Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Hoàng liên ô rô_1208633

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 IV KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng tiêu chí tiêu chuẩn dược liệu Tam thất hoang gồm tiêu: mô tả, hàm ẩm, độ tro, định tính, định lượng Kết nghiên cứu bước đầu đề xuất giới hạn cần đạt tiêu chuẩn dược liệu Tam thất hoang: hàm ẩm không 13%, độ tro không 8%, định tính dược liệu phải có acid oleanolic hàm lượng AO không thấp 1% Chỉ tiêu mô tả, vi phẫu, bột phải giống mô tả Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Tam thất hoang giúp kiểm soát tốt chất lượng dược liệu thị trường trồng trọt, thu hái, góp phần nâng cao giá trị dược liệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y Tế, 2009 Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất Y học, tr 348-349 Nguyên Thi Thu Hương, Trần Công Luận, Nguyên Tập, 2009 Nghiên cứu số tác dụng dược lý Tam thất hoang Panax stipuleanatus Tsai et Feng, họ Araliaceae Tạp chí Dược liệu, 14(2): 99103 Trần Cơng Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyên Tập, 2009 Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài Sâm vũ diệp Tam thất hoang Tạp chí Dược liệu, 14(1): 17-23 Liang C, 2010 Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20: 7110-7115 Liang C, 2013 Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-kB Journal of Ginseng Research, 37(1): 7479 Establishment of baseline standards for medicinal herb (Panax stipuleanatus) Nguyen Quang Vinh, Nguyen Thi Phuong, Bui Tuan Anh, Tran Van Tu,Vu Thi Hai, Le Huy Cong Abstract The baseline standards for medicinal herb (Panax stipuleanatus) were established based on: Morpological characterization, microsurgery, powder, moisture, total ash, impurities The research results showed that Panax stipuleanatus was curvy, scattered into several installments, each 3-10 cm long, 0.3-1.0 cm diameter The outer surface was brown or yellowish-gray, with slim lines, fragments, slight odor, bitter taste, and slightly sweet taste Vascular surgery consisted of to 10 layers in rectangular shapes, stacked over equally Soft shell contained many starch granules, occasionally appeared tubes containing the resin and crystalline calcium oxalate which is spherical hemisphere Libe - the wood packs in a bunch directed to the core; Very few wood circuit Powder was light brown, tasting slight sweet Grain starch was round or multi-edged Moisture content is not more than 13%, ash content is not more than 8%, qualitative pharmaceutical materials must contain oleanolic acid and AO content is not less than 1% This research contributes to good quality control and enhances the value of Panax stipuleanatus Key words: Panax stipuleanatus, medicinal baseline standards, characterization, microsurgery Ngày nhận bài: 18/6/2017 Ngày phản biện: 29/6/2017 Người phản biện: PGS TS Nguyễn Thị Bích Thu Ngày duyệt đăng: 27/7/2017 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU HỒNG LIÊN Ơ RƠ Nguyễn Quang Vĩnh1, Nguyễn Thị Phương2, Bùi Tuấn Anh1, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 Trần Văn Tú1, Vũ Thị Hải1, Lê Huy Cơng1 TĨM TẮT Tiêu chuẩn sở cho dược liệu Hồng liên rơ xây dựng gồm: Mơ tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần Kết nghiên cứu cho thấy dược liệu Hoàng liên rơ, thân hình trụ, màu vàng nhạt đường kính khoảng 0,5-2 cm, vỏ thân bề mặt sần sùi Vi phẫu thân thấy có lớp bần gồm - lớp tế bào thành dày hình thoi, hình đa giác, xếp nhau, chứa nhiều đám sợi đám tế bào mô cứng; Vùng libe dày; Tia ruột xuyên từ libe vào đến hết mạch gỗ, tia ruột vùng libe chứa tinh thể canxi oxalat hình thoi, hình lăng trụ Mô mềm ruột chiếm phần lớn thiết diện thân, gồm tế bào hình đa giác thành dày hóa cellulose phần Hàm ẩm khơng q 12 %, độ tro khơng q %, định tính dược liệu phải có berberin chlorid hàm lượng berberin chlorid khơng thấp 0,5% Nghiên cứu góp phần kiểm soát tốt chất lượng nâng cao giá trị dược liệu Hồng liên rơ Từ khóa: Hồng liên rơ, tiêu chuẩn sở dược liệu, mơ tả, vi phẫu Vườn Quốc gia Hồng Liên, Viện Dược liệu I ĐẶT VẤN ĐỀ Hồng liên rơ có tên khoa học Mahonia nepalensis DC, cịn có tên gọi khác Thích hồng liên, Hồng bá gai, phân bố vùng ơn đới ấm cận nhiệt đới châu Á, bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ số nước vùng Trung Á Ở Việt Nam, Hồng liên rơ thuốc thuộc diện quý hiếm, thường có tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai (Đỗ Tất Lợi, 2001) Bộ phận dùng Hồng liên rơ lá, thân, rễ Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Hồng liên rơ có vị đắng, tính mát, có tác dụng nhiệt phế, vị, can, thận Quả lợi tiểu làm dịu kích thích Ở Việt Nam, dược liệu Hồng liên rơ vốn biết đến vị thuốc dùng để chữa bệnh kiết lỵ, tiêu chảy, viêm ruột, ăn uống không tiêu, vàng da, đau mắt, mẩn ngứa, ho lao (Bộ Giáo dục-Đào tạo Bộ Y tế, 2006; Đỗ Huy Bích ctv., 2006) Về thành phần hóa học, thành phần hố học dược liệu Hồng liên ô rô chủ yếu alkaloid berberin, palmatin, berbamin, jatrozzhizin, magnoflorin, oxyacanthin,… (Cao Thùy Hương ctv., 2009; Shion-Jane Lin et al., 1996).) Trong đó, berberin thành phần chính, chiếm từ 0,35 đến 2,5 % phận thân Hồng liên rơ Dược liệu nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất hợp chất berberin chlorid Trong tự nhiên, Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC) mọc vùng núi Hoàng Liên Sơn (Sa Pa), lồi thuốc có nhiều giá trị, cơng dụng tốt có nguy tuyệt chủng cao Mặc dù dược liệu quí, Hồng liên rơ chưa đưa vào Dược điển Việt Nam Vì vậy, để góp phần hồn thiện nghiên cứu lồi nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cở sở cho dược liệu Hồng liên rơ tiến hành II.VẬT LIỆU VÀ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG 2.1 Vật liệu nghiên cứu PHÁP - 2.3 Phương pháp nghiên cứu Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Hồng liên rơ dựa tiêu chung qui định dược điển Việt Nam gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro tồn phần, định tính, định lượng,… (Bộ Y tế, 2009) Mô tả: Mô tả cảm quan, kiểm tra kích thước cách đo Vi phẫu, bột: Phương pháp hiển vi, thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.18 Hàm ẩm: Phương pháp cân, thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 Độ tro: Thử theo