(Luận văn) một số đặc tính sinh học của virus cúm a h9n2 phân lập trên đàn gà tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MAI THÙY DƯƠNG lu an n va MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM p ie gh tn to A/H9N2 PHÂN LẬP TRÊN GÀ TẠI VIỆT NAM oa nl w Thú y d Ngành: lu 60.64.01.01 an Mã số: TS Lê Văn Phan nf va Người hướng dẫn khoa học: oi lm ul PGS.TS Tô Long Thành z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP – 2017 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 lu Tác giả luận văn an n va tn to p ie gh Mai Thùy Dương d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn khoa học TS Lê Văn Phan, PGS.TS Tơ Long Thành tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài lu an Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ va môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận n tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn đoán Thú y Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực gh tn to Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Trung tâm Chẩn p ie đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo w điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn oa nl thành luận văn./ d Hà Nội, ngày tháng năm 2017 lu oi lm ul nf va an Tác giả luận văn z at nh Mai Thùy Dương z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix lu Thesis Abstract xi an Phần Mở đầu n va Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.4 Những đóng góp đề tài ie gh tn to 1.1 p Phần Tổng quan tài liệu Sơ lược bệnh cúm gia cầm Virus cúm gia cầm d oa 2.2.2 Khái niệm bệnh cúm gia cầm nl 2.1.1 w 2.1 lu 2.2.2.1 Đặc điểm sinh học phân tử virus cúm gia cầm va an 2.2.2.2 Đặc tính kháng nguyên virus 2.2.2.3 Độc lực virus cúm nf Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 10 oi lm ul 2.2.3 2.2.3.1 Triệu chứng 10 2.2.3.2 Bệnh tích 11 z at nh 2.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm 11 2.2.4.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích 11 z Dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 tình hình nghiên cứu cúm gia cầm gm 2.2 @ 2.2.4.2 Chẩn đoán phịng thí nghiệm 11 l A/H9N2 giới 12 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 giới 12 2.2.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm A/H9N2 giới 14 2.3 Dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 tình hình nghiên cứu cúm gia cầm m co 2.2.1 an Lu A/H9N2 Việt Nam 17 n va ac th iii si 2.3.1 Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm A/H9N2 Việt Nam 17 2.3.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm A/H9N2 Việt Nam 18 Phần Nội dung - nguyên liệu – phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Nội dung nghiên cứu 19 3.2 Địa điểm nghiên cứu 19 3.3 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 20 lu an 3.3.2.2 Phương pháp mổ khám toàn diện 20 va 3.3.2.3 Phương pháp phân lập phôi trứng gà 22 n 3.3.2.4 Xác định số EID50, TICD50 23 3.3.2.6 Phương pháp HA 26 gh tn to 3.3.2.5 Phương pháp xác định số độc lực virus (IVPI) 24 p ie 3.3.2.7 Phát virus phản ứng Realtime RT-PCR 26 3.3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 28 nl w Phần Kết thảo luận 29 Khảo sát lưu hành virus cúm A/H9 số tỉnh Việt Nam 29 4.2 Phân lập giám định virus cúm A/H9N2 số tỉnh Việt Nam 31 4.3 Xác định số đặc tính sinh học virus cúm gia cầm A/H9N2 phân d oa 4.1 an lu nf va lập gà Việt Nam 33 Đặc tính sinh trưởng phát triển virus phôi trứng gà 33 4.3.2 Đặc tính sinh trưởng phát triển virus tế bào xơ phôi gà (CEF) 35 4.3.3 Đặc tính sinh trưởng phát triển virus tế bào dòng MDCK 37 4.3.4 So sánh khả phát triển virus cúm gia cầm A/H9N2 loại oi lm ul 4.3.1 z at nh môi trường nuôi cấy 39 Đặc tính thích ứng ổn định virus cúm A/H9N2 môi trường z @ 4.3.5 gm phôi trứng gà 42 Xác định độc lực virus cúm A/H9N2 phân lập gà Việt Nam 43 4.4.1 Xác định số độc lực qua tiêm tĩnh mạch - IVPI 43 4.4.2 Đánh giá mật độnhiễm virus cúm A/H9N2 quan phủ tạng 46 4.4.3 Đánh giá mức độ thải virus gà gây nhiễm 51 m co l 4.4 an Lu Phần Kết luận kiến nghị 53 n va ac th iv si 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 Các cơng trình cơng bố 54 Tài liệu tham khảo 55 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Nghĩa tiếng Việt AAHL (Australian animal health laboratory) Phịng thí nghiệm sức khỏe động vật Úc AI (Avian Influenza) Cúm gia cầm ARN(Ribonucleic acid) Axit ribonucleic CEF (Chicken Embryo Fibroblast) Tế bào xơ phôi gà CPE (Cytopathic effect) Bệnh tích tế bào CSIRO (Commonwealth Scientific & Tổ chức nghiên cứu khoa học công Industrial Research Organization) nghệ Úc EID50(Embryo Infection Dose 50%) Liều gây nhiễm 50% phôi FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Lương thực nông nghiệp Liên hợp quốc gh tn to Chữ viết tắt FBS (Fetal Bovine serum) Huyết thai bò ie Phản ứng ngưng kết hồng cầu p HA (Haemagglutination assay) HPAI (Highly Pathogenic Avian influenza) w Cúm gia cầm độc lực thấp oa nl LPAI (Low Pathogenic Avian influenza) Cúm gia cầm độc lực cao MDCK (Mardine Darby Canine Kidney) Tế bào thận chó Madin-Darby d Protein không cấu trúc an lu NS (Non- Strutural protein) Tổ chức y tế giới PBS (Phosphate Buffered Saline) Dung dịch muối đệm phốt phát ul nf va OIE (Office International des Epzooties) Phản ứng chuỗi Polyme phiên mã ngược Polymerase Chain Reaction) theo thời gian thực oi lm rRT-PCR (realtime Reverse Transcriptase – Liều gây nhiễm 50% tế bào z at nh TCID50(Tissue Culture Infection Dose 50%) z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số liệu tính tốn theo phương pháp Reed-Muench 24 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định số độc lực virus (IVPI) 25 Bảng 3.3 Trình tự primer probe phát virus cúm gia cầm A/H9N2 27 Bảng 3.4 Hỗn hợp nguyên liệu (Master mix) cho phản ứng RRT-PCR 28 Bảng 4.1 Kết xác định virus cúm A/H9 số tỉnh Việt Nam 29 Bảng 4.2 Kết phân lập giám định virus H9N2 31 lu Bảng 4.3 Kết định tính định tên chủng virus cúm gia cầm H9N2 32 an Bảng 4.4 Kết kiểm tra hiệu giá HA virus cúm A/H9N2 34 n va Bảng 4.5 Kết kiểm tra hiệu giá HA virus cúm A/H9N2 36 Bảng 4.7 Kết kiểm tra phát triển virus cúm A/H9N2 loại môi gh tn to Bảng 4.6 Kết kiểm tra hiệu giá HA virus cúm A/H9N2 38 trường nuôi cấy 40 ie p Bảng 4.8 Kết xác định hiệu giá chủng virus cúm A/H9N2 qua đời w nuôi cấy (10x EID50/ml) 42 oa nl Bảng 4.9 Kết đánh giá độc lực virus cúm gia cầm A/H9N2 44 Bảng 4.10 Kết xác định virus cúm A/H9N2 số phủ tạng gà gây d oi lm ul nf va an lu nhiễm chuyển đổi sang hiệu giá virus 48 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh virus cúm A gia cầm Hình 2.2 Hệ gen virus Hình 4.1 Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H9 số tỉnh Việt Nam 30 Hình 4.2 Hình ảnh số phản ứng phân lập giám định 31 Hình 4.3 Khả sinh trưởng virus cúm A/H9N2 theo thời gian 34 Hình 4.4 Hình ảnh phơi trứng gà sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 35 lu Hình 4.5 Khả sinh trưởng virus cúm A/H9N2 theo thời gian 36 an Hình 4.6 Hình ảnh tế bào CEF sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 37 va Hình 4.7 Khả sinh trưởng virus cúm A/H9N2 theo thời gian 38 n Hình 4.9 So sánh phát triển virus cúm A/H9N2 loại mơi trường gh tn to Hình 4.8 Hình ảnh tế bào MDCK sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 39 ie phản ứng HA 41 p Hình 4.10 Hiệu giá chủng virus cúm A/H9N2 qua đời nuôi cấy 43 nghiệm 45 oa nl w Hình 4.11 Kết đánh giá điểm lâm sàng cá thể gà sau 10 ngày thí d Hình 4.12 Một số hình ảnh gà sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 thí an lu nghiệm xác định độc lực 46 va Hình 4.13 Hiệu giá virus quan phủ tạng qua phương pháp rRT-PCR ul nf (log10) 49 oi lm Hình 4.14 Một số hình ảnh bệnh tích mổ khám gà chết sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 50 z at nh Hình 4.15 Mức độ thải virus cúm A/H9N2 51 z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Họ tên học viên: Mai Thùy Dương Tên luận văn: Một số đặc tính sinh học virus cúm A/H9N2 phân lập gà Việt Nam Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam lu Mục đích nghiên cứu: an - Bước đầu xác định số đặc tính sinh học chủng virus cúm H9N2 va Việt Nam n Nội dung nghiên cứu gh tn to Phương pháp nghiên cứu p ie - Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/ H9 gia cầm sống bán chợ thuộc số tỉnh Việt Nam w - Phân lập giám định virus cúm A/H9N2 mẫu bệnh phẩm swab phủ oa nl tạng gia cầm d - Xác định số đặc tính sinh học chủng virus cúm A/H9N2 phân lập an lu gà Việt Nam oi lm Nguyên liệu nghiên cứu ul nf mạch - IVPI) va - Xác định độc lực chủng virus cúm A/H9N2 (phương pháp tiêm truyền tĩnh - Mẫu ARN dương tính cúm type A mẫu dịch swab hầu họng lấy gia z at nh cầm sống chợ thuộc số tỉnh Việt Nam - Dịch swab hầu họng gia cầm sống chợ z - Mẫu bệnh phẩm phủ tạng gia cầm nghi mắc cúm l - Tế bào dòng MDCK tế bào xơ phôi gà gm @ - Phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi m co - Gà tuần tuổi khỏe mạnh chưa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm khơng có kháng thể cúm gia cầm - Phương pháp phân lập nhân giống virus an Lu Phương pháp nghiên cứu n va ac th ix si phủ tạng không thực việc thu thập mẫu phủ tạng (não, tim, phổi khí quản, gan, lách, thận, ruột – tụy lơng) gà chết thí nghiệm, nghiền với PBS pH=7,2thành huyễn dịch 10%, sau xét nghiệm phương pháp Realtime RT-PCR phát gen H9/HA virus cúm A/H9N2.Phản ứng Realtime PCR tính tốn tương đối xác lượng virus có mẫu xét nghiệm, chúng tơi chuyển đổi kết xét nghiệm rRT- PCR sang chuẩn độ virus phôi trứng (log10 EID50) dựa hiệu giá virus biết sau chuẩn độ phôi trứng để đánh giá chi tiết mức độ nhiễm virus loại phủ tạng Như nêu trên, thu thập loại quan khác lu gà chết thí nghiệm để đánh giá khả nhiễm đa phủ tạng, kết an chi tiết trình bày bảng 4.10 hình 4.13 va n Kết bảng 4.10 hình 4.13 cho thấy phương pháp rRT-PCR có gh tn to 29,16% mẫu phủ tạng thu thập gà chết sau gây nhiễm có kết dương tính với virus cúm gia cầm A/H9N2 Tuy nhiên mẫu khí quản p ie khác có mức độ nhiễm virus khác nhau: Phổi – khí quản quan nhiễm virus nhiều với hiệu giá virus trung nl w bình 6,43±1,36 log10EID50 (giá trị Ct trung bình 23,34±4,26) oa Não quan nhiễm virus nhiều thứ sau phổi với hiệu giá virus trung d bình 4,44 ± 1,71 log10 EID50 (giá trị Ct trung bình 29,62 ± 5,37) lu an Tại quan tim, gan, lách, thận, ruột tụy có mặt virus nf va mức thấp Hiệu giá virus dao động log10 EID50 ul Đặc biệt lông gà chết sau gây nhiễm virus hồn tồn khơng phát oi lm thấy virus cúm gia cầm A/H9N2 Kết nghiên cứu tương tự với nghiên cứu z at nh nhà khoa học Trung Quốc (Yuan et al., 2015) mức độ nhiễm virus cúm H9N2 quan phủ tạng sau gây nhiễm cho thấy lượng virus phát z phổi cao so với quan phủ tạng khác tim, gan, lách… @ gm So sánh nghiên cứu với nghiên cứu Guo cộng (Guo et al., m co l 2000) cho kết tương tự hiệu giá virus tổ chức phổi nhiều tổ chức não gà sau gây nhiễm virus cúm H9N2 an Lu n va ac th 47 si lu an n va Phổi -khí quản Não p ie Gà gh tn to Bảng 4.10 Kết xác định virus cúm A/H9N2 số phủ tạng gà gây nhiễm chuyển đổi sang hiệu giá virus Log10 Ct oa nl w Ct Tim Gan Lách Thận Ruột - Tụy Lông Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 34,90 2,76 27,69 5,05 40,00 1,15 40,00 1,15 38,42 1,65 40,00 1,15 33,88 3,09 40,00 1,15 24,17 6,17 19,17 7,76 36,65 2,21 40,00 1,15 40,00 1,15 37,72 1,87 40,00 1,15 40,00 1,15 29,80 4,38 23,17 6,49 38,88 1,50 38,85 1,51 40,00 1,15 40,00 1,15 40,00 1,15 40,00 1,15 TB 29,62 4,44 23,34 6,43 38,51 1,62 39,62 1,27 39,47 1,32 39,24 1,39 37,96 1,80 40,00 1,15 Std 5,37 1,71 4,26 1,36 0,54 0,66 0,21 0,91 0,29 1,32 0,42 3,53 1,12 0,00 0,00 d ul nf va an lu oi lm 1,71 z at nh Chú thích: TB: trung bình Std: độ lệch chuẩn z m o l.c gm @ an Lu n va 48 ac