầu hình thành, giúp thân rễ phát triển thêm về chiều dài.

Sâm vũ diệp (SVD) chủ yếu phân bố ở các khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ, và Nê Pan, đặc biệt là vùng cận Himalaya Điểm phân bố cuối cùng của loại sâm này về phía nam là tại Sa.

Pa của Việt Nam, đặc biệt là ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn như Sa Pa, Bát Xát và Than Uyên, đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do nạn phá rừng và khai thác bừa bãi Sự phân bố của loài này đã bị thu hẹp đáng kể, khiến việc bảo vệ trở thành một ưu tiên hàng đầu tại Việt Nam.

Hiện nay, SVD đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang và cho những kết quả khả quan [15,16]

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002 cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Saponin được xác định là thành phần hoạt chất chính trong lá và thân SVD, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.

Năm 1989, một nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc đã công bố việc phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây, bao gồm các ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid, majorosid F1 và bipinnatifidusosid.

Rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid R0, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2

[1] Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm

Từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, đã phát hiện 10 saponin khung oleanan, bao gồm 3 chất mới là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết, trong đó có narcissiflorin methyl este, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl este, stipuleanosid R1 và pseudoginsenosid.

RT1 methyl este, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl este [22]

Năm 2018, nhóm nghiên cứu Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 saponin từ thân rễ SVD là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester [16]

Me : methyl Ara(f) : -L-arabinofuranosyl Ara(p) : -L-arabinopuranosyl Glc : -D-glucopyranosyl Xyl : -D-xylopyranosyl

Hình 1.2 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp [22]

Bảng 1.1 Các hợp chất saponin đã phân lập từSâm vũ diệp

Hiện nay, đã có 25 hợp chất saponin được xác định từ thành phần cây SVD

Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]

SVD được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống tại Việt Nam và Trung Quốc, tuy nhiên, tài liệu khoa học về tác dụng dược lý của nó còn hạn chế Nghiên cứu trên động vật cho thấy SVD có khả năng tăng cường chức năng sinh lý, cải thiện hệ thần kinh trung ương, nâng cao sức dẻo dai và sức đề kháng, đồng thời có tác dụng tán huyết, chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan và tăng cường hệ miễn dịch Ngoài ra, SVD còn có hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

Theo đông y, SVD là một vị thuốc quý với nhiều công dụng như hoạt huyết khứ ứ, tiêu đờm, giảm đau và điều trị các triệu chứng như thũng trướng, đau gân cốt, rắn độc cắn, tâm vị khí thống, thổ huyết, chảy máu mũi và xuất huyết dạ dày Ngoài ra, SVD còn có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng và tăng cường trí nhớ, đặc biệt tốt cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi SVD cũng được sử dụng để ngâm rượu hoặc nấu cao, giúp kích thích sinh dục.

T Ổ NG QUAN V Ề TIÊU CHU ẨN DƯỢ C LI Ệ U

Tiêu chuẩn cơ sở được phát triển dựa trên nghiên cứu khoa học, công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, cũng như kinh nghiệm và nhu cầu thực tiễn.

Các quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu bao gồm mô tả, định tính, kiểm tra độ tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết xuất và định lượng hoạt chất trong dược liệu.

Mô tả dược liệu bao gồm các yếu tố như hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, và những đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt Các đặc điểm thể chất này giúp nhận diện và phân biệt các loại dược liệu một cách chính xác.

• Định tính: Là những phương pháp dùng đề nhận biết dược liệu, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học là quá trình quan sát đặc điểm của tế bào và mô trong các lát cắt, bột hoặc bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi Phương pháp này giúp xác định các đặc trưng hình thái của dược liệu, từ đó hỗ trợ trong việc nhận diện và phân loại chúng một cách chính xác.

- Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực, v.v… của các dược liệu

Định tính hóa học là phương pháp thử nghiệm các thành phần có trong dược liệu thông qua các phản ứng hóa học Quy trình thực hiện được mô tả chi tiết trong các chuyên luận về dược liệu cụ thể.

Định tính sắc ký là quá trình sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao để phát hiện các thành phần có trong dược liệu Quá trình này giúp so sánh các thành phần với chất chuẩn hoặc dược liệu chuẩn nhằm đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong phân tích.

