Thông tin tài liệu
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMN NÔNG NGHIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMP VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMT NAM NGUYỄN THỊ MINH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG TGEVT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG TGEV ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG TGEVC TÍNH SINH HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAMC CỦA CHỦNG TGEVA CHỦA CHỦNG TGEVNG TGEV (TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS) VÀ PEDV (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) DÙNG SẢN XUẤT VACXIN NHƯỢC ĐỘC ĐA GIÁN XUẤT VACXIN NHƯỢC ĐỘC ĐA GIÁT VACXIN NHƯỢC ĐỘC ĐA GIÁC ĐỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG TGEVC ĐA GIÁ Chuyên ngành: Thú y Mã số:: 8640101 Người hướng dẫn khoa học:i hướng dẫn khoa học:ng dẫn khoa học:n khoa học:c: TS Nguyễn Văn Giápn Văn Giáp NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu luận văn phần đề tài “Sản xuất vacxin nhị giá nhược độc phòng bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm (TGE) tiêu chảy cấp lợn (PED)”, triển khai thực Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam Tôi xin cam đoan số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực, xác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Minh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn TS Nguyễn Văn Giáp hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiêm, Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày 02 tháng11năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Minh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng .vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học .2 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy Virus .3 2.1.1 Tình hình nghiên cứu PEDV, TGEV Việt Nam 2.1.2 Tình hình nghiên cứu giới 2.2 Giới thiệu chung virus gây tiêu chảy 11 2.2.1 Phân loại 11 2.2.2 Virus gây bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm .12 2.2.3 Virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn 18 2.3 Miễn dịch vacxin phòng bệnh .26 2.3.1 Miễn dịch chống PEDV, TGEV 26 2.3.2 Vacxin phòng bệnh PEDV, TGEV 27 Phần Nội dung - nguyên liệu - phƣơng pháp nghiên cứu 31 3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Thời gian thực đề tài 31 3.3 Nội dung nghiên cứu 31 3.3.1 Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá PEDV TGEV 31 3.3.2 Đánh giá tính nhược độc lực chủng PEDV TGEV 31 iii 3.3.3 Đánh giá đặc tính ổn định di truyền hai chủng PEDV TGEV .31 3.4 Đối tượng - vật liệu nghiên cứu .31 3.4.1 Đối tượng nghiên cứu 31 3.4.2 Vật liệu nghiên cứu 31 3.5 Phương pháp nghiên cứu 32 3.5.1 Phương pháp xác định hiệu giá virus 32 3.5.2 Phương pháp kiểm tra tính nhược độc hóa virus 33 3.5.3 Phương pháp tách ARN 33 3.5.4 Phương pháp tổng hợp CDNA 34 3.5.5 Phương pháp realtime RT-PCR định lượng virus 34 3.5.6 Phương pháp giải trình tự gen mã hóa spike protein (gen S) 36 3.5.7 Phương pháp phân tích trình tự gen 37 3.5.8 Phương pháp xử lý số liệu .37 Phần Kết thảo luận 38 4.1 Đặc tính ổn định hiệu giá chủng giống PEDV, TGEV 38 4.2 Đặc điểm nhược độc hóa chủng virus PEDV, TGEV .39 4.2.1 Triệu chứng lâm sàng lợn gây nhiễm 40 4.2.2 Biến đổi bệnh lý đại thể lợn gây nhiễm 42 4.2.3 Biến đổi bệnh lý vi thể ruột non lợn gây nhiễm .44 4.2.4 Kết nghiên cứu thải phân bố virus đường tiêu hóa 47 4.3 Đặc điểm ổn định di truyền chủng giống 49 4.3.1 Đặc điểm ổn định di truyền chủng PEDV 49 4.3.2 Đặc điểm ổn định di truyền chủng TGEV 52 Phần Kết luận kiến nghị .56 5.1 Kết luận 56 5.2 Kiến nghị 56 Tài liệu tham khảo 57 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cytopathogenic effect cs Cộng DMEM Dulbecco's Modified Eagle’s Medium ELISA Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum M Membrane MOI Multiplicity of Infection N Nucleocapsid ORF Open Reading Frame ORF3 Open Reading Frame PBS Phosphate Buffer Saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction S Spike protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible Gastroenteritis TGEV Transmissible Gastroenteritis Virus ST Swine testicular SK Swine kidney TPB Tryptose Phosphate Broth v DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 34 Bảng Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S PEDV 36 Bảng 3 Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S TGEV .37 Bảng 4.1 Tổng hợp triệu chứng lợn nhiễm virus cường độc/ nhược độc 41 Bảng 4.2 Tổng hợp bệnh