th si lu an n va p ie gh tn to oa nl w Hình 4.13 Hiệu giá virus quan phủ tạng qua phương pháp rRTPCR (log10) d Ngoài so sánh kết nghiên cứu với kết nghiên cứu an lu virus cúm độc lực cao A/H5N1 nhà khoa học Đài Loan (Lee et al., 2007) va thấy có khác hoàn toàn mức độ nhiễm virus gây gà gây cầm chết sau gây nhiễm oi lm ul nf nhiễm virus A/H5N1 virus xuất khắp quan phủ tạng gia Kết khác với kết đánh giá độc lực virus cúm A/H5N1 z at nh clade gà Nguyễn Tùng cộng thực hiện(Nguyễn Tùng cs., 2011)ở điểm phổi quan nhiễm nhiều virus H9N2 sau tổ chức não z thí nghiệm gây nhiễm H9N2 cịn thí nghiệm gây nhiễm H5N1 @ gm Nguyễn Tùng cs Thì não lại quan nhiễm nhiều virus sau tổ l chức phổi m co Mặc dù hiệu giá virus cúm H9N2 quan phủ tạng sau lây nhiễm thấp khác chứng tỏ virus có tính hướng đa tổ chức an Lu n va ac th 49 si lu an va n Phổi xuất huyết Não sung huyết p ie gh tn to d oa nl w ul nf va an lu Tuyến tụy xuất huyết oi lm Khí quản xuất huyết chứa dịch nhầy z at nh Hình 4.14 Một số hình ảnh bệnh tích mổ khám gà chết sau gây nhiễm virus cúm A/H9N2 z Đồng thời virus phân bổ nhiều tổ chức phổi – khí quản dẫn đến @ gm ảnh hưởng hô hấp làm giảm sức đề kháng vật dễ kéo theo l bệnh đường hô hấp hen Bên cạnh virus có phát triển tổ chức m co não không nhiều nên không gây triệu chứng thần kinh triệu chứng toàn thân virus cúm thể độc lực cao, từ gia cầm nhiễm an Lu virus khơng có biểu bệnh lý nặng dẫn đến tử vong cấp tính, minh chứng cho thí nghiệm gà chết n va ac th 50 si 4.4.3 Đánh giá mức độ thải virus gà gây nhiễm Cùng với việc theo dõi hàng ngày đánh giá điểm lâm sàng suốt thời gian thực thí nghiệm xác định độc lực virus cúm A/H9N2, tiến hành thu thập mẫu dịch ngoáy hầu họng dịch ngoáy ổ nhớp (swab) gà lơ thí nghiệm chết sống vào ngày thứ 3, ngày thứ ngày thứ 10 sau gây nhiễm để đánh giá độ thải virus thời điểm khác Các mẫu swab bảo quản dung dịch đệm PBS (1 ml), sau xét nghiệm phương pháp Realtime RT- PCR Kết trình bày hình 4.15 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh Hình 4.15 Mức độ thải virus cúm A/H9N2 z Kết hình 4.15 cho thấy loại mẫu dịch swab kiểm tra hầu họng ổ nhớp phát thấy virus cúm A/H9N2 loại mẫu swab hầu @ gm họng gà gây nhiễm, không phát thấy virus cúm mẫu swab ổ nhớp l gà thời gian 10 ngày theo dõi m co Trong thời điểm lấy mẫu dịch swab gà ngày 3, ngày ngày 10 sau n va ngày gây nhiễm gà dừng việc thải virus cúm A/H9N2 an Lu gây nhiễm để đánh giá thài virus cúm A/H9N2 thí nghiệm ngày thứ sau gây nhiễm thời điểm gà thải virus nhiều Và sau ac th 51 si Kết nghiên cứu tương tự kết nghiên cứu nhà khoa học Nhật Bản (Nomura et al., 2012) đường thải virus H9N2 sau gây nhiễm gà cho thấy virus xuất mẫu dịch ngoáy hầu họng, khơng thấy có mặt virus mẫu dịch ngoáy ổ nhớp gà sau 10 ngày gây nhiễm So sánh với kết nghiên cứu Guo cộng (Guo et al., 2000) thời gian thải virus, chúng tơi thấy thí nghiệm có kết tương tự sau ngày gây nhiễm gà bắt đầu dừng thải virus bên qua đường hầu họng lu an Ngoài so với nghiên cứu virus cúm A/H5 Connie cộng n va (Connie Leung et al., 2013), nghiên cứu có khác đường thải virus cụ thể nghiên cứu Connie viruscúm A/H5 thải qua gh tn to đường hầu họng ổ nhớp nghiên cứu H9N2 virus thải qua đường hầu họng Bên cạnh so với kết số nghiên cứu đánh giá p ie độc lực cúm A/H5N1 thực Trung tâm Chẩn đốn trước (Cục Thú y, 2014, 2015) nghiên cứu có khác biệt thời gian thải d oa nl w virus đường thải virus Trong thí nghiệm virus cúm A/H5N1 trước đây, thải virus cúm H5N1 xác định xảy đường hầu họng ổ nhớp đồng thời thời gian thải virus kéo dài đến ngày cuối sau gây va an lu nhiễm (ngày 10) thí nghiệm.Tuy nhiên thí nghiệm chúng tơi thời gian thải virus cúm H9N2 đến hết ngày thứ sau gây nhiễm virus ul nf thải qua đường hầu họng oi lm Việc phát virus cúm A/H9 có mẫu swab hầu họngmà khơng có mẫu swab ổ nhớp gà gây nhiễm chứng tỏ virus chủ yếu thải qua đường hơ hấp, khơng thải qua đường tiêu hóa Điều cho thấy virus z at nh cúm A/H9N2 có khả dễ lây lan theo đường khơng khí dẫn đến tình trạng lưu hành virus cúm A/H9N2 gia cầm cao so với loại virus cúm độc z m co l gm @ lực cao khác A/H5N1 an Lu n va ac th 52 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Tỷ lệ lưu hành cúm A/H9 đàn gia cầm sống bán chợ thuộc tỉnh Việt Nam Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội Hà Giang chiếm tỷ lệ trung bình 19,99% - Trong tổng số 423 mẫu virus phân lập từ tỉnh Việt Nam có 20 mẫu phân lập giám định dương tính cúm A/H9N2 - Trong loại môi trường nuôi cấy phôi trứng gà 9-11 ngày tuổi, tế bào lu xơ phôi gà CEF tế bào dòng MDCK, chủng virus cúm A/H9N2 phân lập gà Việt Nam thích nghi tốt môi trường phôi trứng gà 9- 11 ngày tuổi an n va không gây chết phôi trứng, đạt hiệu giá virus trung bình từ 108 - 108,83 tn to EID50/ml gh - Kết xác định độc lực virus cúm A/H9N2 phân lập gà Việt p ie Nam cho thấy: + Virus có độc lực thấp với số IVPI đạt 0,52 nl w + Virus gây nhiễm đa phủ tạng chủ yếu phổi, não phổi oa quan virus phát triển cóhiệu giá cao nhất6,43±1,36 log 10EID50 d + Virus chủ yếu thải qua đường hầu họng gà, không thải lu va an qua đường hậu môn nhớp + Virus sau ngày gây nhiễm dừng thải qua đường hầu họng oi lm ul nf 5.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành nghiên cứu tỷ lệ nhiễm cúm A/H9 chợ gia cầm z at nh sống miền Trung Tiến hành nghiên cứu giải trình tự gen virus cúm A/H9N2 phân lập z Việt Nam @ Tiến hành nghiên cứu xác định đặc tính kháng nguyên virus cúm gm A/H9N2 m co l an Lu n va ac th 53 si CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Duong Mai Thuy, Thomas P.Peacock, Vu Thi Ngoc Bich, Thomas Fabrizio, Dang Nguyen Hoang, Nguyen Dang Tho, Nguyen Thi Diep, Minh Nguyen, Le Nguyen Minh Hoa, Hau Thi Thu Trang, Marc Choisy, Ken Inui, Scott Newman, Nguyen vu Trung, Rogier van Doorn, Thanh Long To, Munir Iqbal, Juliet E.Bryant (2016), “Prevalence and diversity of H9N2 avian influenza in chickens of Northern Viet Nam, 2014, Infection Genetics and Evolution (44) 530-540 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 54 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005) Kế hoạch dự phòng chống dịch cúm gia cầm chủng độc lực cao Việt Nam, Hà Nội Cục Thú y (2014) Báo cáo tóm tắt kết cơng tác thú y 2014 kế hoạch công tác năm 2015 Cục Thú y (2015) Báo cáo tóm tắt kết công tác thú y 2015 kế hoạch công tác năm 2016 lu Lê Thanh Hòa (2004) Họ Orthomyxoviridae nhóm virus cúm A gây bệnh cúm an gà người Viện khoa học công nghệ n va Lê Thanh Hòa (2006) Y-sinh học phân tử Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Năm (2004) Bệnh cúm gà Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y Tập XI (1), tr 81-86 Nguyễn Tiến Dũng (2008) Vài nét virus cúm gia cầm H5N1 Tạp chí Khoa học p ie gh tn to kỹ thuật thú y Tập XV (số 4), tr 80-86 w Nguyễn Tiến Dũng, Alik Peiris, Obert Webster, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, nl Nguyễn Thế Vinh, Ken Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không Ngô Thanh d oa Long (2004) Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 2003 - 2004 lu Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập 11 (3), tr.6-14 va an Nguyễn Tùng, Nguyễn Hồng Đăng, Ngơ Thị Thu Hương, Đỗ Thị Hoa, Nguyễn Văn Cảm Nguyễn Bá Hiên (2011) Độc lực virus cúm gia cầm độc lực cao nf Tiếng Anh: oi lm ul H5N1 nhánh gia cầm Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Taaph 2, tr.5-10 10 Abdel-Moneim A S., M A Afifi and M A El-kady (2012) Isolation and z at nh mutation trend analysis of influenza A virus subtype H9N2 in Egypt Virology 113 Vol pp 173-192 z @ 11 Baigent S and J McCauley (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk- gm length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses l in tissue culture Virus Res Vol 79 (1-2) pp 177-185 m co 12 Bender C., H Hall, J Huang, A Klimov, N Cox, A Hay, V Gregory, K Cameron, W Lim and K Subbarao (1999) Characterization of the surface proteins an Lu of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 - 1998 Virology 254 Vol pp 115-123 n va ac th 55 si 13 Bosch F., W Garten, H Klenk and R Rott (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses Virology Vol 113 pp 725-735 14 Butt K M., G J Smith, H Chen, L J Zhang, Y H Leung, K M Xu, W LIM, R G Webster, K Y Yuen, J S Peiris and Y Guan (2005) Human Infection with an Avian H9N2 Influenza A Virus in Hong Kong in 2003 Journal of Clinical Microbiology Vol 43 (11) pp 5760-5767 15 Castrucci M and Y Kawaoka (1993) Biologic importance of neuraminidase stalk lu length in influenza A virus J Virol67 Vol pp 759-764 an 16 Conenello G., D Zamarin, L Perrone, T Tumpey and P Palese (2007) A single va n mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes 17 Cong Y L., J Pu, Q F Liu, S Wang, G Z Zhang, X L Zhang, W X Fan, E G gh tn to to increased virulence PLoS Pathog Vol (10) pp 1414-1421 p ie Brown and J H Liu (2007) Antigenic and genetic characterisation of H9N2 swine influenza viruses in China Journal of General Virology Vol 88 pp 2035-2041 w 18 Connie Leung Y H., G Luk, S F Sia, Y O Wu, C K Ho, K C Chow, S C oa nl Tang, Y Guan and J S Malik Peiris (2013) Experimental challenge of chicken d vaccinated with commercially available H5 vaccines reveals loss of protection to Vol 31 10.1016/j.vaccine.2013.05.076 (35) pp 3536-42 từ ul nf Vaccine 10.1016/j.vaccine.2013.05.076: va Kong/China an lu some highly pathogenic avian influenza H5N1 strains circulating in Hong oi lm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23791547 19 De Wit E and R Fouchier (2008) Emerging influenza J Clin Virol Vol 41 (1) z at nh pp 1-6 20 Gambotto A., S Barratt-Boyes, M de Jong, G Neumann and Y Kawaoka (2008) z Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus Lancet Vol 371 gm @ (9622) (14641475 Review.) 21 Guo Y J., S Krauss, D A Senne, I P Mo, K S Lo, X P Xiong, M Norwood, l K F Shortridge, R G Webster and Y Guan (2000) Characterization of the m co pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages pp 279-88 từ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10662623 an Lu in Asia 10.1006/viro.1999.0115: 10.1006/viro.1999.0115 Virology Vol 267 (2) n va ac th 56 si 22 Hotta K., H Takakuwa, Q M Le, S L Phuong, T Murase, E Ono, T Ito, K Otsuki and T Yamashiro (2012) Isolation and characterization of H6N1 and H9N2 avian influenza viruses from Ducks in Hanoi, Vietnam 10.1016/j.virusres.2011.11.004: 10.1016/j.virusres.2011.11.004 Virus Res Vol 163 (2) pp 448-53 từ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22108585 23 Iqbal M., T Yaqub, K Reddy and J W McCauley (2009) Novel genotypes of H9N2 influenza A viruses isolated from poultry in Pakistan containing NS genes similar to highly pathogenic H7N3 and H5N1 viruses 10.1371/journal.pone.0005788: 10.1371/journal.pone.0005788 PLoS One Vol lu (6) pp e5788 từ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19517011 an 24 Ito T., J Couceiro, S Kelm, L Baum, S Krauss, M Castrucci, I Donatelli, H va n Kida, J Paulson, R Webster and Y Kawaoka (1998) Molecular basis for the tn to generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential J Virol Vol 72 gh pp 7367-7373 ie 25 Ito T and K Y (1998) Avian influenz Blackwell sciences Ltd Vol pp 126-136 p 26 Karthik S., M F Mohammed, J E Lisa, W David, A Smrabiul, H Mkamrul, M S w Pamela, K Scott, J W Richard and G R Robert (2014) Genesis of avian influenza oa nl H9N2 in Bangladesh Emerging Microbes and Infection Vol (12) pp 88 d 27 Keawcharoen J., A Amonsin, K Oraveerakul, S Wattanodorn, T Papravasit, S an lu Karnda, K Lekakul, R Pattanarangsan, S Noppornpanth, R Fouchier, A va Osterhaus, S Payungporn, A Theamboonlers and Y Poovorawan (2005) ul nf Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza oi lm virus isolates from different avian species in Thailand Acta Virol Vol 49 (4) 28 Keawcharoen J., D van Riel, G van Amerongen, T Bestebroer, W E Beyer and z at nh R van Lavieren (2008) Wild ducks as long- distance vectors of highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) Emerging Infectious Diseases Vol 14 pp 600- 607 z 29 Khawaja J Z., K Naeem, Z Ahmed and S Ahmad (2005) Surveillance of Avian gm @ Influenza Viruses in Wild Birds in Areas Adjacent to Epicenter of an out Break in Federal Capital Territory of Pakistan International Journal of Poultry Science Vol l (1) pp 39-43 m co 30 Kim K I., J G Choi, H M Kang, T L To, T D Nguyen, B M Song, M S an Lu Hong, K S Choi, S J Kye, J Y Kim, H S Lee and Y J Lee (2013) Geographical distribution of low pathogenic avian influenza viruses of domestic n va ac th 57 si poultry in Vietnam and their genetic relevance with Asian isolates 10.3382/ps.2013-03105: 10.3382/ps.2013-03105 Poult Sci Vol 92 (8) pp 201223 từ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23873548 31 Lee M S., M C Deng, Y J Lin, C Y Chang, H K Shieh, J Z Shiau and C C Huang (2007) Characterization of an H5N1 avian influenza virus from Taiwan Vet Microbiol Vol 124 pp 193–201 32 Luong G and P Palese (1992) Genetic analysis of influenza virus Curr Opinion Gen Develop Vol pp 77-81 33 Murphy B R and Webster (1996) Orthomyxoviruses In Fields B.N., Knipe lu D.M., Howley P.M, (eds.), Fields Virology Lippincott-Raven Publishers, an Philadelphia, pp Vol pp 1397-1445 va n 34 Nagarajan S., K Rajukumar, C Tosh, V Ramaswamy, K Purohit, G Saxena, P tn to Behera, B Pattnaik, H K Pradhan and Dubey (2009) Isolation and pathotyping gh of H9N2 avian influenza viruses in Indian poultry Veterinary Microbiology Vol ie 133 (1-2) pp 154-163 p 35 Nomura N., Y Sakoda, M Endo, H Yoshida, N Yamamoto, M Okamatsu, K w Sakurai, N V Hoang, L V Nguyen, H D Chu, T N Tien and H Kida (2012) oa nl Characterization of avian influenza viruses isolated from domestic ducks in d Vietnam in 2009 and 2010 10.1007/s00705-011-1152-3: 10.1007/s00705-011Arch Virol Vol 157 (2) pp 247-57 từ an lu 1152-3 va http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22068881 ul nf 36 Okamatsu M., T Nishi, N Nomura, N Yamamoto, Y Sakoda, K Sakurai, H D oi lm Chu, L P Thanh, L Van Nguyen, N Van Hoang, T N Tien, R Yoshida, A Takada and H Kida (2013) The genetic and antigenic diversity of avian influenza z at nh viruses isolated from domestic ducks, muscovy ducks, and chickens in northern and southern Vietnam, 2010-2012 10.1007/s11262-013-0954-7: 10.1007/s11262Virus Genes Vol z 013-0954-7 47 (2) pp 317-29 từ gm @ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23861018 37 Römer-Oberdörfer A., J Veits, D Helferich and T ettenleiter (2008) Level of l protection of chickens against highly pathogenic H5 avian influenza virus with m co Newcastle disease virus based live attenuated vector vaccine depends on homology an Lu of H5 sequence between vaccine and challenge virus Vaccine Vol 26 (19) pp 2307-2313 n va ac th 58 si 38 Scholtissek C., J Stech, S Krauss and R Webster (2002) Vol 39 Sekellick M., S Carra, A Bowman, D Hopkins and P Marcus (2000) Transient resistance of influenza virus to interferon action attributed to random multiple packaging and activity of NS genes J Interferon Cytokine Res Vol 20 (11) pp 963-970 40 Stubb E L., I H E Biester and L H S (eds) (1965) Disease of Poultry Iowa State Univeristy Press, Ames Vol pp 813-822 41 Suares D L., M L Perdue and D E Swayne (1998) Comparisons of hightly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong lu Kong J Viriol Vol 72 (pp) pp 6678-6688 an 42 Subbarao K., A Klimov, J Katz, H Regnery, W Lim and H Hall (1998) va n Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a 43 Tian G., S Zhang, Y Li, Z Bu, P Liu, J Zhou, C Li, J Shi, K Yu and H Chen gh tn to fatal respiratory illness Science Vol 279 pp 393-396 p ie (2005) Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics Virology 113 Vol 341 (1) pp 153-162 w 44 Tombari W., J Nsiri, I Larbi, J L Guerin and A Ghram (2011) Genetic evolution oa nl of low pathogenecity H9N2 Avian influenza viruses in Tunisia: acquisition of new d mutations Virology Journal Vol pp 467 an lu 45 Tong S., X Zhu, Y Li, M Shi, J Zhang, M Bourgeois, H Yang, X Chen, S va Recuenco, J Gomez, L.