DĐVN IV, Phụ lục 9.8 Định tính: Berberin, palmatin phương pháp sắc ký lớp mỏng + Bản mỏng: Silica gel 60F khai triển:nButanol:acid 25 (Merck); Dung môi (7:1:2) Các mẫu dược liệu thân Hồng liên rơ thu hái vườn Quốc gia Hồng Liên 2.2 Hóa chất-thuốc thử Các dung mơi, hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (PA) Các dung mơi dùng cho phân tích sắc ký (TLC, HPLC) mua hãng Merck (hoặc tương đương) Chất chuẩn berberin clorid palmatin clorid hãng Sigma-Aldrich, độ tinh khiết đạt 98,0% acetic:nước + Dung dịch thử: Cân khoảng 0,2 g thân, rễ Hồng liên rơ xay nhỏ cho vào bình cầu dung tích 50 ml, có nút nhám, thêm 20 ml dung môi methanol chứa acid chlohydric 2% (TT), đun hồi lưu cách thủy nhiệt độ 70oC Để nguội bình cầu nhiệt độ phịng, lọc lấy dịch chiết Cơ dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn ml methanol (TT), lọc, thu dung dịch thử + Dung dịch đối chiếu 1: Dung dịch berberin chlorid 0,05 mg/ml methanol (TT) Dung dịch palmatin chlorid 0,05 mg/ml methanol (TT) + Dung dịch đối chiếu 2: Cân khoảng 0,2 (g) Hoàng liên ô rô (mẫu chuẩn), tiến hành chiết dung dịch thử + Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 μl dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau khai triển, mỏng để bay hết dung mơi nhiệt độ phịng Quan sát mỏng đèn tử ngoại UV 366 nm - Định lượng: Định lượng berberin chlorid phương pháp sắc ký lỏng + Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ thời gian lưu diện tích pic pic berberin chlorid tương ứng Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính mơ tả phụ thuộc nồng độ dung dịch chuẩn berberin chlorid (mg/ml) diện tích pic tương ứng theo phương trình y = ax + b + Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ thời gian lưu diện tích pic pic có thời gian lưu với pic berberin chlorid chuẩn Tính nồng độ C (mg/ml) berberin chlorid dung dịch thử (mg/ml) dựa phương trình hồi quy µl - Hàm lượng (%) berberin chlorid có mẫu thử (tính theo khối lượng khơ kiệt) tính theo công thức: X (%) = C ˟ 50 ˟ 100 ˟ P 1000 ˟ m ˟ (100 – b) Trong đó: C nồng độ berberin clorid dung dịch mẫu thử (mg/ml); m: khối lượng mẫu thử đem phân tích (g) ; b: độ ẩm mẫu thử (%); P: độ tinh khiết berberin clorid chuẩn (%) 2.4 Thời gian đia điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực thực từ tháng 8/2017 đến tháng 11/2017 Vườn Quốc gia Hoàng Liên Viện Dược liệu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mô tả dược liệu Hồng liên rơ Thân hình trụ, màu vàng nhạt đường kính khoảng 0,5 - cm, vỏ thân bề mặt sần sùi, mang vế tích cịn sót lại Hình Hình ảnh dược liệu Hồng liên rơ 3.2 Vi phẫu dược liệu Hồng liên ô rô Vi phẫu thân: Thiết diện cắt ngang thân Hồng liên rơ hình trịn, quan sát từ ngồi vào gồm: Bần gồm - lớp tế bào thành dày, xếp Lớp bần thứ cấp gồm nhiều tế bào hình thoi, hình đa giác kích thước không xếp sát nhau, chứa nhiều đám sợi đám tế bào mô cứng Mô mềm vỏ tế bào thành mỏng chứa nhiều đám sợi, đám tế bào cứng Vùng libe dày, gồm tế bào thành mỏng bị ép bẹp Tia ruột xuyên từ libe vào đến hết mạch gỗ, tia ruột vùng libe chứa tinh thể canxi oxalat hình thoi, hình lăng trụ Mơ mềm ruột