Định tính huỳnh quang là quá trình quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt hoặc mặt cắt của dược liệu, cũng như dịch chiết dược liệu, dưới điều kiện thường hoặc sau khi tác động với acid, kiềm hay thuốc thử Mẫu thử thường được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm, trừ khi có quy định riêng trong chuyên luận.

- Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại

Trải một lớp bột dược liệu mỏng trong vòng kim loại và đậy kín bằng một phiến kính có miếng bông tẩm nước lạnh Đặt tấm kim loại lên lưới amiant với lỗ tròn 2 cm, rồi đun nóng nhẹ phía dưới cho đến khi bột dược liệu cháy xém Sau khi nhấc phiến kính ra và để nguội, quan sát hình dạng và màu sắc của các tinh thể thăng hoa trên phiến kính bằng kính hiển vi, hoặc thực hiện phản ứng hóa học phù hợp với chất đã thăng hoa.

Thử tinh khiết là phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, với các chỉ tiêu có thể khác nhau tùy thuộc vào loại dược liệu cụ thể Việc này có thể bao gồm một số hoặc tất cả các chỉ tiêu cần thiết để đảm bảo chất lượng.

- Mất khối lượng do làm khô

- Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric

- Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối

- Tỉ lệ vụn nát của dược liệu

- Hàm lượng kim loại nặng

- Dư lượng các chất bảo vệ thực vật

- Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác)

Định lượng là quá trình xác định hàm lượng của một hoặc nhiều chất có trong dược liệu thông qua các phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Quá trình này không chỉ bao gồm việc đo lường hàm lượng chất béo và tinh dầu, mà còn xác định hoạt lực của các chất bằng các phép thử sinh học.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

ĐỐI TƯỢ NG NGHIÊN C Ứ U

Cây Sâm vũ diệp, có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được trồng tại huyện Sa Pa, Lào Cai và thu hoạch vào ngày 15/07/2016 Mẫu cây này đã được giám định bởi ThS Nguyễn Quỳnh.

Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (DL -

150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu

Thân rễ sâm vũ diệp có đặc điểm nhiều đốt và vết sẹo, với hình dáng cong ngoằn ngoèo, dài từ 7-12 cm và đường kính từ 1,2-1,8 cm Chất liệu của thân rễ này cứng chắc, giòn và dễ bẻ, bề mặt khi bẻ có hình dạng lởm chởm, màu vàng nâu nhạt Sâm vũ diệp toả ra mùi thơm nhẹ, có vị đắng và hơi ngọt.

Để xử lý mẫu thân rễ SVD, trước tiên cần rửa sạch, sau đó để khô và thái lát mỏng Tiếp theo, sấy khô ở nhiệt độ 50°C cho đến khi hàm ẩm đạt dưới 10% Cuối cùng, bảo quản trong túi nilong kín và để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu.

Hình 2.1 Mẫu Sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại

Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng

- Dung môi hóa chất: Methanol (CH3OH), ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), acetonitrile (CH3CN), acid acetic (CH3COOH), nước cất hai lần,… dùng cho phân tích

- Thuốc thử: Acid sulfuric (Meck), acid acetic (CH3COOH) (Meck)

- Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254s (Meck)

- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies,

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic-Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUchi, Thụy Sĩ).

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa – Thụy Sĩ)

- Cân xác định độ ẩm Precisa HA 60

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000ml

- Bình chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Kính hiển vi điện tử

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong…

PHƯƠNG PH ÁP NGHIÊN C Ứ U

Tiêu chuẩn dược liệu SVD được xây dựng dựa trên các tiêu chí chung theo quy định trong DĐVN V tại phụ lục 12.2, bao gồm các yếu tố như mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, tạp chất, định tính và định lượng.

Kiểm tra về hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan và kiểm tra kích thước bằng cách đo.

Mẫu dược liệu SVD được cắt vi phẫu và tẩy sáng bằng dung dịch Cloramin 5 – 10%, sau đó nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylene Các đặc điểm vi phẫu của dược liệu được quan sát thông qua kính hiển vi.

Dược liệu được làm khô rồi nghiển thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch soi, quan sát các được điểm của bột bằng kính hiển vi [4]

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6: cân chính xác khoảng 3g dược liệu đã cắt nhỏ, sấy trong tủ sấy ở 105°C, áp suất thường trong 5 giờ

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8

Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó: m: Khối lượng tro (g)

M: Khối lượng mẫu thử (g) B: Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.6 Tro không tan trong acid

Xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.7:

Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi (nung trong

Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như tro toàn phần

Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.11: Cân khoảng 50g dược liệu dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp

Cân phần tạp chất và tính phần trăm:

Trong đó: a: Khối lượng tạp chất tính bằng gam p: Khối lượng mẫu thử tính bằng gam

Phương pháp sắc ký bản mỏng với điều kiện:

Pha động: Chọn một hệ dung môi đặc trưng cho nhóm saponin sau:

CH3OH-CH3CN-H2O (2:1:1, v/v/v) (Hệ III)

Pha tĩnh: Bản mỏng đế nhôm Silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở nhiệt độ105°C trong 60 phút trước khi dùng

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 10% trong ethanol

+ Dung dịch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10ml methanol : nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký

+ Dung dịch đối chiếu 1: Lấy 1g mẫu bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10ml methanol : nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử

+ Dung dịch đối chiếu 2: Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn trong methanol đểđược dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml

Trên bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở 105°C trong 60 phút, tiến hành chấm riêng biệt mỗi 5 µl cho từng dung dịch thử và các dung dịch đối chiếu Sắc ký được thực hiện theo DĐVN V, phụ lục 5.4, cho đến khi hệ dung môi triển khai khoảng 8 cm Sau khi lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi, tiến hành phun thuốc thử và sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút Cuối cùng, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại UV 365 nm và ánh sáng thường.

Kết quả cho thấy sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu đã được chụp ảnh và lưu giữ Các giá trị hệ số di chuyển (Rf) của stipuleanosid R2 đã được ghi nhận.

16 vết chính được tính bằng tỷ số giữa đường đi của các vết đó trên đường đi của pha động

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo DĐVN V, phụ lục 5.3 a) Xây d ựng phương pháp

Chuẩn bị dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch thử bằng cách cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu và cho vào bình tam giác dung tích 100 ml Tiếp theo, thêm chính xác 50 ml hỗn hợp methanol và nước với tỷ lệ 70:30, sau đó cân và siêu âm trong 30 phút Để nguội dung dịch, bổ sung bằng hỗn hợp dung môi trên lượng đã mất, và cuối cùng lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 μm để thu được dung dịch thử dùng cho sắc ký.

Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol với các nồng độ chính xác là 18,75 àg/ml, 37,5 àg/ml, 75 àg/ml, 150 àg/ml, 200 àg/ml, 300 àg/ml và 400 àg/ml.

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:

Dựa trên tài liệu tham khảo và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD.

Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo

Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau

Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector

UV, FLD và DAD là các phương pháp quan trọng giúp phát hiện chất phân tích hiệu quả, đồng thời mang lại sự tiện lợi trong quá trình phân tích và phù hợp với điều kiện làm việc tại phòng thí nghiệm.

Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất

17 b)Th ẩm định và đánh giá phương pháp

Thẩm định các điều kiện định lượng một saponin chính trong thân rễ

SVD được áp dụng để phân tích chất đối chiếu đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích Quy trình này được đánh giá theo hướng dẫn từ các tài liệu [5-7,25] thông qua việc khảo sát các chỉ tiêu như độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng nhận diện rõ ràng chất cần phân tích trong sự hiện diện của các tạp chất hoặc các chất cản trở khác.

Sắc ký đồ cho các mẫu thử cho thấy thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưutương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Độtương thích hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống phân tích được xác định bởi độ chính xác của thiết bị, thông qua việc thực hiện nhiều phép đo lặp lại trên cùng một mẫu đã được xử lý.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại thời gian lưu cùng diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được thể hiện qua giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.

Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 % Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính trong phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà tại đó có mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) Mối quan hệ này được thể hiện qua phương trình y = ax + b cùng với hệ số tương quan tuyến tính R².

Để xác định nồng độ chất cần phân tích, hãy chuẩn bị một dãy chất đối chiếu với 6 mẫu có nồng độ tăng dần Tiếp theo, xác định mối quan hệ tuyến tính giữa đáp ứng của pic và nồng độ chất trong mẫu thử thông qua phương trình hồi quy tuyến tính.

Mô t ả

Dược liệu SVD có thân rễ dài từ 7-12 cm, đường kính từ 0,5-1,5 cm, với nhiều đốt cong queo Mặt ngoài thân rễ có màu nâu, nhăn nheo và có các vết vân ngang rõ ràng, chia thành nhiều đốt Chất liệu của thân rễ cứng chắc, giòn, dễ bẻ, với mặt bẻ có màu vàng nâu nhạt Dược liệu này có mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị đắng và hơi ngọt.

