Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 - Khoa Thú y – Học viện nông nghiệp Việt Nam.
- Bộ môn nội chẩn dược độc chất - khoa Thú Y – HVNNVN
Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu được lấy từ gà ở mọi lứa tuổi có triệu chứng về hô hấp nghi ngờ mắc bệnh ORT thu thập ở khu vực Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên.
Nguyên vât liệu
- Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 - Khoa Thú y – Học viện nông nghiệp Việt Nam.
- Bộ môn nội chẩn dược độc chất - khoa Thú Y – HVNNVN
- Mẫu được lấy từ gà ở mọi lứa tuổi có triệu chứng về hô hấp nghi ngờ mắc bệnh ORT thu thập ở khu vực Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên.
1) Tình hình mắc bệnh đường hô hấp nói chung và bệnh ORT nói riêng trên đàn gà tại 4 tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên.
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hô hấp tại 4 tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hô hấp theo lứa tuổi
+ Tình hình mắc một số bệnh đường hô hấp theo mùa vụ
+ Tình hình mắc hoặc nghi mắc bệnh ORT tại 4 tỉnh
+ Nghiên cứu biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh ORT
2) Phân lập vi khuẩn ORT từ những gà mắc bệnh + Giám định vi khuẩn ORT bằng kĩ thuật PCR
+ Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT
+ Xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn ORT ở một số cơ quan của gà mắc bệnh
3) Giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ORT
4) Xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
- Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT thu thập được như: phổi, hạnh phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngoáy mũi, mắt, miệng, ổ nhớp, khí quản), lách, ruột,hạch… Lấy ở các trang trại chăn nuôi gà ở Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên.
3.4.2 Các loại môi trường, hoá chất
* Các loại môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tuỳ tiện hay yếm khí tuỳ tiện Điều kiện sinh trưởng tối ưu là 37 o C, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 – 42 o C Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường Macconkey agar, Endo agar Các môi trường dạng lỏng cần được lọc kĩ như môi trường BHI, PB.
Môi trường ưu tiên sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn ORT là môi trường thạch mỏu Columbia Blood Agar bổ sung 5% mỏu cừu hoặc mỏu thỏ và 5àg/ml gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Cách pha: cân chính xác 3,9g thạch máu Blood agar với 100ml nước cất và hấp ướt ở 121 o C trong 30 phút, để nguội 45 – 50 o C sau đó bổ sung 5ml máu thỏ lắc đều cho máu thỏ hoà tan trong thạch, màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các ORT đều kháng gentamycin, nên cho thêm 10àg gentamycin cho mỗi ml mụi trường thạch mỏu để cú thể phõn lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm Sau đó đổ vào đĩa lồng (10 – 15 ml/ đĩa).
Hình 3.1 Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon.
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac ’ s, nước trypton
- Thử phản ứng KOH: dung dịch KOH 10%
- Thư phản ứng ure: canh thang ure
- Các loại đường: Succarose, maltose, glucose, lactose, fructose.
- Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh.
- Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA.
3.4.3 Máy móc, giống vi khuẩn
- Tủ ấm, tủ -80 o C, kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ lạnh bảo quản môi trường…
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi mắc ORT nuôi tại một số trại của Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hưng Yên; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc ORT còn sống Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…
Với những gà có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm củaCục Thú y.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm.
Xử lý tiêu độc xác gia cầm.
3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình, lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).
Mẫu có thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi Ta lấy mẫu theo phương pháp sau: Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70 o để một thời gian cho dịch thấm vào tăm bông ─> Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart TranspORT medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau sau 2- 8h Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh dương. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp. Đối với dịch khí quản hay phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào môi trường như trên, đậy nút, ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên.
3.5.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Bằng cách phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hoá học gây bệnh của vi khuẩn.
