Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Tình hình chăn nuôi gà thịt tại Hà Nội.
- Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp từ các mẫu phân gà thịt.
- Định type huyết thanh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập được.
Nguyên liệu nghiên cứu
* Loại mẫu: Mẫu phân gà nuôi tại các trang trại gà thịt ở khu vực Hà Nội.
* Đối tượng nghiên cứu: Giống gà Ross 308, 21 ngày tuổi.
* Địa điểm nghiên cứu: Các trại gà nuôi gia công ở khu vực Hà Nội
- Quy mô trại: 5.000-8.000 con /trang trại
- Phương thức chăn nuôi: Chăn nuôi gia công
- Hệ thống chuồng trại: chuồng kín, có các thiết bị máng ăn, máng uống bán tự động hoặc tự động
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ.
Tủ ấm có nhiệt độ (37±0.5) 0 C , tủ ấm có nhiệt độ (41.5±0.5) 0 C, kính hiển vi, đĩa petri, pipette (1 ml,2 ml, 5 ml, 10 ml), que cấy, lam kính, tủ cấy có trang bị đèn UV, nồi hấp tiệt trùng nhiệt độ (121±1) 0 C áp suất 1atm.
Các thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm tất cả đều được vô trùng tuyệt đối.
Buffered Peptone Water (BPW), Muller – Kauffmann Tetrathinonate- novobiocin (MKTTn), Rappaport Vassiliadis Soy (RVS), Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD agar), Hektoen Enteric agar (HE agar), Nutrient agar (NA), TSI (Triple Sugar Iron Agar), Lysin Decarboxylase Broth, Ure agar (Christensen), VP Broth Tryptophan Medium, NaCl 0.85%
- Đĩa giấy O.N.P.G (Thuốc thử phát hiện ββ-Galactosidaza)
- Sử dụng chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC ®13076 TM
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn.
* Chuẩn bị dụng cụ: - Bông cồn
- Túi nilon vô trùng , ticker dán mẫu, bút viết kính, dây chun, thùng xốp có chứa đá lạnh để vận chuyển mẫu.
Hình 3.1 Trang trại gà thịt, huyện Ba Vì, Hà Nội
Hình 3.2 Trang trại gà thịt, huyện Chương Mỹ, Hà Nội
Cố định gà, lấy bông cồn lau sạch vùng lỗ huyệt của gà, dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong lỗ huyệt của gà, ngoáy đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển tăm bông vào ống môi trường vận chuyển (là ống fancol chứa môi trường thạch Carry Blaird), bẻ bỏ phần tăm phía ngoài đã dùng tay cầm, cho ống fancol vào túi nilon buộc chặt 2 lớp, ghi thông tin lên giấy và dán lên mẫu, bảo quản ở 2-8 o C và vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm muộn nhất 24 giờ sau khi lấy mẫu.
Trong đó 1 mẫu gồm 20 que tăm bông/ 1 chuồng (1 chuồng có 4 ô, mỗi ô bắt ngẫu nhiên 5 con gà ở 5 vị trí khác nhau)
Hình 3.3 Cố định gà để lấy mẫu
Hình 3.4 Mẫu được bảo quản lạnh trong thùng xốp
3.3.3 Phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn Salmonella spp
Nuôi cấy, phân lập và giám định Salmonella theo TCVN 4829:2005/SĐ 1:2008 (ISO 6579:2002/ Amd.1:2007)
Mẫu + dung dịch đệm pepton. Ủ ở 37 o C ± 1 o C/ 18 h ± 2 h
0.1 ml chủng cấy + 10 ml 1 ml chủng cấy + 10 ml môi môi trường RVS Ủ trong 24h ± trường MKTTn Ủ trong 24h ± 3h ở 41.5 o C ± 1 o C 3h ở 37 o C ± 1 o C
Môi trường XLD và môi trường thạch thứ hai Ủ trong 24h ± 3h ở
Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng Nếu âm tính, thử bốn khuẩn lạc khác đã được đánh dấu.
Khẳng định huyết thanh Biểu thị kết quả
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Salmonella
Bảng 3.1 Cấu trúc kháng nguyên và các kháng huyết thanh đặc hiệu cần ngưng kết để định type của một số chủng Salmonella gây bệnh quan trọng
Tên chủng Cấu trúc Huyết thanh đặc hiệu kháng nguyên O H
(Nguồn: Lab gốc giống và sinh phẩm chẩn đoán, Khoa sản xuất, Viện Pasteur TP HCM)
Tiến hành xét nghiệm
Mẫu đã được chuẩn bị đảm bảo tiêu chuẩn để gửi đến phòng xét nghiệm
+ Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc.
Bổ sung dung dịch đệm pepton ở nhiệt độ phòng vào ống mẫu có chứa môi
Lắc ống mẫu trên máy lắc để trộn đều dịch tăng sinh ở môi trường không
36 chọn lọc, sau đó dùng pipet vô trùng hút 0,1ml dịch tăng sinh cho vào 10 ml môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) và hút 1ml dịch tăng sinh cho vào 10 ml môi trường Muller Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn)
Môi trường RVS được ủ ở bể điều nhiệt (41.5 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ và môi trường MKTTn được ủ ở tủ ấm (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ Canh trùng đục đều, trên mặt môi trường có màng mỏng, đáy ống nghiệm có cặn.