Vi ph ẫ u

Lớp bần bao gồm 5 - 6 hàng tế bào hình chữ nhật, có hình dạng hơi cong và màu lục, trong khi lớp ngoài thường bị bong rách Mô mềm của vỏ cây bao gồm những tế bào hình nhiều cạnh, dày lên ở góc, chứa nhiều ống tiết và tinh thể canxi oxalat hình cầu gai.

Các bó libe-gỗ được xếp riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm và được phân cách bởi các tia ruột rộng Gỗ bao gồm những tế bào thành dày, nằm trong mô mềm gỗ hóa gỗ.

Tầng phát sinh libe-gỗ, nằm giữa libe cấp hai và gỗ cấp hai, bao gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật với màng mỏng, được sắp xếp theo một dãy đều đặn.

Tia ruột rô ̣ng gồm nhiều tế bào xếp theo hướng xuyên tâm

Ruột cấu tạo bởi các tế bào tạo ra những khoảng gian bào và ống tiết, nằm ở vị trí giữa các bó libe gỗ, có mặt cả ở phía trong lẫn phía ngoài.

Soi b ộ t

Màu vàng nâu, dưới kính hiển vi, xuất hiện những hạt tinh bột hình bầu dục với kích thước không đồng đều, trong đó hạt là một vạch Mảnh bần có các tế bào hình nhiều cạnh, thành dày màu vàng nâu, trong khi mảnh mô mềm chứa các tế bào màng mỏng màu trắng Mảnh mạch vạch và mạch mạng có sự hiện diện của chất tiết màu nâu đen, cùng với tinh thể canxi oxalat hình cầu gai.

Bần Mô mềm Mô mềm chứa tinh bột

Mảnh mạch Đám tinh bột Chất tiết Tinh thể calci oxalate

Độ ẩ m

Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu dược liệu SVD theo phương pháp mục 2.2.4, kết quả thu được ở bảng 2:

Bảng 3.1 Kết quảxác định độẩm của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm ẩm (% )

Độ ẩm trung bình của các mẫu dược liệu SVD là khoảng 8,17%, nằm trong ngưỡng an toàn theo quy định của DĐVN Để ngăn ngừa tình trạng dược liệu bị mốc do độ ẩm, quy định yêu cầu hàm ẩm của dược liệu SVD không vượt quá 10%.

Tro toàn ph ầ n

Tiến hành xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu kết quả được trình bày tại bảng 3:

Bảng 3.2 Kết quảxác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro toàn phần (% )

Từ bảng trên, tỷ lệ tro toàn phần trung bình của dược liệu SVD là 7,53%, với mẫu cao nhất đạt trên 7,8% Do đó, quy định về tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu không được vượt quá 8%.

Tro không tan trong acid

Sau khi thực hiện theo hướng dẫn ở mục 2.2.6, chúng tôi đã xác định được độ tro không tan trong acid của các mẫu dược liệu SVD, và kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 4.

Bảng 3.3 Kết quảxác định độ tro không tan trong acid của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro không tan trong acid (%)

Kết quả phân tích cho thấy độ tro không tan trong acid trung bình của ba mẫu dược liệu SVD đạt 1,57% Theo dự kiến, quy định về độ tro không tan trong acid của dược liệu SVD không được vượt quá 2,0%.

Đị nh tính

Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.8

Kết quả quan sát dưới ánh sáng thường cho thấy sắc ký đồ bản mỏng của dung dịch thử (I) phải có các vết cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (II) Đồng thời, cần có một vết ở khoảng Rf 0,3 đến 0,5 có cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch chất chuẩn stipuleanosid R2 (III) như thể hiện trong Hình 6.

Hình 3.3 Sắc ký đồTLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp (Ký hiệu: I: mẫu thử; II: mẫu dược liệu SVD đối chiếu; III: stipuleanosid R2)

Định lượ ng

Chương trình được thực hiện theo phương pháp do nhóm nghiên cứu của thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy phát triển, bao gồm việc khảo sát và lựa chọn điều kiện xác ký.

Chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:

- Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector UV: bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết

- Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B)

Pha động được rửa giải theo chương trình như sau:

Bảng 3.4 Chương trình dung môi

25-30 20 80 Đẳng dòng b) Th ẩm định phương pháp phân tích

Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH

Để pha dung dịch mẫu thử, cân chính xác khoảng 0,1 g cao ethanol thân rễ sâm vũ diệp (độ ẩm 4,7%) và cho vào bình định mức 10 ml Thêm 7 ml methanol, lắc siêu âm trong 10 phút để hòa tan, sau đó thêm methanol đủ để đạt vạch định mức Lắc đều, ly tâm để lấy dịch chiết và lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Pha dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2 bằng cách cân chính xác khoảng 1,0 mg chất này và hòa tan trong methanol để đạt nồng độ 1000 μg/mL Sau khi siêu âm trong 10 phút, ly tâm để thu dịch chiết và lọc qua màng lọc 0,45 μm Tiếp theo, pha loãng dung dịch chuẩn gốc với methanol để tạo ra các dung dịch có nồng độ phù hợp cho việc xây dựng dãy dung dịch chuẩn.

Tính thích hợp hệ thống

Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần, thực hiện sắc ký và ghi lại các sắc ký đồ để xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic và hệ số đối xứng Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21%, tất cả đều thấp hơn 3% (Bảng 6), chứng tỏ các điều kiện sắc ký đã được thiết lập một cách chính xác.

26 lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp

Bảng 3.5 Tính thích hợp của hệ thống

STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối

Tiến hành sắc ký các mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích đã nêu Ghi nhận sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả thu được được trình bày trong hình 7.

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Kết quả phân tích cho thấy sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện đỉnh (pic) tại thời gian lưu tương ứng với stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn Tuy nhiên, sắc ký đồ của dung dịch thử lại cho thấy một đỉnh có thời gian lưu phù hợp với stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, cho thấy độ tuyến tính của phương pháp phân tích.

Mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch được mô tả bởi phương trình y = 2,6081x + 49,1185, với hệ số tương quan R² = 0,9988 Trong khoảng nồng độ từ 15,625 đến 400 µg/ml, có sự tương quan chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2, cho thấy độ tin cậy cao trong kết quả nghiên cứu.

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2

(àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 Độđúng

Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp cho độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu Sâm vũ diệp Kết quả được trình bày ở bảng 8 với phương trình y = 2.6081x + 49.1185 và hệ số xác định R² = 0.9988.

Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2

Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi

STT Lượng có sẵn (àg)

Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích HPLC cho đến khi tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ có tỉ lệ S/N đạt khoảng từ 2-3, với S là chiều cao pic của chất phân tích và N là chiều cao tín hiệu nhiễu lớn nhất Nồng độ xác định được chính là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp đối với chất phân tích.

Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD

= 1,953 àg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 àg/ml

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp được xây dựng có khả năng phát hiện và định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp một cách tương đối chính xác.

Ta có sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 và của dược liệu SVD (Hình 9)

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu

Kết quả định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các mẫu SVD được trình bày tại bảng 9:

Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử dao động từ 0,332 % đến 0,338 %, với giá trị trung bình là 0,335 % ± 0,003 Theo tiêu chuẩn SVD, hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu không được thấp hơn 0,3 %.

Bàn lu ậ n

Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu dược liệu có tên khoa học đã được xác định, thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào năm 2016 Để đạt được kết quả tốt hơn, cần tiến hành quan sát trên nhiều mẫu thu hái từ các vùng khác nhau.

3.9.2 Về khảo sát các chỉ tiêu theo quy định trong Dược điển Việt Nam

Khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu, các chỉ tiêu như độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần và tỷ lệ tro không tan trong acid được đánh giá là những chỉ số quan trọng để xác định chất lượng của dược liệu SVD trước khi sử dụng Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và kinh phí, một số chỉ tiêu như tạp chất lẫn, tỷ lệ vụn nát, hàm lượng kim loại nặng và hàm lượng chất có thể chiết xuất bằng dung môi như nước hay ethanol chưa được thực hiện.

3.9.3 Vềđịnh tính Định tính chúng tôi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong ethanol khi hơ nóng bản mỏng đã xuất hiện các vết chất có cùng khoảng Rf và màu sắc tương đồng, chứng tỏ sự hiện diện của stipuleanosid R2 Nghiên cứu đã đề xuất hệ dung môi thích hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD thông qua phương pháp SKLM.