-M Chen, A Johnson, Y Tao, [ ] and R O Donis ul nf (2013) New World Bats Harbor Diverse Influenza A Viruses journal.ppa Vol oi lm 46 Tosh C., S Nagarajan, P Behera, K Rajukumar, K Purohit, R P Kamal, H V Muragkar, S Gounalan, B Pattnaik, P R Vanamayya, H K Pradhan and S C z at nh Dubey (2008) Genetic analysis of H9N2 avian influenza viruses isolated from India Archives of Virology Vol 153 pp 1433-1439 z 47 Tumpey T M., D L Suarez, L E Perkins, D A Senne, J G Lee, Y J Lee, I P gm @ Mo, H W Sung and D E Swayne (2002) Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat J Virol Vol 76 pp l 6344–6355 m co 48 Uiprasertkul M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K an Lu Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar and n va ac th 59 si P Auewarakul (2007) Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans Emerg Infect Dis Vol 13 (5) pp 708-712 49 Wang J., D Vijaykrishna, L Duan, J Bahl, J X Zhang, R G Webster, J S Peiris, H Chen, G J Smith and Y Guan (2008) Identification of the progenitors of Indonesian and Vietnamese avian influenza A (H5N1) viruses fromsouthern China J.Virol Vol 82 pp 3405–3414 50 Xu K., L Ferreri, A Rimondi, V Olivera, M Romano, H Ferreyra, V Ragod, M Uhartd, H Chena, T Suttona, A Peredab and D R Perez (2012) Isolation and characterisation of an H9N2 influenza virus isolated in Argentina Virus Research lu Vol 168 (1-2) pp 41-47 an 51 Yu H., R H Hua, T C Wei, Y J Zhou, Z J Tian, G X Li, T O Liu and G Z va n Tong (2008) Isolation and genetic characterisation of avian origin H9N2 influenza 52 Yuan J., L Xu, L Bao, Y Yao, W Deng, F Li, Q Lv, S Gu, Q Wei and C Qin gh tn to viruses from pigs in China Veterinary Microbiology Vol 131 pp 82-92 p ie (2015) Characterization of an H9N2 avian influenza virus from a Fringilla montifringilla brambling in w 10.1016/j.virol.2014.12.021 northern Virology China 10.1016/j.virol.2014.12.021: Vol 476 pp 289-97 từ oa nl http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25569456 d 53 Yun Zhu, Shixiong Hu, Tian Bai, Lei Yang and Xiang Zhao (2014) Phylogenetic an lu and antigenic characterization of reassortant H9N2 avian influenza viruses isolated ul nf Vol pp 1-11 va from wild waterfowl in the East Dongting lake wetland in 2011-2012 Virology oi lm 54 Zhang Y., Y Yin, Y Bi, S Wanga, S Xu, J Wanga, S Zhou, T Sun and K J Yoon (2012) Molecular and antigenic characterisation of H9N2 avian influenza z at nh virus isolates from chicken flocks between 1998 and 2007 in China Veterinary Microbiology Vol 156 (3-4) pp 285-293 z 55 Zhao Z., K Shortridge, M Garcia, Y Guan and X Wan (2008) Genotypic gm @ diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses J Gen Virol Vol 89 (9) pp 2182-2193 l 56 Zhou J., J Fu, D Fang, H Yan, J Tian, J Zhou, J Tao, Y Liang and L Jiang m co (2007) Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 an Lu influenza virus isolated from a human in Guangdong, China Arch Virol Vol 152 ((8)) pp 1515-1521 n va ac th 60 si 57 Zhu Q., H Yang, W Chen, W Cao, G Zhong, P Jiao, G Deng, K Yu, C Yang, Z Bu, Y Kawaoka and H Chen (2008) A naturally occurring deletion in its NS gene contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens J Virol Vol 82 (1) pp 220-228 58 Vol lu an n va p ie gh tn to d oa nl w oi lm ul nf va an lu z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 61 si