Hình 3.5 Salmonella trên môi trường MKTTn và RVS
+ Đỗ đĩa và nhận dạng
Lắc đều các ống nghiệm chứa môi trường RVS và MKTTn, sau đó dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh thu từ môi trường lỏng tăng sinh chọn lọc vào hai môi trường đặc chọn lọc: Môi trường Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar) và môi trường Hektoen Enteric agar (HE agar) Thạch XLD và HE được ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ Sau thời gian ủ, quan sát khuẩn lạc trên các môi trường
- Môi trường XLD: Khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng
- Môi trường HE: Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc.
Qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào
Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng trong các môi trường thạch dinh dưỡng để nhân sinh khối Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường dinh dưỡng như TSA, hoặc
Nutrient Agar Ủ ở 37 0 C trong 18 – 24 giờ Dùng sinh khối trên môi trường dinh dưỡng này để thử phản ứng sinh hóa và huyết thanh.
3.4.3.1 Phản ứng trên môi trường TSI
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) lên phần nghiêng của môi trường TSI agar bằng cách dùng que cấy vòng cấy lên bề mặt phần nghiêng của ống môi trường, sau đó dùng que cấy thẳng lấy khuẩn lạc đâm sâu xuống đáy môi trường Ủ ở (37± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ.
+ Salmonella spp cho phản ứng kiềm ở phần bề mặt nghiêng của ống môi trường (cho màu đỏ)
+ Phản ứng acid ở phần đáy (màu vàng) glucose dương tính có sinh khí, có sinh H2S (thạch bị đen).
3.4.3.2 Phản ứng Voges-Proskauer (VP)
- Chuẩn bị môi trường VP broth Hút vào mỗi ống nghiệm 3ml môi trường.
- Dùng que cấy tròn cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ thạch Nutrient agar (NA) vào 3ml môi trường VP broth Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ.
- Sau thời gian ủ nhỏ vào ống môi trường nuôi cấy 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt Alpha-napthol 5% và 2 giọt KOH 40%, lắc nhẹ và để 15 phút sau đó quan sát màu của ống môi trường.
- Kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-), môi trường không đổi màu.
+ Nếu phản ứng (+): dung dịch màu hồng đến màu đỏ sáng
+ Nếu phản ứng (-): dung dịch không đổi màu
- Chuẩn bị môi trường Trytophan Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào môi trường Trytophan bằng cách dùng que cấy tròn cấy khuẩn lạc vào trong ống môi trường Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ
- Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs’Indol.
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-),
+ Nếu phản ứng (+): dung dịch màu hồng đến màu đỏ sáng
+ Nếu phản ứng (-): dung dịch không đổi màu
- Chuẩn bị môi trường Lysine decarboxylase broth Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào 5ml môi trường Lysin decarboxylase broth Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (+)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường nuôi cấy đục và có màu tím.
+ Nếu phản ứng (-): Môi trường nuôi cấy có màu vàng.
- Chuẩn bị môi trường thạch Urea Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào môi trường thạch Urea Ủ ở 37 0 C ± 1 0 C trong 24 giờ ± 3 giờ
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường nuôi cấy có màu hồng, sau đó đỏ hồng. + Nếu phản ứng (-): Môi trường nuôi cấy không đổi màu.
3.4.3.6 Phát hiện β-galactosidase (sử dụng đĩa giấy O.N.P.G)
- Cho đĩa giấy O.N.P.G vào ống nghiệm chứa 0,1 ml nước muối 0.85%.
- Cấy 1 vòng sinh khối vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường NA vào ống nghiệm chứa NaCl 0.85% và đĩa giấy O.N.P.G.
- Ủ ống nghiệm ở (36±1) 0 C/ (24±3) h trong bể điều nhiệt, phản ứng thường xuất hiện sau từ 1-6 giờ
- Salmonella sẽ cho phản ứng β-galactosidase (-)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường có màu vàng
+ Nếu phản ứng (-): Môi trường không đổi màu
Bảng 3.2 Giải thích các phép thử sinh hóa
Chủng Salmonella Phép thử* S typhi S paratyphi A S paratyphi B S paratyphi C Các chủng khác
% b Phản ứng % b Phản ứng % c Phản ứng % c Phản ứng % b ứng
Thạch TSI sinh axit từ glucoza + 100 + 100 + + + 100
Thạch TSI sinh khí từ glucoza - d 0 + 100 + + + 92
Thạch TSI sinh axit từ lactoza - 2 - 100 - - - 1
Thạch TSI sinh axit từ sucroza - 0 - 0 - - - 1
Thạch TSI Hydro sunfua được tạo thành + 97 - 10 + + + 92
Lyzin đã khử nhóm cacboxyl + 98 - 0 + + + 95
(Nguồn: TCVN 4829:2005) a Từ tài liệu tham khảo. b Các tỷ lệ phần trăm này cho thấy rằng không phải tất cả các type huyết thanh Salmonella cho các phản ứng đánh dấu + hoặc - Các tỷ lệ phần trăm này có thể thay đổi tuỳ theo type huyết thanh c Các phần trăm này chưa có số liệu. d Salmonella typhi là loại yếm khí e Loài phụ arizonae Salmonella enterica cho phản ứng lactoza dương tính hoặc âm tính nhưng luôn cho ββ-galactosidaza dương tính Để nghiên cứu các chủng này có thể cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung
3.4.4 Khẳng định huyết thanh & type huyết thanh
Việc phát hiện sự có mặt của Salmonella kháng nguyên O, kháng nguyên
Vi và kháng nguyên H được thử bằng sự ngưng kết trên phiến kính với huyết thanh thích hợp, từ các khuẩn lạc thuần khiết và sau khi các chủng có thể tự ngưng kết đã bị loại trừ.