tích lợn nhiễm virus cường độc/ nhược độc .42 Bảng 4.3 Mức độ tương đồng nucleotide gen S PEDV .51 Bảng 4.4 Mức độ tương đồng amino acid protein S PEDV 51 Bảng 4.5 Sự thay đổi trình tự nucleotide amino acid PEDV 52 Bảng 4.6 Mức độ tương đồng nucleotide gen S TGEV 54 Bảng 4.7 Mức độ tương đồng amino acid protein S TGEV 54 Bảng 4.8 Sự thay đổi trình tự nucleotide amino acid TGEV 55 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân loại Coronavirus gây bệnh động vật .11 Hình 2.1 Cấu trúc gen TGEV 12 Hình 2.3 Sự thay đổi xóa gen tăng đột biến chủng TGEV 14 Hình 2.4 Thay đổi hình thái tế bào bị nhiễm TGEV 15 Hình 2.5 Đường cong sinh trưởng TGEV tế bào PK - 15 16 Hình 2.6 Bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm virus tái tổ hợp 18 Hình 2.7 Cấu trúc gen PEDV 19 Hình 2.8 Bệnh tích tế bào PEDV gây trên tế bào Vero 22 Hình 2.9 CPE PEDV mang đột biến gen ORF3 23 Hình 2.10 Hiệu giá PEDV tồn bề mặt vật liệu theo thời gian 24 Hình 2.11 Bệnh tích đại thể vi thể lợn gây nhiễm PEDV 25 Hình 3.1 Ví dụ kết phản ứng SYBR Green realtime PCR .35 Hình 3.2 Phân tích melting curve để xác định độ đặc hiệu phản ứng 35 Hình Bệnh tích tế bào gây nhiễm PEDV TGEV 38 Hình Hiệu giá chủng PEDV TGEV lần tiếp đời 39 Hình Triệu chứng lợn nhiễm virus cường độc nhược độc 40 Hình 4 Bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm virus 43 Hình Bệnh tích vi thể lợn gây nhiễm PEDV 45 Hình Bệnh tích vi thể lợn gây nhiễm TGEV 46 Hình Sự thải phân bố virus đường tiêu hóa 47 Hình Giản đồ giải trình tự gen S PEDV TGEV .49 Hình Cây phát sinh chủng loại PEDV dựa vào trình tự gen S 50 Hình 10 Cây phát sinh chủng loại TGEV dựa vào trình tự gen S 53 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Minh Tên luận văn:“Một số đặc tính sinh học chủngTGEV (transmissible gastroenteritis virus) PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá” Chuyên ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: - Đánh giáđăc ̣ tinh́ ổn định hiệu giá giống virus vacxin - Đánh giáđược tính nhược độc hai chủng giống virus - Đánh giáđặc tinh́ ổn đinḥ di truyền hai chủng giống virus Nguyên liệu: chủng virus AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130); lợn sơ sinh âm tính PEDV, TGEV; hóa chất dùng realtime RT-PCR định lượng tương đối Phƣơng pháp nghiên cứu Chuẩn độ virus phương pháp pha loãng tới hạn; phương pháp gây bệnh thực nghiệm; phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối; phân tích đặc điểm sinh học phân tử dựa vào phần mềm tin sinh học BioEdit, MEGA Kết kết luận Giống virus AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130) có hiệu giá ổn định, với mức dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID 50/ ml (PEDV) 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ ml (TGEV) Giống virus AVAC/VR/PED.98 (P100) AVAC/VR/TGE.15 (P130) nhược độc lợn giai đoạn mẫn cảm Trong vòng 20 lần tiếp đời, chủng giống virus AVAC/VR/PED.98 AVAC/VR/ TGE.15 có tính ổn định trình tự gen định kháng ngun viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Minh Thesis title: Some biological properties of TGEV (transmissible gastroenteritis virus) and PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) used for production of attenuated vaccine Major:Veterinary Medicine Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives - To determine the stability of viral titer - To investigate attenuated properties of the two viral strains - To study the genetic stability of the two viral strains Materials and Methods th Materials:virus strains of AVAC/VR/PED.98 (the passage 100 ) and AVAC/VR/ th TGE.15 (the passage 130 ); neonatal pigs which were negative for both PEDV and TGEV; reagents for relative quantitative realtime RT-PCR Method: the endpoint dilution method was applied for virus titration; reproduction -ΔΔCT of disease by challenging test; the methodwas applied for relative quantitative realtime RT-PCR of virus load on intestinal tract and shedding; bioinformatic tools such as BioEdit, MEGA were implemented for genetic characterization Main findings and conclusions The virus strains of AVAC/VR/PED.98 (P100) and AVAC/VR/TGE.15 (P130) had stable titer in the range of 7.1 - 7.5 log10 TCID 50/ ml (PEDV) and 8.5 - 8.7 log10 TCID50/ ml (TGEV) AVAC/VR/PED.98 (P100) and AVAC/VR/TGE.15 (P130) were confirmed to be attenuated by challenge test AVAC/VR/PED.98 and AVAC/VR/TGE.15 exhibit genetic stability for 20 times serial passages ix
Ngày đăng: 23/11/2023, 06:17
Xem thêm:
