TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Panax L
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L có vị trí phân loại như sau:
Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax L
1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L
Grushv., và P wangianus S C Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ
1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon
1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L
1.1.5.1 Nhâm sâm (Panax ginseng C.A Mey)
1.1.5.2 Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen) (Sanchi ginseng )
Tam thất mang lại nhiều tác dụng sinh học đa dạng Dịch chiết saponin từ Tam thất có khả năng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim mạch.
1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) là hai loài cây quý thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm (Araliaceae), được tìm thấy tự nhiên ở vùng núi phía bắc Việt Nam Hiện nay, hai loài này đang thu hút sự quan tâm trong việc phát triển trồng trọt Tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chúng vẫn còn hạn chế.
Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem
Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)
Về thành phần hóa học:
Theo các kết quả nghiên cứu, các saponin là thành phần chính của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang a Sâm vũ diệp
Tổng quan về gốc tự do
Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [18]
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
ROS được xem là nguyên nhân chính gây tổn thương mô, nhưng sự cân bằng giữa sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể giúp kiểm soát quá trình oxy hóa Khi mất cân bằng nghiêm trọng, sự gia tăng sản sinh ROS dẫn đến stress oxy hóa, từ đó gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh.
Các ROS và RNS được hình thành tự nhiên trong quá trình trao đổi chất và ảnh hưởng của chúng đến cơ thể phụ thuộc vào nồng độ Ở nồng độ thấp, ROS và RNS đóng vai trò như các tín hiệu quan trọng.
• Điều hòa phân ly tế bào
• Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm
Điều hòa biểu hiện gen mã hóa enzym chống oxy hóa có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào Khi nồng độ cao của ROS và RNS xuất hiện, chúng có thể oxy hóa các đại phân tử sinh học, dẫn đến tổn thương tế bào.
1.2.3 Stress oxy hóa 1.2.3.1 Khái niệm
1.2.3.2 Ảnh hưởng của stress oxy hóa
Stress oxy hóa liên quan đến nhiều bệnh tim mạch, do quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) gây ra sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu nội mô, đây là giai đoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao và các bệnh tim mạch khác Ngoài ra, stress oxy hóa cũng là nguyên nhân dẫn đến đột quỵ, nhồi máu cơ tim và bệnh tiểu đường.
Stress oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh ung thư liên quan đến tuổi Các chất hoạt động như ROS và RNS gây stress oxy hóa có khả năng phá hủy DNA, dẫn đến đột biến và cản trở quá trình phân chia tế bào, từ đó thúc đẩy sự phát triển, xâm lấn và di căn của tế bào khối u Ngoài ra, nhiễm Helicobacter pylori làm tăng sản xuất ROS và RNS trong dạ dày, góp phần vào sự phát triển của ung thư dạ dày.
1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 1.2.4.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH
1.2.4.2 Phương pháp đánh giá sự khử màu của 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)
Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánh giá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu
1.2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl
Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan
Enzym Acetylcholinesterase (AChE), còn được gọi là acetylhydrolase, là cholinesterase chính trong cơ thể, đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy acetylcholin và một số ester cholin khác, hoạt động như chất dẫn truyền thần kinh AChE chủ yếu được tìm thấy tại các khớp nối thần kinh cơ và trong hệ cholinergic.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE [24]
1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
1.3.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm
1961 [19] Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Dựa trên phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, một phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển Trong phương pháp này, sau khi triển khai bản mỏng, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym Các chất gây ức chế AChE sẽ tạo ra các vết màu trắng trên nền vàng.
1.3.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Sâm vũ diệp cao giàu saponin Mẫu nghiên cứu thân rễ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng 3 -
2016 và được giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu
Cao chiết Sâm vũ diệp giàu saponin được tiến hành tại khoa Y – Dược, ĐHQGHN, do TS Nguyễn Hữu Tùng cung cấp
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Cao chiết Tam thất hoang phân đoạn giàu saponin được tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dược liệu, do PGS.TS Đỗ Thị Hà cung cấp
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang
Bột thô tam thất hoang
Cô dưới áp suất giảm
- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
- Sấy chân không tại 55-60 o C, 24 h Kiểm tra TLC Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở
Dung môi, hóa chất
• 1, 1-Diphenyl –2-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck), L-acid ascorbic (Merck)
• Enzym acetylcholinsterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore), Acetylthiocholine iodide (ACTI) (Sigma, Singapore); 5,5’-dithiobis- (2- nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore), Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ)
- Dung môi: MeOH (Merck), DMSO 100% (Merk), nước cất.
Máy móc, dụng cụ
- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal
- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ
- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg
- Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ)
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin
❖ Nguyên tắc của phương pháp
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đo ở bước sóng 517 nm (hình 2.3) [42]
Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dịch thể hiện tác dụng chống oxy hóa trong phương pháp DPPH
❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro
Tiến hành pha dung dịch DPPH, dung dịch mẫu thử, mẫu mẫu chứng ở nồng độ thí nghiệm
- Pha dung dịch DPPH: cân chính xác 24 mg DPPH, pha trong 100 ml methanol, thu được dung dịch có nồng độ 0,6 mM
Dung dịch thử của Tam thất hoang tiến hành tương tự như trên
Để xác định dung dịch làm việc (mẫu chuẩn), hòa tan dung dịch DPPH 0,6 mM trong MeOH nhằm thu được dung dịch có độ hấp thụ quang khoảng 0,98 ± 0,02 tại bước sóng 517 nm.