3.4.4.2 Loại trừ chủng tự ngư ng k ết
Cho một giọt dung dịch nước muối sinh lý 0,85% NaCl lên phiến kính thuỷ tinh đã được làm sạch một cách cẩn thận Dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất Lắc nhẹ phiến kính từ 30 giây đến 60 giây Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp Nếu vi khuẩn ít nhiều có kết dính các đơn vị với nhau, thì chủng này được xem là tự ngưng kết, và sẽ không phải thử nghiệm tiếp vì không thể phát hiện kháng nguyên được Nếu huyễn dịch đục đều sẽ tiến hành giám định theo các bước tiếp theo
Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết không có khả năng tự ngưng kết, tiến hành theo 3.4.4.2, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên O thay cho dung dịch nước muối sinh lý Nếu xuất hiện ngưng kết, thì phản ứng được xem là dương tính Lần lượt sử dụng huyết thanh đa giá và đơn giá.
3.4.4.4 Kiểm tra kháng nguyên Vi
Tiến hành theo 3.4.4.2 nhưng sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên Vi Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính.
Cấy khuẩn lạc thuần khiết không có khả năng tự ngưng kết vào môi trường thạch dinh dưỡng nửa đặc Semi-solid nutrient ager Ủ ở 37 °C trong 24 h ± 3h.
Sử dụng chủng cấy này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành theo 3.4.4.2 nhưng sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên H
Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính.
Có hay không có Salmonella trong mẫu
Bảng 3.3 Giải thích các kết quả các phép thử khẳng định
Phản ứng Tự Phản ứng
Giải thích sinh hoá ngưng kết huyết thanh Điển hình Không Kháng nguyên O, Các chủng được coi là
Vi hoặc H dương tính Salmonella Điển hình Không Tất cả các phản ứng âm tính Điển hình Có Không thử nghiệm
Có thể là Salmonella Phản ứng không Không/ Có Kháng nguyên O, điển hình i hoặc H dương tính
Phản ứng không Không/ Có Tất cả các phản ứng Không được coi là điển hình âm tính Salmonella
Các chủng được xem là Salmonella, hoặc có thể là Salmonella (bảng 3.3), tiến hành lấy sinh khối của các chủng này từ môi trường thạch dinh dưỡng, bảo quản trong ống eppendorf có bổ sung môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) và Glyxerin 80% theo tỉ lệ 0.8 ml : 0.2 ml, để ở nhiệt độ -20 0 C để giữ giống Các mẫu này phải được gửi đến trung tâm chuẩn Salmonella đã được công nhận để xác nhận định danh Salmonella.
Kiểm soát kết quả xét nghiệm
Thực hiện mẫu đối chứng âm, mẫu đối chứng dương và mẫu trắng Mẫu dương được thực hiện bằng cách nhiễm 1ml chủng chuẩn có nồng độ pha loãng
10 -2 vào mẫu, sau đó thực hiện theo hướng dẫn Mẫu âm được thực hiện bằng cách nhiễm 1ml chủng chuẩn không phải Salmonella (sử dụng E.coli) có nồng độ pha loãng 10 -2 vào mẫu, sau đó thực hiện theo hướng dẫn Mẫu trắng được thực hiện bằng cách cho 1ml nước muối sinh lý vào mẫu, sau đó thực hiện theo hướng dẫn.
Xác nhận định danh Salmonella
Các chủng được xem là Salmonella, hoặc có thể là Salmonella sẽ tiến hành xác định type huyết thanh Xác định type huyết thanh của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp theo phương pháp của White-Kauffmann (WHO, 1983)
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella từ môi trường đặc hiệu, ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, ủ ở 37 o C / 24 giờ
- Định type kháng nguyên O Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt khỏng huyết thanh Salmonella polyvalent O (20 àl) lờn phiến kớnh
• Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella đã nuôi cấy qua đêm trên môi trường Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính.
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti.
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành với các nhóm OMA, OMB, OMC, tương tự kháng huyết thanh poly O Với nhóm cho phản ứng dương tính, tiếp tục với các kháng huyết thanh O đơn giá.
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân type kháng nguyên O
+ Nếu chủng âm tính với OMA, OMB, OMC, thì cần phải làm phản ứng tiếp theo với OMD, OME, OMF và OMG.
+ Nếu chủng ngưng kết với OMA, tiếp tục kiểm tra với nhóm 2; 4; 9; 9,46; 3,10; 1,3,19; 21
+ Nếu chủng ngưng kết với OMB, tiếp tục kiểm tra với nhóm 7; 8; 11;
+ Nếu chủng ngưng kết với OMC, tiếp tục kiểm tra với nhóm 16; 17; 18; 28; 30; 35; 38
+ Nếu chủng ngưng kết với OMD, tiếp tục kiểm tra với nhóm 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45
+ Nếu chủng ngưng kết với OME, tiếp tục kiểm tra với nhóm 47; 48; 50; 51; 52; 53; 61
+ Nếu chủng ngưng kết với OMF, tiếp tục kiểm tra với nhóm 54, 55, 56, 57,
+ Nếu chủng ngưng kết với OMG, tiếp tục kiểm tra với nhóm 60, 62, 63, 65,
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân type kháng nguyên H
Nhiều chủng Salmonella có 2 pha kháng nguyên H Tuy nhiên ở vi khuẩn
Salmonella đã nuôi cấy thường chỉ xuất hiện 1 pha Pha 2 sẽ được phát hiện khi ức chế sự xuất hiện của pha 1 bằng cách nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh ức chế pha 1 vào đĩa thạch Sven Gard.
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H.
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: Đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất Dùng đĩa petri có đường kính 9mm Trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1 Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6)
SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10 SG2: ức chế Hd, Hi, He,h SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26 SG4: ức chế Hr, Hz
SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15 Sg6: ức chế H1,2, H1,5, H1,6, H1,7, Hz6
- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở vị trí giữa đĩa thạch Sven gard.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1.
Bảng 3.4 Kháng huyết thanh ức chế Kháng nguyên H pha 1
STT Kháng huyết thanh Các kháng nguyên H pha 1 bị ức chế
(Ví dụ: Kháng nguyên H pha 1 xác định là Ai thì dùng SG2 để ức chế A)
Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu thập được xử lý bằng toán thống kê sinh vật học, sử dụng phần mềm Excell 2007.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Tình hình chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
4.1.1 Khái quát về các điều kiện tự nhiên, kinh tế- xã hội ảnh hưởng tới chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
4.1.1.1 Khái quát về các điều kiện tự nhiên
Vị trí địa lý: Các trang trại gà thịt nghiên cứu thuộc địa bàn các huyện (thị xã) ngoại thành của thành phố Hà Nội (Sơn Tây, Ba Vì, Quốc Oai, Thạch Thất,
Mỹ Đức, Chương Mỹ), giới hạn trong khoảng từ 20034’ đến 21018’ vĩ độ Bắc, 104017’ đến 1060 kinh độ Đông, tiếp giáp với Hưng Yên ở phía Đông, Hà Nam ở phía Đông Nam, Hòa Bình ở phía Tây Nam, Vĩnh Phúc và Phú Thọ ở phía Tây Bắc và Bắc.
Hà Nội nằm ở trung tâm châu thổ Sông Hồng, các mạch núi Tây Bắc và Đông Bắc đã hội tụ về đây (Hoàng Liên Sơn, Con Voi, Tam Đảo, các cánh cung Đông Bắc), và do đó các dòng sông cũng tụ thủy về Hà Nội để rồi phân tỏa về phía Biển Đông (sông Đà, sông Thao, sông Lô, sông Chảy, sông Cầu) Hà Nội có diện tích 3323,6 km 2 , có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên, tài nguyên cho phát triển kinh tế, xã hội và văn hóa, là đầu mối giao thương bằng đường bộ, đường sắt, đường hàng không và đường sông tỏa đi các vùng khác trong cả nước và đi quốc tế, song đây cũng là một khó khăn cho công tác phòng, chống dịch bệnh cho gia súc, gia cầm do sự giao lưu hàng hóa giữa các khu vực sẽ kèm theo lan truyển mầm bệnh qua các trục giao thông thủy, bộ. Địa hình: Hà Nội có hai dạng địa hình chính là đồng bằng và đồi núi Địa hình đồng bằng chủ yếu thuộc địa phận Hà Nội cũ và một số huyện phía đông của
Hà Tây (cũ), chiếm khoảng 3/4 diện tích tự nhiên, nằm bên hữu ngạn sông Đà, hai bên sông Hồng và chi lưu các sông Phần lớn địa hình đồi núi thuộc địa phận các huyện Sóc Sơn, Ba Vì, Quốc Oai, Mỹ Đức Do địa hình thấp và khá bằng phẳng thuận lợi cho việc phát triển chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gà nói riêng.
Khí hậu: Khí hậu Hà Nội khá tiêu biểu cho kiểu khí hậu Bắc bộ với đặc điểm của khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, mùa hè nóng, mưa nhiều và mùa đông lạnh, mưa ít Nằm trong vùng nhiệt đới, Hà Nội quanh nǎm tiếp nhận được lượng bức xạ mặt trời rất dồi dào và có nhiệt độ cao Lượng bức xạ tổng cộng trung bình hàng nǎm ở Hà Nội là 122,8 kcal/cm 2 và nhiệt độ không khí trung bình hàng nǎm là 23,6ºC Do chịu ảnh hưởng của biển, Hà Nội có độ ẩm và lượng mưa khá lớn Ðộ ẩm tương đối trung bình hàng nǎm là 79% Lượng mưa trung bình hàng nǎm là 1800mm và mỗi nǎm có khoảng 114 ngày mưa Ðặc điểm khí hậu Hà Nội rõ nét nhất là sự thay đổi và khác biệt của hai mùa nóng, lạnh Từ tháng 5 đến tháng 9 là mùa nóng và mưa Nhiệt độ trung bình mùa này là 29,2ºC Từ tháng 11 đến tháng 3 nǎm sau là mùa đông thời tiết khô ráo Nhiệt độ trung bình mùa đông 15,2ºC Giữa hai mùa đó lại có hai thời kỳ chuyển tiếp (tháng 4 và tháng 10) cho nên Hà Nội có đủ bốn mùa Xuân, Hạ, Thu, Ðông Phần địa hình của Hà Tây (cũ) nhập với Hà Nội, có những đặc điểm riêng nên hình thành những tiểu vùng khí hậu: vùng núi, vùng gò đồi và đồng bằng Nhưng nói chung sự khác biệt thời tiết và chênh lệch về nhiệt độ giữa các địa phương của Hà Nội hiện nay không lớn.
4.1.1.2 Khái quát về các điều kiện kinh tế- xã hội
Dân cư và lao động: Theo báo cáo của Ban Chỉ đạo công tác dân số- KHHGĐ Thành phố, Hà Nội là Thành phố đông dân thứ hai cả nước (sau TP Hồ Chí Minh) với dân số ước tính đến 31/12/2015 là 7.558.965 người chiếm hơn 8% dân số cả nước Hà Nội đang trong thời kỳ cơ cấu dân số vàng, tạo điều kiện cung ứng nguồn nhân lực cho các hoạt động kinh tế - xã hội của Thủ đô Hà Nội có 12 quận, 1 thị xã và 17 huyện Lượng dân cư lớn và số người có tri thức ngày càng cao là tiềm năng thúc đẩy sự phát triển kinh tế xã hội, đặc biệt là động lực phát triển kinh tế nông thôn nói chung và chăn nuôi nói riêng.
Kinh tế: Mặc dù gặp nhiều khó khăn, thách thức về thời tiết, dịch bệnh gia súc, gia cầm, sự suy thoái kinh tế trong nước nhưng sản xuất nông nghiệp Thủ đô vẫn tiếp tục phát triển và đạt được nhiều kết quả đáng khích lệ Tổng giá trị sản xuất nông, lâm, ngư nghiệp ước đạt 33.640 tỷ đồng (giá so sánh 2010), chăn nuôi,thủy sản: 55,89%; dịch vụ 2,97%, giá trị sản phẩm nông nghiệp thu hoạch trên 1ha đất nông nghiệp (giá thực tế) ước đạt 233 triệu đồng/ha, hạ tầng nông thôn ngày càng được đổi mới, nâng cấp, hệ thống đê điều, công trình thủy lợi được củng cố đảm bảo phục vụ sản xuất, an toàn phòng chống lụt bão và khắc phục hậu quả thiên tai, đời sống vật chất và tinh thần của nông dân được nâng cao một bước, góp phần giữ vững an ninh chính trị, phát triển kinh tế- xã hội trên địa bàn.
4.1.2 Tình hình phát triển chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
Hình 4.1 Trang trại gà thịt, huyện Quốc Oai, Hà Nội
Thủ đô Hà Nội có điều kiện tự nhiên phong phú với 150 nghìn ha đất đồi gò; 125 nghìn ha đất bãi phù sa, 35 nghìn ha đất đồng bằng và còn lại là đất trũng.
Với điều kiện thuận lợi cho phát triển nông nghiệp, cùng sự vào cuộc đồng bộ của các cấp, các ngành nên ngành chăn nuôi gia cầm nói chung và chăn nuôi gà thịt nói riêng của thành phố Hà Nội những năm gần đây có bước chuyển rõ nét.
Bảng 4.1 Số lượng trang trại tại khu vực Hà Nội từ năm 2012-2015
(Nguồn: Tổng cục thống kê Hà Nội, 2016)
Bảng 4.2 Số lượng gia cầm tại khu vực Hà Nội từ năm 2012-2015
Số gia cầm 17996 21244 21616 21801 ĐVT: Triệu con (Nguồn: Tổng cục thống kê Hà Nội, 2016) Quy mô chăn nuôi gà thịt: Phổ biến là quy mô từ 2.000-5.000 con/trang trại
(chiếm 68,8%); quy mô từ 5.000-8.000 con/trang trại (chiếm 20,6%), từ 8.000-
11.000 con/trang trại (chiếm 4,2%), từ 11.000-15.000 con/trang trại (chiếm 3,4%) và trên 15.000 con/trang trại (chiếm 3,4%). Đất trang trại: Đất để xây dựng trang trại chủ yếu là đất vườn nhà, đất nông nghiệp Diện tích phổ biến từ 1-2 ha/trang trại
Hình 4.2 Trang trại gà thịt, Thị xã Sơn Tây, Hà Nội
Vốn đầu tư cho chăn nuôi trang trại : Bình quân đầu tư chuồng trại, trang thiết bị, con giống đối với chăn nuôi gà thịt 50-60 triệu đồng/1.000 con gà.
Về giống: Hầu hết các giống cao sản của thế giới đều được nhập khẩu và nuôi ở trang trại như là: hướng thịt USA, Hubbard, Lohmann, AA, Cobb, Ross
Về chuồng trại, thiết bị : Cùng với việc sử dụng các giống cao sản, một số trang trại đã có sự đầu tư đáng kể về chuồng trại và thiết bị chăn nuôi theo các tiêu chuẩn tiến tiến Kiểu chuồng rất đa dạng, trong đó phổ biến kiểu chuồng sàn 1-2 tầng có hệ thống làm mát Đây là loại hình chuồng nuôi có nhiều ưu việt do đầu tư ở mức độ vừa phải, sử dụng các vật liệu rẻ tiền Một số ít trang trại sử dụng kiểu chuồng kín, chuồng kiên cố, gắn với các thiết bị máng ăn, máng uống bán tự động hoặc tự động.
Về năng suất chăn nuôi: So với phương thức chăn nuôi truyền thống, năng suất vật nuôi tại các trang trại đã có sự tiến bộ rõ rệt do sử dụng giống ngoại, giống cải tiến, công nghệ chăn nuôi tiên tiến và sử dụng thức ăn chăn nuôi công nghiệp. Thời gian nuôi gà thịt công nghiệp từ 42-49 ngày/lứa, khối lượng xuất chuồng 2,3- 2,4 kg/con, tiêu tốn thức ăn 2,1-2,3 kg thức ăn/kg tăng trọng.
Phương thức tiêu thụ sản phẩm : Trong chăn nuôi trang trại, hiện nay đang có 3 phương thức tiêu thụ sản phẩm chăn nuôi cơ bản đó là: Tự sản tự tiêu, tiêu thụ sản phẩm thông qua thương lái, tiêu thụ sản phẩm thông qua chăn nuôi gia công là chủ yếu, gần đây đang bắt đầu hình thành phương thức tiêu thụ qua các hợp tác xã.
Tự sản tự tiêu (tự bao tiêu sản phẩm): Phổ biến trong các trang trại quy mô Đây là loại hình mà trong đó chủ trang trại tự bỏ vốn đầu tư, kinh doanh và tiêu thụ sản phẩm Hình thức này có những thời điểm thu được lợi nhuận cao, người chăn nuôi tự chủ trong kinh doanh, nhưng cũng có nhiều hạn chế như thiếu vốn đầu tư, tiêu thụ sản phẩm nhiều lúc gặp khó khăn, thiếu sự hỗ trợ về kỹ thuật, rủi ro cao, nhất là khi xảy ra dịch bệnh.
Tiêu thụ sản phẩm chủ yếu thông qua thương lái: Với phương thức tiêu thụ sản phẩm này, người chăn nuôi thường bị ép giá nhất là trong những thời điểm diễn biến bất lợi như là cung vượt cầu hoặc lúc bị dịch bệnh.
Tỷ lệ phân lập và kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt 55 1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt
4.2.1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt
Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ 120 mẫu phân gà thịt được nuôi tại các trang trại ở khu vực Hà Nội, được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà Địa điểm Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ
(Huyện, Thị Xã) kiểm tra dương tính (%)
Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy, trong 120 mẫu phân gà xét nghiệm, có 22 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 18,33% Trong đó, tỷ lệ phân lập được Salmonella cao nhất ở Thị xã Sơn Tây 40,00%, huyện Quốc Oai có số mẫu dương tính là 27,78%, huyện Thạch Thất 25,00% Các huyện Mỹ Đức, Chương
Mỹ, Ba Vì có số mẫu dương tính chiếm tỷ lệ lần lượt là 13,33%, 8,11% và 6,67%.
Biểu đồ 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà
Kết quả phân lập phản ánh sự khác biệt về tỷ lệ phân lập được Salmonella trong mẫu phân gà thịt được nuôi tại các trang trại ở các huyện, thị xã của thành phố Hà Nội Trong 6 địa điểm nghiên cứu, Thị xã Sơn Tây có tỷ lệ mẫu dương tính với Salmonella cao nhất Trong quá trình khảo sát và nghiên cứu tại 15 trại gà thịt của Thị xã Sơn Tây có một số trại có cơ sở vật chất và trang thiết bị (máng ăn, máng uống) còn thô sơ, vấn đề an toàn sinh học của trại chưa thực sự được đảm bảo Đó là nguyên nhân làm tỷ lệ gà nhiễm Salmonella cao Huyện Chương Mỹ có số lượng trại gà lớn nhất trong 6 địa điểm nghiên cứu, nhưng tỷ lệ mẫu phân gà nhiễm Salmonella chỉ chiếm tỷ lệ 3/37 trại Các trang trại gà ở huyện Chương Mỹ có trang bị máng ăn, máng uống hiện đại, chuồng trại trước khi nhập gà được vệ sinh sát trùng nghiêm ngặt, đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối trong quá trình chăn nuôi Qua kết quả nghiên cứu, cho thấy mô hình chăn nuôi cũng như các yêu tố liên quan đến vấn đề an toàn sinh học (nguồn cung cấp gà, sát trùng vệ sinh chuồng trại, quy trình chăm sóc và làm vaccine cho gà) ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các trại gà thịt.