Chúng tôi đã xác định được hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu SVD thu hái ở Sa Pa bằng phương pháp HPLC

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử dao động từ 0,332 % đến 0,338 % Điều này xác nhận rằng giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD theo tiêu chuẩn không được phép thấp hơn 0,3 %.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đềra như sau:

Đã tiến hành khảo sát các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ theo quy định trong DĐVN V Các tiêu chí bao gồm mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, cũng như các phương pháp định tính và định lượng.

- Khảo sát, xây dựng được quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2

Nghiên cứu này là bước đầu quan trọng trong việc hoàn thiện tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD của DĐVN Dựa trên kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu đã đề xuất dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD, bao gồm các chỉ tiêu quan trọng như độ ẩm không quá 10,0%, tro toàn phần không quá 8,0%, tro không tan trong acid không quá 2,0%, và hàm lượng stipuleanosid R2 không được thấp hơn 0,3%.

1.Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD

2 Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu SVD trong Dược điển Việt Nam

3 Đề xuất thầm định tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD.

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và Nguyễn Thượng Đông cùng cộng sự đã biên soạn cuốn sách "Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam" (2003), tập 2, xuất bản bởi Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, trang 711 – 714, cung cấp những thông tin quý giá về các loại cây thuốc và động vật có khả năng chữa bệnh tại Việt Nam.

[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 285-

[3] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr 85 – 87

[4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học

[5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích

Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc

[6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113,

[7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn ThịThu Hương

(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 326 – 338

[8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr 19-58

[9] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 464 - 466

[10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh

(2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200

[11] Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis

Ha et Grushv Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr 25-27

Trần Công Luận (2002) đã thực hiện một nghiên cứu phân tích thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai loại cây sâm là sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) Nghiên cứu này thuộc đề tài cấp Bộ, cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng dược liệu của hai loài cây này.

[13] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp

(Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr 17-23

Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2013) đã trình bày trong hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, rằng họ nhân sâm (Araliaceae Juss.) là nguồn cung cấp hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng tại Việt Nam.

[15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền và Lê Thanh Sơn (2006) đã khảo sát sự phân bố và sinh thái của sâm vũ diệp và tam thất hoang tại Việt Nam, được công bố trong Tạp chí dược liệu, số 11(5), trang 177-180 Kết quả nghiên cứu cung cấp cái nhìn sâu sắc về môi trường sống và tiềm năng phát triển của hai loại dược liệu quý này.

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy và các cộng sự (2018) tập trung vào thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai Kết quả nghiên cứu được công bố trên Tạp chí Dược liệu, cho thấy sự đa dạng và giá trị dược lý của loại sâm này Nghiên cứu này không chỉ góp phần làm phong phú thêm kiến thức về sâm vũ diệp mà còn mở ra hướng đi mới cho việc khai thác và sử dụng nguồn dược liệu quý giá này.

Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006) đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng của sâm Việt Nam đối với trí nhớ thông qua việc xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động Nghiên cứu này được công bố trong Tạp chí Dược liệu, số 11(5), trang 202-206.

Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005) đã nghiên cứu các tác dụng dược lý của lá sâm Việt Nam, đặc biệt là tác dụng chống stress và tác dụng chống oxy hóa Kết quả nghiên cứu được công bố trong Tạp chí Dược liệu, số 10(1), trang 27-32.

[20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp

[21] Gurung B, Bhardwaj PK et al (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp 234-238

[22] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420

[23] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al

(1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599

[24] Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636

[25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva

[26] Zhang Y, Shi C et al (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus

Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp 79-87

PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA

PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP

Sâm vũ diệp (thân rễ)

Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất

Thân rễ đã phơi và sấy khô của cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), ho ̣ Nhân sâm (Araliaceae)

Thân rễ thường có nhiều đốt, cong ngoằn ngoèo, dài từ 7-12 cm và đường kính từ 0,5-1,5 cm Mặt ngoài của thân rễ có màu nâu, với các vết nhăn do đục, mảnh và các vết vân ngang nổi rõ, chia thân rễ thành nhiều đốt Bề mặt có nhiều sẹo do thân khí sinh hàng năm tàn lụi để lại Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, với mặt bẻ lởm chởm và màu vàng nâu nhạt Mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị đắng và hơi ngọt.

Tiêu đề	Xây Dựng Tiêu Chuẩn Cơ Sở Dược Liệu Sâm Vũ Diệp (Panax Bipinnatifidus)
Tác giả	Nông Mỹ Hoa
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,03 MB