Mẫu sau khi lấy về được cấy trên các môi trường thông thường và đặc biệt như: thạch máu thỏ 5-10%, nước thịt, thạch Chocolate Nuôi cấy ở 37 o C trong 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ tuỳ loại vi khuẩn Căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt Với ORT tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ có bổ sung gentamycin 5% nuôi ở 37 o C trong 10 – 15 ngày thấy khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng đôi khi có màu đỏ hung, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng Không mọc trên môi trường Macconkey.
Dựa vào sơ đồ phân lập:
Dịch ngoáy mũi của gà mắc ORT các lứa tuổi
↓ Nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ
Phân lập thuần khiết khuẩn lạc trên môi trường Columbia Blood Agar
↓ Nhuộm Gram, kiểm tra hình thái
Kiểm định, định loại vi khuẩn bằng các đặc tính hình thái và sinh hoá
↓ Cấy vào thạch giữ giống, trộn với 25% glycerol nguyên chất
Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians không bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này.
Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím gentians còn vi khuẩn Gram âm bắt mầu hồng của fucshin
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 – 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt mầu tốt hơn.
Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước.
Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước.
Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô.
Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô. Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
3.5.6 Phương pháp thử các đặc tính sinh hoá của chủng vi khuẩn phân lập được
Phản ứng thử Oxydase: sử dụng thuốc thử của hãng Remel Tiến hành trên giấy được tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu phết đều lên trên mặt giấy thấm thuốc thử Trong vòng 10 giây đầu, nếu môi trường chuyển sang màu tím than, phản ứng cho kết quả dương tính ORT cho hản ứng Oxidase dương tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính ORT có phản ứng Catalase âm tính.
Phản ứng Indol: dùng để phát hiện vi khuẩn có enzyme trytophanasa chuyển hoá trypton thành indol Cấy vi khuẩn vào nước trypton và ủ ở 37 o C/ 24 giờ Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s, phản ứng dương tính có vòng màu hồng cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminnobelzal dehyde có trong thuốc thử Kovac’s), nếu không có màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính ORT có phản ứng indol âm tính.
Phản ứng KOH: dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên môi trường thạch máu phết lên phiến kính sạch đã có sẵn một giọt dung dịch KOH 10% đánh tan rồi nhấc que cấy lên Nếu khuẩn lạc vón cục là phản ứng dương tính Nếu khuẩn lạc không vón cục, tan ra và không tạo nhớt là phản ứng âm tính ORT có phản ứng KOH âm tính.
Phản ứng phân giải Ure: phát hiện enzyme urease phân giải ure thành ammonia và cacbodioxide Amonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường Cấy vi khuẩn vào canh thang ure, ủ 37 O C/ 24 – 48 giờ Phản ứng dương tính: môi trường có mầu tím đỏ; phản ứng âm tính: không màu ORT có phản ứng Ure dương tính.
3.5.7.1 Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20àl Proteinase K vào ống Eppendorf Thờm 180 àl Buffer
ATL, trộn đều ủ ở 56 o C trong 3 giờ.
Bước 2: Thờm 4àl ARNase và 200 àl Buffer AL Ủ ở 70 o C trong 30 phỳt.
Bước 3: Thờm 200 àl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thờm 500àl Buffer AW1, rồi ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thờm 500àl Buffer AW2, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 2 phỳt, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml Thờm 100 àl Buffer AE, để ở nhiệt độ phũng trong 5 phút Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20 o C.
3.5.7.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Thành phẩn của phản ứng PCR:
STT Nội dung Thể tớch (àl)
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Giai đoạn Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3.5.8 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ.
Chủng vi khuẩn kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm 37 o C, 5% CO2 trong vòng 24 – 48 giờ Chuẩn bị đĩa thạch máu để tủ ấm 10
– 20 phút trước khi dùng Lấy 0,1ml canh khuẩn cần kiểm tra nhỏ vào đĩa thạch và láng đều, sau đó để đĩa thạch từ 3 – 5 phút cho khô nhưng không để quá 25 phút.