Biểu đồ 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà
Salmonella là vi khuẩn có sức đề kháng cao với ngoại cảnh, lại có khả năng thích ứng, gây bệnh trên nhiều loại động vật, phân bố rộng khắp và là mối đe dọa đối với vật nuôi Tỷ lệ phân lập Salmonella ở các trại gà không có triệu chứng gây bệnh của Salmonella phản ánh tình trạng mang trùng trong đàn và là nguy cơ bùng phát bệnh do Salmonella gây ra tại các trại gà, đồng thời việc phát hiện Salmonella trong các mẫu phân gà xét nghiệm là mối đe dọa đến chất lượng thịt và trứng gà. Với các đàn gà thịt nuôi theo quy mô công nghiệp được nhập vào nhà máy chế biến thực phẩm có kết quả kiểm tra mẫu phân dương tính Salmonella có nguy cơ ảnh hưởng đến chất lượng thịt thương phẩm và các sản phẩm của thịt gà trong quá trình chế biến giết mổ.
Theo báo cáo của Tổ chức an toàn vệ sinh thực phẩm châu Âu năm 2010, sự lưu hành Salmonella ở gia cầm từ 0 tới 26.6 % Ở các nước phát triển như Mỹ, Anh, sự lưu hành Salmonella trên thịt gà là 4.2 % (n!2), và 4 % (n7) Sự có mặt của Salmonella trong gia cầm ở Việt Nam thấp hơn ở nhiều nước Đông Nam Á như Thái Lan (57 %, nu4), Campuchia (88.2 %, n2), và ở Trung Quốc(52.2 % , n =1.152), nhưng cao hơn sơ với Malaysia (35.5 %, nD5).
4.2.2 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng
Salmonella spp phân lập từ mẫu phân gà thịt.
Tất cả các chủng Salmonella spp phân lập được sau khi đã nhận định sơ bộ những đặc điểm đặc trưng về hình thái, tính chất nuôi cấy trên các môi trường Để có cơ sở đánh giá và định serotype, chúng tôi tiến hành nghiên cứu những đặc tính sinh vật, hóa học của chúng trên các môi trường giám định.
Kết quả cho thấy 100% chủng Salmonella spp nghiên cứu đều mọc và phát triển tốt trên các môi trường với những đặc điểm như sau:
- Môi trường XLD: Vi khuẩn Salmonella spp hình thành khuẩn lạc kích thước nhỏ, đường kính trung bình 0,5-1,5 mm, màu đen, trên nển môi trường màu sáng đỏ (hình 4.8)
Hình 4.4 Salmonella trên môi trường XLD
- Môi trường HE: Vi khuẩn Salmonella hình thành khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc (hình 4.9)
- Trên môi trường TSI: Các chủng Salmonella làm mặt thạch nghiêng chuyển màu đỏ, đáy màu vàng hoặc màu đen (sản sinh H2S) (hình 4.10)
Kiểm tra hình thái, khả năng di động, tính chất bắt màu, đặc tính sinh vật,hoá học của 22 chủng Salmonella spp phân lập từ mẫu phân gà thịt trên một số môi trường được trình bày ở bảng 4.4
Hình 4.5 Salmonella trên môi trường HE
Hình 4.6 Salmonella trên môi trường TSI và Lysine
Qua kết quả bảng 4.3 và 4.4 cho thấy, 100% các chủng Salmonella spp phân lập đều là trực khuẩn, bắt màu Gram âm, có khả năng di động Tất cả các chủng Salmonella spp phân lập đều có đặc tính sinh hoá như: sinh H2S (trên môi trường TSI), không sản sinh indole, phản ứng VP, β-galactosidase và ureaza đều cho kết quả âm tính, phản ứng Lysine decarboxylase dương tính (khử carboxyl củaLysine thành Cadaverin C5H14N2 làm cho môi trường có tính kiềm, chỉ thịBromocresol từ màu hồng chuyển thành màu tím.
Bảng 4.4 Đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng Salmonella spp phân lập từ mẫu phân gà thịt trên một số môi trường
STT Môi trường nuôi cấy Đặc tính Tỷ lệ (%)
Bảng 4.5 Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong các phản ứng sinh hóa Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng
Phần thạch nghiêng màu đỏ, đáy
2S TSI ống nghiệm màu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
Lysine Lysine decarboxylation decarboxylase medium β- galactosidase Đĩa giấy O.N.P.G
Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%
Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử Kovac’sKhông đổi màuMôi trường đục và có màu tímKhông đổi màu
Hình 4.7 Các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Salmonella
(TSI/ β-galactosidase/ Lysine decarboxylase / VP/ Ureaza/ Indole)
Song song với quá trình kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học trên các môi trường đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành thử các phản ứng lên men đường của các chủng Salmonella phân lập được Kết quả trình bày bảng 4.6.
Bảng 4.6 Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng Salmonella phân lập
Dương tính Tỷ lệ (%) Âm tính Tỷ lệ (%)
Từ kết quả trên chúng tôi thấy rằng 22/22 (100%) các chủng Salmonella phân lập được từ mẫu phân gà thịt có khả năng lên men các loại đường: glucose, dextrose, maltose, mannitol, sorbitol Vi khuẩn không có khả năng lên men các loại đường sau: lactose, sucrose và salicin.