chiếm phần lớn thiết diện thân, gồm tế bào hình đa giác thành dày hóa cellulose phần nhạt Tinh thể calci oxalat hình khối hay hình lăng trụ nằm rải rác Hình Vi phẫu cắt ngang thân Hồng liên rơ Bần, Đám sợi, Libe, Tia ruột, Tinh thể canxi oxalat hình lăng trụ, Gỗ, Mơ mềm ruột 3.3 Đặc điểm bột dược liệu Hoàng liên ô rô Bột màu vàng hay vàng nâu, không mùi, vị đắng Quan sát kính Hình Bột dược liệu Hồng liên rơ hiển vi thấy có: Mô mềm tế 1, 2: Tinh thể calci oxalat; 3, 4, 5: Tế bào bào hình chữ nhật hay hình đa giác, cứng; 6, 9: Bó sợi; 7,8: Mơ mềm thành mỏng Rất nhiều tế bào cứng có dạng hình thoi màu vàng, thành dày, 3.4 Kết kiểm tra hàm ẩm mẫu dược liệu Hoàng liên rơ có ống trao đổi rõ Sợi tập trung thành Tiến hành xác định độ ẩm mẫu đám, màu vàng hay màu nâu dược liệu Hồng liên rơ khác kết trình bày bảng TT Bảng Kết xác định độ ẩm mẫu Hoàng liên ô rô Tên mẫu Hàm ẩm (% ) Mẫu Mẫu Trung bình 8,2 ± 0,8 9, ± 0,7 8,66 3.7 Đinh tính Berberin, palmatin phương pháp sắc ký lớp mỏng Tiến hành định tính Berberin, palmatin phương pháp sắc ký lớp mỏng Kết trình bày hình Độ ẩm mẫu dược liệu Hồng liên rơ trung bình 8,66% (Bảng 1) Tiêu chuẩn đề xuất: Hàm ẩm cho Hồng liên rô không 12,0% 3.5 Kết kiểm tra tro tồn phần mẫu dược liệu Hồng liên rơ Tiến hành xác định tro tồn phần mẫu dược liệu mẫu khác kết trình bày bảng TT Bảng Kết xác định tro toàn phần mẫu Hồng liên rơ Tên mẫu Tro tồn phần (%)2.06 ± 0,5 Mẫu Mẫu Trung bình 3,15 ± 0,40 3,06 Theo kết bảng 2, độ tro tồn phần dược liệu Hồng liên rơ nằm khoảng từ 2,06 % đến 3,98 % Tiêu chuẩn đề xuất: Hồng liên rơ qui định độ tro tồn phần khơng q 8,0% 3.6 Tạp chất Tạp chất lẫn dược liệu Hồng liên rơ gồm tất chất qui định dược liệu như: phận khác lá, rễ, Xác định tạp chất mẫu dược liệu, kết trình bày bảng TT Bảng Kết xác định tạp chất mẫu Hồng liên rơ Tên mẫu Hàm lượng % tạp chất 0,10 Mẫu Mẫu 0,10 Hình Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Hồng liên ô rô Ký hiệu: Ber: berberin chlorid; Pal: palmatin chlorid; 1,2,3: Mẫu Hồng liên rơ thử, 4: Mẫu Hồng liên ô rô chuẩn Sắc ký đồ quan sát đèn tử ngoại bước sóng UV 366 nm Từ kết thu hình 4, ta thấy vết sắc ký đồ TLC mẫu dược liệu Hồng liên rơ tách rõ ràng Đặc biệt, quan sát UV 366 nm, vết màu vàng đặc trưng tách rời nhau, vết có màu trùng sắc Rf chất đối chiếu với màu sắc Berberin Rf Trung bình 0,10 Tạp chất mẫu Hồng liên rơ chủ yếu chiếm khơng nhiều trung bình khoảng 0,13% (Bảng 3) Tiêu chuẩn đề xuất: Chuẩn sở Hồng liên rơ qui định tạp chất khơng 1% chlorid (Rf = 0,35) Palmatin chlorid (Rf = 0,30) Cả hai hợp chất alkaloid đặc trưng cho dược liệu Hồng liên rơ Chứng tỏ lựa chọn định tính Berberin, palmatin thích hợp 3.8 Đinh lượng berberin chlorid phương pháp sắc ký lỏng Kết định lượng thành phần berberin clorid mẫu Hồng liên rơ trình bày bảng Bảng Kết hàm lượng berberin chlorid mẫu Hồng liên rơ TT Tên mẫu Mẫu Mẫu Hàm lượng % berberin chlorid 0,52 ± 0,12 0,57 ± 0,08 Bảng cho thấy hàm lượng berberin mẫu thử trung bình 0,54% Tiêu chuẩn đề xuất: Hàm lượng berberin chlorid dược liệu Hồng liên rơ khơng thấp 0,5% tính theo dược liệu khơ kiệt uV mV 350 Detector A Ch2:345nm 