Thêm 100 µl dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng với các nồng độ khác nhau vào 3 ml dung dịch làm việc đã xác định trước Sau đó, ủ hỗn hợp này trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đo độ hấp thụ quang dung dịch tại bước sóng 517 nm
- Sử dụng MeOH là mẫu trắng
Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần
Phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức:
𝐴 𝑐 là độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn
𝐴 𝑠 là độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu thử/ chứng
2.4.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
❖ Nguyên tắc của phương pháp:
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
❖ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro
Tiến hành pha đệm Natri phosphat pH 8, pha enzym dạng đông khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử và mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm
➢ Pha dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: hòa tan 31,2g
Na𝐻 2 P𝑂 4 2𝐻 2 O trong 1000 ml nước cất (dung dịch a)
➢ Pha dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: hòa tan 71,6 g
𝑁𝑎 2 HP𝑂 4 12𝐻 2 O trong 1000 ml nước cất (dung dịch b)
➢ Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất, định mức trong bình định mức 1000ml
➢ Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M
➢ Pha dung dịch mẫu thử:
Dung dịch thử Tam thất hoang cao giàu saponin được tiến hành tương tự như trên
- Thờm lần lượt 50 àl dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 àl dung dịch ACTI 2,5 mM vào hỗn hợp trên Sau đó, trộn đều và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 412 nm
- Mẫu chuẩn: được tiến hành như trên nhưng không cho dung dịch thử hoặc chứng
- Mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat
Mỗi nồng độ của một mẫu thử được lặp lại thí nghiệm 2 lần
Phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế (% I) được tính theo công thức:
%I: phần trăm hoạt tính enzym AChE bị ức chế
𝐴 𝑐 : độ hấp thu quang của mẫu chuẩn
𝐴 𝑠 : độ hấp thu quang của mẫu thử/ mẫu chứng
2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu
Sai số giữa các lần đo của cùng một mẫu thử được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn (SD)
Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức:
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
𝑥 𝑖 là giá trị đo được lần thứ i 𝑥̅ là giá trị trung bình các lần đo n là số lần đo
Dữ liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích bằng phương pháp thống kê phổ biến trong sinh học, sử dụng phần mềm SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc, Mỹ).
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả thực nghiệm
Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C
Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số
Bảng 3.2 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin
Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa (%) Sai số
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 3.3 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin
Nồng độ (mg/ml) % chống oxy hóa Sai số
Sâm vũ diệp cao giàu saponin Tam thất hoang cao giàu saponin
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao giàu saponin
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của vitamin C
Bảng 3.4 Giá trị IC 50 chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong phương pháp DPPH
Sâm vũ diệp cao giàu saponin 18,000 Tam thất hoang cao giàu saponin 31,620
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang được thể hiện trong bảng 3.5, 3.6, 3.7 và hình 3.3
Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin
Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym
Giỏ trị IC 50 = 1,454 àg/ml
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE in vitro của berberin
Bảng 3.6 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin
Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym
Bảng 3.7 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in vitro của Tam thất hoang cao giàu saponin
Nồng độ (àg/ml) % Hoạt tớnh enzym
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bước đầu thí nghiệm cho thấy Sâm vũ diệp cao giàu saponin và Tam thất hoang cao giàu saponin chưa thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE.
Bàn luận
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng giá trị IC 50 chống oxy hóa của cao giàu saponin từ Sâm vũ diệp và Tam thất hoang lần lượt là 18.000 mg/ml và 31.620 mg/ml Điều này cho thấy tác dụng chống oxy hóa của hai loài này không quá vượt trội So sánh với các nghiên cứu trước đó, kết quả này cho thấy cần phải tiếp tục đánh giá và nghiên cứu thêm về tác dụng chống oxy hóa của hai loài thực vật này.
2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát tác dụng chống oxy hóa của
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
26] Khi đó, kết quả về tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết thực vật có thể sẽ cao hơn khi sử dụng phương pháp này
3.2.2 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Các loài thực vật chứa saponin đã được biết đến với nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe, bao gồm chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, cải thiện nhận thức và giảm đau Saponin cũng có tác dụng bảo vệ thần kinh trong các bệnh như Alzheimer, Parkinson và rối loạn tiểu não Một số saponin, như ginsenoside, xanthocerasid và panaxatriol saponin, đã được báo cáo có khả năng bảo vệ thần kinh Ginsenosid K, một hợp chất chuyển hóa của saponin, cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc cải thiện suy giảm trí nhớ trên chuột Ngoài ra, ginsenosid Rg1 và Rb1 có khả năng tăng cường độ bền của dây thần kinh, mang lại giá trị lớn cho việc điều trị bệnh Alzheimer và các rối loạn liên quan đến mất tế bào thần kinh.