Kết quả của chúng tôi phù hợp với thang mẫu các loại đường sử dụng trong phân lập chẩn đoán Salmonella do Quinn và cộng sự (1994) đề xuất Kết quả thử phản ứng lên men đường cũng thể hiện những đặc tính chung nhất của giống
Salmonella như Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997), Đặng Thị Oanh (2013) đã công bố.
Tất cả các chủng Salmonella spp phân lập được đều có những đặc tính sinh vật, hóa học điển hình phù hợp với tiêu chuẩn để nhận định vi khuẩn Salmonella của Carter và Cole (1990), Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2001) Từ kết quả ban đầu này cho phép tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn Salmonella.
Hình 4.8 Hình ảnh vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi
4.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SEROTYPE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
22 chủng Salmonella spp thể hiện các đặc tính sinh vật, hoá học điển hình để xác định serotype của các chủng vi khuẩn này bằng phương pháp huyết thanh học Trên cơ sở phân loại của White-Kauffman (WHO, 1983), tiến hành xác định nhóm vi khuẩn Salmonella spp phân lập theo hướng dẫn của hãng Remel. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7.
Kết quả định type kháng nguyên O theo nhóm cho thấy, các chủng
Salmonella spp phân lập được từ mẫu phân gà thịt nuôi ở các trang trại tại khu vực
Hà Nội thuộc nhóm E1 là cao nhất, chiếm tỷ lệ 12/22 (54,55%), sau đó là nhómD1, chiếm tỷ lệ 8/22 (36,36%) và 2/22 (9,09%) không xác định được nhóm Như vậy, các chủng Salmonella phân lập được từ mẫu phân gà thịt tại khu vực Hà Nội chủ yếu thuộc 2 nhóm E1 và D1.
Bảng 4.7 Kết quả xác định nhóm kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn
Nhóm huyết thanh Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Cấu trúc kháng nguyên
Ghi chú: (-) = Không xác định được cấu trúc kháng nguyên
Biểu đồ 4.3 Kết quả xác định nhóm huyết thanh Salmonella spp Âm tính Dương tính
Hình 4.14 Phản ứng ngưng kết giữa Salmonella với kháng huyết thanh O đa giá
Sau khi xác định nhóm huyết thanh của các chủng Salmonella bằng kháng huyết thanh O đơn giá, chúng tôi tiến hành tiếp bằng kháng huyết thanh H pha 1 và pha 2 để xác định serotype vi khuẩn Salmonella phân lập Kết quả được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4.8 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập (n") Kháng nguyên H
Thành phần Thành phần Kết quả pha 1 pha 2 (+) (%) g, m - 8/22 36,36 S enteritidis e, h l, w 5/22 22,73 S meleagridis g, m - 4/22 18,18 S suberu g, m, s - 3/22 13,64 S amsterdam
Kết quả ở bảng 4.8 cho thấy, trong 22 chủng Salmonella spp nghiên cứu, có
8 chủng thuộc nhóm D1 là Salmonella enteritidis chiếm tỷ lệ 36,36%; có 5 chủng thuộc nhóm E1 là S meleagridis chiếm tỉ lệ 22,73%, có 4 chủng (18,18%) là S. suberu và 3 chủng (13,64%) là S amsterdam.
Biểu đồ 4.4 Kết quả định chủng Salmonella từ mẫu phân gà thịt tại khu vực Hà Nội
Kết luận
Qua kết quả nghiên cứu thu được như trên, chúng tôi bước đầu có một số kết luận sau:
- Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp trong mẫu phân gà thịt nuôi tại các trang trại ở khu vực Hà Nội là 18,33%, trong đó tỷ lệ nhiễm Salmonella cao nhất là Thị xã Sơn Tây 40%, huyện Quốc Oai 27,78%, huyện Thạch Thất 25%, huyện Mỹ Đức 13,33%, huyện Chương Mỹ 8,11%, huyện Ba Vì 6,67%.
Vi khuẩn Salmonella spp phân lập từ các mẫu phân gà thịt mang đầy đủ các đặc tính sinh vật, hoá học của giống Các chủng Salmonella thuộc nhóm E1 có tỷ lệ cao nhất 54,55%, nhóm D1 36,36%, 9,09% chưa xác định được nhóm.
- Chủng Salmonella đang lưu hành nhiều nhất tại các trang trại gà thịt ở khu vực Hà Nội là S enteritidis 36, 36%; Sau đó là các chủng S meleagridis, S suberu, S. amsterdam với các tỷ lệ lần lượt là 22,73%, 18,18%, 13,64%.
Đề nghị
- Cần cải thiện điều kiện chăn nuôi, nâng cao an toàn sinh học của các chuồng trại.
- Tiếp tục nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng phân lập được, xác định nguy cơ lây nhiễm Salmonella tại các trang trại gà thịt ở Hà Nội.
- Nghiên cứu sự lưu hành Salmonella theo mùa.
- Nghiên cứu sự lưu hành Salmonella từ quá trình chế biến đến vận chuyển và tiêu thụ.