900000 800000 300 700000 250 600000 200 500000 150 400000 100 300000 Berberin chlorid 50 Dược liệu Hồng liên rơ 200000 100000 -50 -100 -100000 -150 -200000 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0.0 Berberin chlorid 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 250 Hình Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu dược liệu Hồng liên rơ Với điều kiện phân tích HPLC thu sắc ký đồ HPLC mẫu chất chuẩn Berberin chlorid mẫu dược liệu Hồng liên rơ (Hình 5) Nhận xét thấy, phương pháp xây dựng cho tín hiệu rõ ràng, pic sắc nhọn cân đối, phù hợp cho phép phân tích định lượng Berberin chlorid mẫu dược liệu Hồng liên rơ Vì vậy, phương pháp để xây dựng đường tuyến tính biểu 12000000 y = 75502x Nơng Diện 51892 R² = 10000000 độ tích 0.999 8000000 Berbe pic S 6000000 rin6 (S) 397938 4000000 15 112074 2000000 30 222312 60 440990 50 100 150 200 15 1129489 C (µg/ml) Hình1 Phương trình đường chuẩn xác định Berberin chlorid Trong đó: x nồng độ Berberin chlorid (µg/ml), y giá trị diện tích pic uV(x100,000) 5 1 5 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 diễn phụ thuộc nồng độ Berberin chlorid giá trị diện tích pic sử dụng Quá trình phân tích thực với mẫu chất Berberin chlorid chuẩn (độ tinh khiết 98,0%) Các mẫu phân tích trước tiêm vào hệ thống lọc qua màng cellulose aetat 0,45 μm Mỗi thí nghiệm làm lặp lại lần (Hình 6) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Từ phương trình đường chuẩn trên, xác định hàm lượng Berberin chlorid có mẫu dược liệu Hồng liên rơ IV KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng tiêu chí tiêu chuẩn dược liệu Hồng liên rơ gồm tiêu: Mô tả, hàm ẩm, độ tro, định tính, định lượng Kết nghiên cứu bước đầu đề xuất Hình Sắc ký đồ HPLC phân tích định lượng Berberin chlorid mẫu Hồng liên rơ Mẫu M1, nồng độ dịch chiết 40,08 mg/ml methanol Mẫu chất chuẩn berberin chlorid, nồng độ 0,084 mg/ml methanol Từ kết cho thấy, phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng Berberin chlorid là: y = 75502x - 51892 (R2 = 0,999) giới hạn cần đạt tiêu chuẩn dược liệu Hoàng liên ô rô: hàm ẩm không 12%, độ tro khơng q 8%, định tính dược liệu phải có berberin chlorid hàm lượng berberin chlorid không thấp 0,5% Chỉ tiêu mô tả, vi phẫu, bột phải giống mơ tả Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Hồng liên rơ giúp kiểm sốt tốt chất lượng dược liệu thị trường trồng trọt, thu hái, góp phần nâng cao giá trị dược liệu  ... trình đường chuẩn trên, xác định hàm lượng Berberin chlorid có mẫu dược liệu Hồng liên rô IV KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng tiêu chí tiêu chuẩn dược liệu Hồng liên ô rô gồm tiêu: Mô tả, hàm ẩm,... dược liệu Hồng liên rơ tiến hành II.VẬT LIỆU VÀ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG 2.1 Vật liệu nghiên cứu PHÁP - 2.3 Phương pháp nghiên cứu Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Hồng liên rơ dựa tiêu chung qui định dược. .. toàn phần dược liệu Hoàng liên ô rô nằm khoảng từ 2,06 % đến 3,98 % Tiêu chuẩn đề xuất: Hồng liên rơ qui định độ tro tồn phần khơng q 8,0% 3.6 Tạp chất Tạp chất lẫn dược liệu Hoàng liên ô rô gồm