(Luận văn thạc sĩ) một số đặc tính sinh học của virus cúm a h9n2 phân lập trên đàn gà tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MAI THÙY DƯƠNG MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H9N2 PHÂN LẬP TRÊN GÀ TẠI VIỆT NAM Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Văn Phan PGS.TS Tô Long Thành NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Mai Thùy Dương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn khoa học TS Lê Văn Phan, PGS.TS Tơ Long Thành tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Mai Thùy Dương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis Abstract .xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.4 Những đóng góp đề tài .2 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lược bệnh cúm gia cầm 2.1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 2.2.2 Virus cúm gia cầm 2.2.2.1 Đặc điểm sinh học phân tử virus cúm gia cầm 2.2.2.2 Đặc tính kháng nguyên virus 2.2.2.3 Độc lực virus cúm 2.2.3 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm .10 2.2.3.1 Triệu chứng .10 2.2.3.2 Bệnh tích 11 2.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm 11 2.2.4.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích 11 2.2.4.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 11 2.2 Dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 tình hình nghiên cứu cúm gia cầm A/H9N2 giới 12 2.2.1 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 giới 12 2.2.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm A/H9N2 giới .14 2.3 Dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 tình hình nghiên cứu cúm gia cầm A/H9N2 Việt Nam .17 iii 2.3.1 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 Việt Nam 17 2.3.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm A/H9N2 Việt Nam 18 Phần Nội dung - nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Nội dung nghiên cứu 19 3.2 Địa điểm nghiên cứu 19 3.3 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu .19 3.3.1 Nguyên liệu nghiên cứu .19 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 20 3.3.2.2 Phương pháp mổ khám toàn diện .20 3.3.2.3 Phương pháp phân lập phôi trứng gà 22 3.3.2.4 Xác định số EID50, TICD50 23 3.3.2.5 Phương pháp xác định số độc lực virus (IVPI) .24 3.3.2.6 Phương pháp HA 26 3.3.2.7 Phát virus phản ứng Realtime RT-PCR .26 3.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 28 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Khảo sát lưu hành virus cúm A/H9 số tỉnh Việt Nam 29 4.2 Phân lập giám định virus cúm A/H9N2 số tỉnh Việt Nam 31 4.3 Xác định số đặc tính sinh học virus cúm gia cầm A/H9N2 phân lập gà Việt Nam 33 4.3.1 Đặc tính sinh trưởng phát triển virus phơi trứng gà .33 4.3.2 Đặc tính sinh trưởng phát triển virus tế bào xơ phôi gà (CEF) 35 4.3.3 Đặc tính sinh trưởng phát triển virus tế bào dòng MDCK 37 4.3.4 So sánh khả phát triển virus cúm gia cầm A/H9N2 loại môi trường nuôi cấy 39 4.3.5 Đặc tính thích ứng ổn định virus cúm A/H9N2 môi trường phôi trứng gà 42 4.4 Xác định độc lực virus cúm A/H9N2 phân lập gà Việt Nam 43 4.4.1 Xác định số độc lực qua tiêm tĩnh mạch - IVPI 43 4.4.2 Đánh giá mật độnhiễm virus cúm A/H9N2 quan phủ tạng 46 4.4.3 Đánh giá mức độ thải virus gà gây nhiễm .51 Phần Kết luận kiến nghị 53 iv 5.1 Kết luận .53 5.2 Kiến nghị 53 Các cơng trình cơng bố .54 Tài liệu tham khảo 55 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AAHL (Australian animal health laboratory) Phịng thí nghiệm sức khỏe động vật Úc AI (Avian Influenza) Cúm gia cầm ARN(Ribonucleic acid) Axit ribonucleic CEF (Chicken Embryo Fibroblast) Tế bào xơ phơi gà CPE (Cytopathic effect) Bệnh tích tế bào CSIRO (Commonwealth Scientific & Tổ chức nghiên cứu khoa học công Industrial Research Organization) nghệ Úc EID50(Embryo Infection Dose 50%) Liều gây nhiễm 50% phôi FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Lương thực nông nghiệp Liên hợp quốc FBS (Fetal Bovine serum) Huyết thai bò HA (Haemagglutination assay) Phản ứng ngưng kết hồng cầu HPAI (Highly Pathogenic Avian influenza) Cúm gia cầm độc lực cao LPAI (Low Pathogenic Avian influenza) Cúm gia cầm độc lực thấp MDCK (Mardine Darby Canine Kidney) Tế bào thận chó Madin-Darby NS (Non- Strutural protein) Protein không cấu trúc OIE (Office International des Epzooties) Tổ chức y tế giới PBS (Phosphate Buffered Saline) Dung dịch muối đệm phốt phát rRT-PCR (realtime Reverse Transcriptase – Phản ứng chuỗi Polyme phiên mã ngược Polymerase Chain Reaction) theo thời gian thực TCID50(Tissue Culture Infection Dose 50%) Liều gây nhiễm 50% tế bào vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số liệu tính tốn theo phương pháp Reed-Muench 24 Bảng 3.2.Bố trí thí nghiệm xác định số độc lực virus (IVPI) 25 Bảng 3.3.Trình tự primer probe phát virus cúm gia cầm A/H9N2 27 Bảng 3.4.Hỗn hợp nguyên liệu (Master mix) cho phản ứng RRT-PCR 28 Bảng 4.1.Kết xác định virus cúm A/H9 số tỉnh Việt Nam .29 Bảng 4.2.Kết phân lập giám định virus H9N2 31 Bảng 4.3.Kết định tính định tên chủng virus cúm gia cầm H9N2 32 Bảng 4.4.Kết kiểm tra hiệu giá HA virus cúm A/H9N2 34 Bảng 4.5.Kết kiểm tra hiệu giá HA virus cúm A/H9N2 36 Bảng 4.6.Kết kiểm tra hiệu giá HA virus cúm A/H9N2 38 Bảng 4.7 Kết kiểm tra phát triển virus cúm A/H9N2 loại môi trường nuôi cấy 40 Bảng 4.8 Kết xác định hiệu giá chủng virus cúm A/H9N2 qua đời x nuôi cấy (10 EID50/ml) 42 Bảng 4.9.Kết đánh giá độc lực virus cúm gia cầm A/H9N2 44 Bảng 4.10 Kết xác định virus cúm A/H9N2 số phủ tạng gà gây nhiễm chuyển đổi sang hiệu giá virus 48 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh virus cúm A gia cầm Hình 2.2 Hệ gen virus Hình 4.1 Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H9 số tỉnh Việt Nam 30 Hình 4.2 Hình ảnh số phản ứng phân lập giám định 31 Hình 4.3 Khả sinh trưởng virus cúm A/H9N2 theo thời gian 34 Hình 4.4 Hình ảnh phôi trứng gà sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 .35 Hình 4.5 Khả sinh trưởng virus cúm A/H9N2 theo thời gian 36 Hình 4.6 Hình ảnh tế bào CEF sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 .37 Hình 4.7 Khả sinh trưởng virus cúm A/H9N2 theo thời gian 38 Hình 4.8 Hình ảnh tế bào MDCK sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 39 Hình 4.9 So sánh phát triển virus cúm A/H9N2 loại môi trường phản ứng HA 41 Hình 4.10 Hiệu giá chủng virus cúm A/H9N2 qua đời ni cấy .43 Hình 4.11 Kết đánh giá điểm lâm sàng cá thể gà sau 10 ngày thí nghiệm 45 Hình 4.12 Một số hình ảnh gà sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 thí nghiệm xác định độc lực .46 Hình 4.13 Hiệu giá virus quan phủ tạng qua phương pháp rRT-PCR (log10) 49 Hình 4.14 Một số hình ảnh bệnh tích mổ khám gà chết sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 50 Hình 4.15 Mức độ thải virus cúm A/H9N2 51 viii